SN∕T 4784-2017 出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法 实时RT-PCR方法

出口食品中诺如病毒和甲肝病毒I本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共1GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求在实时荧光RT-PCR过程中通过添加与目的检测RNA相似或相同的、已知含量的外源对照2RNA,用于检测RNA逆转录过程中有无抑制剂成分。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。NV:诺如病毒(Norovirus)HAV:甲肝病毒(HepatitisAvirus)RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)PC:过程质控(processcontrol)ECRNA:外源质控RNA(externalcontrolRNA)所有实验用试剂均为分析纯：除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。4.1果胶酶，来源于黑曲霉(Aspergillusniger)(20U/mg)。4.2蛋白酶K(20mg/mL)。4.3TGBE缓冲液见A.1。4.4PEG缓冲液见A.2。4.5PBS缓冲液见A.3。4.6盐酸溶液见A.4。4.8硫氰酸胍裂解缓冲液见A.6。4.9氯仿。4.10正丁醇。4.11磁珠法RNA提取试剂盒。4.12下列物质均购自于ATCC:c)MS2噬菌体(ATCC15597B1);d)宿主细菌E.coli(ATCC15597)。4.13引物和探针：根据表1的序列进行引物和探针的合成，加入无RNase超纯水配制成10μmol/L浓度。引物扩增区域参见附录B。表1实时荧光RT-PCR检测的引物和探针引物和探针序列(方向5'-3')大小参考毒株基因反向引物NV1LCR:CCTTAGACGCCATCAT探针NVGG1P:FAM-TGGACAGGAGAYCGCR正向引物QNIF2:ATGTTCAGRTGGATGAGR反向引物COG2R:TCGACGCCATCTT探针QNIFS:FAM-AGCACRTGGGAGGGCGA3表1(续)引物和探针序列(方向5'-3'大小参考毒株基因反向引物HAV240:GGAGAGCCCTGGAAG探针HAV150(-):FAM-CCTGAACCTGCAGGAAT反向引物Mengo209(REV):GAAGTAACATATAGACAGA探针Mengo147(PROBE):FAM-ATCACATTACT正向引物MS2-TM2-F:GGCTGCTCGCGGA反向引物MS2-TM2-R:TGAGGGAATGTGGGAACC探针MS2-TM2:JOE-ACCTCGGGTTT5仪器与耗材5.1实时荧光PCR仪。5.2冷冻离心机。5.3振荡摇床。5.4恒温振荡水浴摇床。5.6超滤管。5.750mL离心管。5.80.45μm的正离子滤膜。6实验室环境与操作要求19489的要求，操作技术规范应符合19489的要求，操作技术规范应符合GB/T19495.2的要求。7检测方法7.1质控物质的选取7.1.1PC物质PC物质可以选择Mengo病毒或者MS2噬菌体，检测实验室根据自身条件选择其一，两种PC物质制备方法参见附录C。ECRNA为已知核酸浓度且含有NVGI、NVGⅡ、HAV目的检测片段的RNA。47.2.2.3加入0.25体积的5×PEG/NaCl溶液，振7.2.3.5用0.1mol/L盐酸溶液调节洗脱液至pH7.0,收集洗脱液并转移至超滤管，4000g离心5实时RT-PCR反应体系为一步法RT-PCR反应混液12.5pL,108.1.1当Ct(样品RNA原液+ECRNA)-Ct(H₂O+ECRNA)<2.00,表明实时RT-PCR扩增效果8.1.2当Ct(样品RNA原液+ECRNA)-Ct(H₂O+ECRNA)>2.00,表明样品中有实时RT-PCR抑8.1.3当Ct(样品10-¹RNA原液+ECRNA)-Ct(H₂O+ECRNA)<2.00,表明实时RT-PCR扩增效8.1.4当Ct(样品10-¹RNA原液+ECRNA)-Ct(H₂O+ECRNA)>2.00,该结果表明样品中有实时68.1.5但当ECRNA扩增效率不满意，样品RNA检测结果却呈现明显的阳性，可根据具体情况另行PC物质回收率，回收率=病毒回收含量/添加病毒含量×稀释倍数×100%,当PC物质的回收率大于1%时，表明该次检测有效。在计算PC物质回收含量时，应考虑取样的体积及样品孔是否为10倍稀释预期范围即视为本次检测无效，应重新进行检测操作，该检测方法原则上最低可检测出10个拷贝的8.3.3对于每一份样品检测应充分考虑荧光本底对扩增曲线和Ct值的影响。b)待检测样品的NVGⅡCt值小于或等于40时，且扩增曲线呈现良好的“S”型，结果判定为d)待测样品NVGⅡ无明显“S”型扩增曲线，结果判定为NVe)待测样品NVGICt值大于40而小于45,有但不是明显“S”型护增曲线，且荧光信号值低，结果判定NVGI为阴性；f)待测样品NVGⅡCt值大于40而小于45,有但不是明显“S”型扩增曲线，且荧光信号值低，结果判定NVGⅡ为阴性；g)待测样品NVGI、GⅡ中有一个为阳性则可判定为NV检测阳性，两者均为阴性时方可判定为NV阴性。a)待检测样品的HAVCt值小于或等于40时，且扩增曲线呈现良好的“S”型，结果判定为HAV判定为HAV阴性。7溶液的配制加双蒸水至1000mL,121℃,15min灭菌备用。加双蒸水至1000mL,调节pH至7.3士8TCACCGCCGTTTGCCTAGGCTATAGGCTAAATTTCCCTTTCCCTTTTGTTTTGCTTGTAAATATTAATTCCTGCAGGTTCAGGGTTCTATAAGAACACTCAATTTTCACGCTTTCTGTCTTCTTTCTTCGI:CGCTGGATGCGCTTCCATGACCTCGGATTGTGGACAGGAGGⅡ:ATGTTCAGGTGGATGAGATTCTCTGACCTCAGCACATGGGAGGGCGATCGCAATCTTGCTCCCGAAGGTGTGAATGATTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTCTGTCGGCTGCTCGCGGATACCCGTACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGAGTTCTTCAGCGAAAAGCACGACAGTGGTCGCTACATAGCGTGGTTCCATAAATCACCGACAGCATGAATTCCGCCGGCGTGCGCGTTATACGCACTTCG9C.1.3培养液：DMEM(高糖)培养基+10%胎牛血清+1%抗生素。C.2.2.2.1将培养的宿主菌E.coli培养液按照5:1的比例加入MS2噬菌体原液(大约10⁸PFU/mL~的效价范围应大约10⁸PFU/mL～10⁹PFU/mL),效价(PFU/mL)=平