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T淋巴细胞增殖试验1试剂
1.1RPMI1640培养液(含10%胎牛血清)取RPMI1640培养基干粉10.4g(规格为1L),加入1000ml超纯水溶解,再加入2.1g碳酸氢钠,4.77g羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),溶解后混匀,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。量取经过56℃、30分钟灭活的胎牛血清10ml,加入RPMI1640培养液90ml,4℃保存。
1.2Hank's液:取氯化钠80g、磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)0.6g、氯化钾4.0g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.0g、葡萄糖10g、无水氯化钙1.4g,加水至1000ml为原液。配制时取原液100ml,加水896ml,加0.5%酚红4ml,混匀,经121℃、15分钟高压灭菌,4℃保存。临用前,加无菌7%碳酸氢钠溶液调pH7.2。
1.3磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、0.24g磷酸二氢钾,加水溶解并定容至1000ml,经121℃、15分钟高压灭菌。
1.4噻唑蓝(MTT)溶液:称取0.5gMTT溶于100ml磷酸盐缓冲液(PBS),使浓度为5mg/ml,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃避光保存。
1.5红细胞裂解液(Tris-NH4Cl):称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
1.6pH调节混合液:量取盐酸1ml、冰醋酸9.6ml加水13.4ml。
1.7甲瓒(Formazan)裂解液(SDS-DMF):量取二甲基甲酰胺(DMF)100ml,加水100ml配制成50%DMF(V/V)溶液,称取30g十二烷基硫酸钠(SDS)溶于200ml的50%DMF液,磁力搅拌,加pH调节混合液调pH为4.7。2脾淋巴细胞悬液制备
无菌条件下剖开小鼠(C57BL或纯系昆明小鼠,体重18-22g,雌雄不限。)腹腔取脾,研磨过100目筛网,Hank's液冲洗,收集分离的脾细胞悬液,1000r/min离心5分钟,弃上清;加红细胞裂解液10ml,混匀脾细胞,静止4-5分钟,待红细胞完全破碎,1000r/min离心5分钟,弃上清去除红细胞,Hank's液洗2-3遍,用RPMI1640培养液重悬细胞,计数调整细胞浓度为8-10×106个/ml。3测定法
96孔板上用RPMI1640培养液稀释供试品(设1∶1、1∶2、1∶4三个稀释度),每孔100μl,以生产用培养基为对照组,设3复孔,向各孔中分别加入100μl脾淋巴细胞悬液,37℃、5%CO2培养。72小时后,取培养板每孔加MTT液20μl,继续培养4小时,2500r/min离心10分钟,弃上清培养液,每孔加甲瓒裂解液100μl,待甲瓒沉淀溶解,在测定波长
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