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文档简介

T淋巴细胞增殖试验1试剂

1.1RPMI1640培养液（含10%胎牛血清）取RPMI1640培养基干粉10.4g（规格为1L），加入1000ml超纯水溶解，再加入2.1g碳酸氢钠，4.77g羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），溶解后混匀，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。量取经过56℃、30分钟灭活的胎牛血清10ml，加入RPMI1640培养液90ml，4℃保存。

1.2Hank's液：取氯化钠80g、磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）0.6g、氯化钾4.0g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）2.0g、葡萄糖10g、无水氯化钙1.4g，加水至1000ml为原液。配制时取原液100ml，加水896ml，加0.5%酚红4ml，混匀，经121℃、15分钟高压灭菌，4℃保存。临用前，加无菌7%碳酸氢钠溶液调pH7.2。

1.3磷酸盐缓冲液（PBS）:称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、0.24g磷酸二氢钾，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌。

1.4噻唑蓝（MTT）溶液：称取0.5gMTT溶于100ml磷酸盐缓冲液（PBS），使浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。

1.5红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

1.6pH调节混合液：量取盐酸1ml、冰醋酸9.6ml加水13.4ml。

1.7甲瓒（Formazan）裂解液（SDS-DMF）：量取二甲基甲酰胺（DMF）100ml，加水100ml配制成50%DMF（V/V）溶液，称取30g十二烷基硫酸钠（SDS）溶于200ml的50%DMF液，磁力搅拌，加pH调节混合液调pH为4.7。2脾淋巴细胞悬液制备

无菌条件下剖开小鼠（C57BL或纯系昆明小鼠，体重18-22g，雌雄不限。）腹腔取脾，研磨过100目筛网，Hank's液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min离心5分钟，弃上清；加红细胞裂解液10ml，混匀脾细胞，静止4-5分钟，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5分钟，弃上清去除红细胞，Hank's液洗2-3遍，用RPMI1640培养液重悬细胞，计数调整细胞浓度为8-10×106个/ml。3测定法

96孔板上用RPMI1640培养液稀释供试品（设1∶1、1∶2、1∶4三个稀释度），每孔100μl，以生产用培养基为对照组，设3复孔，向各孔中分别加入100μl脾淋巴细胞悬液，37℃、5%CO2培养。72小时后，取培养板每孔加MTT液20μl，继续培养4小时，2500r/min离心10分钟，弃上清培养液，每孔加甲瓒裂解液100μl，待甲瓒沉淀溶解，在测定波长

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