饲料中玉米赤霉烯酮的测定 编制说明

《饲料中玉米赤霉烯酮的测定》编制说明（公开征求意见稿）一、工作简况 （一）任务来源 （二）标准修订背景 （三）工作过程 3二、国家标准编制原则和主要技术内容确定的依据 6（一）标准编制原则 6（二）标准主要技术内容的确定 71标准修订的目的和方法研制中必用的基础信息 72液相色谱-串联质谱法的建立 82.1质谱条件的确定 2.2液相色谱条件的确定 2.3氮吹温度的考察与确认 152.4样品提取与净化条件的确定 152.5标准溶液的稳定性 2.6基质效应评价 2.7方法性能考察 203免疫亲和柱净化-高效液相色谱法的验证 323.1样品的提取与净化 323.2液相色谱参考条件 323.3标准曲线线性范围 323.4检出限和定量限 333.5准确度和精密度 354本标准方法适用性考察 36三、标准复核验证情况，技术经济论证，预期经济效果 38四、与国际、国外同类标准技术内容的对比情况 38五、采标情况，以及是否合规引用或采用国际国外标准 39六、与有关法律、法规的关系 39七、重大分歧意见的处理经过和依据 40八、涉及专利的有关说明 40九、贯彻国家标准的要求，以及组织措施、技术措施、过渡期和实施日期的建议等措施建议.40十、其他应予说明的事项 40参考文献 411一、工作简况根据下达的2023年饲料工业国家标准复审修订计划项目，本标准修订项目的编号为20233890-T-469，项目名称为《饲定》，项目承担单位为上海市农业科学院和上海市兽药饲料检测所，本标（二）标准修订背景饲料是人类的间接食品，饲料质量的好坏以及是否安全，直接影响了畜禽的正常发育和健康成长，以及生态环境的可持续发展和人类健康。当前饲料安全及畜产品安全问题已经引起全社会的关注。而饲料中存在的真菌毒素是饲料安全的最大隐患之一。玉米赤霉烯酮是一种重要真菌毒素，主要污染玉米、小麦等饲料原料及产品，其具有类雌激素作用，主要作用引起动物繁殖机能异常甚至死亡。目前我国已在国家标准GB13078-2017《饲料卫生标准》中规定了饲料中玉米赤霉烯酮的限量标准，系统制定饲料中玉米赤霉烯酮的国标检测方法，为饲料中玉米赤霉烯酮的用了液相色谱串联质谱法精确测定玉米赤霉烯酮。而目前国标方法GB/T2料，缺乏部分饲料原料以及精料补充料。因此需要进一步制定完善液相色谱串联质谱法检测玉米赤霉烯酮的国家标准。国外，有关饲料中玉米赤霉烯酮的测定方法标准详见表2。国际标准方面，其中ISO的两个标准分别为提高饲料中玉米赤霉烯酮检测效率，满足我国饲料行业及企业的检测需要，亟需对现行国家标准《饲料中玉米赤霉烯酮的测定》（GB/T薄层色谱法和酶联免疫吸附法，以此修订形成新的国家标准，进一步规范饲料中玉米赤霉烯酮的测定方法标准，提升检测效率，为饲料原料的开发123NY/T2071-201134567法8912法3456781成立标准编制工作组42标准修订进展资料，同时调研国内主要饲料质检机构、饲料生产企业等标准方法的采用有关专家、主要起草人员召开标准修订项目启动会，确定标准修订的主要 高效液相色谱法，针对饲料中玉米赤霉烯酮的液质方法和仪器条件进行优化、并对所建立方法的线性、灵敏度、回收率和精密度等进行验证，建立了不同饲料基质中玉米赤霉烯酮的精准检测技术，并应用于实际样品的检意见稿，发省部级饲料质检机构、大中型饲料企业实验室、全国饲料工业条。同时邀请农业农村部食品质量监督检验测试中心（上海）、上海海关6动植物与食品检验检疫技术中心、江苏省畜产品质量检验测试中心三家单化工作组组织专家对上海市农业科学院和上海市兽药饲料检测所起草的国家标准《饲料中玉米赤霉烯酮的测定》（预审稿）进行了认真审查。专家组由杨曙明、曲志娜、张丽英、樊霞、李云、吴银良、吴宁鹏和张凤枰组与会专家一致同意标准起草单位按照上述意见修改形成公开征求意见二、国家标准编制原则和主要技术内容确定的依据（一）标准编制原则按照GB/T20000.2－2009《标准化工作指南第2部分采用国际标准》的规定和要求编写标准全文。查阅了国内外相关标准，结合现行标准实施情况，以保证标准的先进性和衔接性。建立的饲料中玉米赤霉烯酮的（二）标准主要技术内容的确定1标准修订的目的和方法研制中必用的基础信息本次修订拟结合国内外玉米赤霉烯酮检测技术发展趋势和我国饲料行业发展现状，开发应用水平高、稳定性和重复性好的技术及方法，保证检测数据准确、可靠，并提高检测效率，全力满足我国饲料中玉米赤霉烯酮的检测需要。删除GB/T19540-2收集查阅到的国内外关于玉米赤霉烯酮检测相关的文献，开发建立液相色谱串联质谱检测方法，开展多种饲料基质的方法学研究，考察方法的适用性和实际样品测定的可操作性。本标准同时对GB/T28716-2012中的免疫玉米赤霉烯酮的化学结构、理化特性是在方法研究建立中必须考虑和应用的基础信息，其基本信息、化学结构和理化性质见图2和表4。8C18H22O5试样的制备均按GB/T14699-2023抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩2液相色谱-串联质谱法的建立质谱仪中进行一级质谱全扫描（图3），在电离过程中发现产生了一个明质谱氩气，进行二级扫描，比较其提取离子色谱图的响应和峰型（图4进行多次二级扫描考察稳定性，此两个子离子的信号强度依旧较高，因此选择[M-H]﹣m/z317.2>131.1作为玉米赤霉烯酮的定性离子对，[M-H]﹣m/z比，发现定量离子对的选择基本一致，定性离子对的选择与欧盟标准EN168772016相一致。依次优化气流速、辅助气、吹扫气、离子传输温度和雾化器温度，然后优化碰撞电压，当碰撞能达到24eV时，定量离子对）；），174.99131.01131.01187.00159.93146.99161.03112.96129.92173.89107.01103.00162.9895.00203.06213.06143.00135.04157.03149.00158.96187.99180.91189.01119.04219100110120130140150160170180190200210220最终确定质谱仪器的方法参数如下：电离方式为电喷雾电离，负离子*用于定量测定玉米赤霉烯酮极性较弱，根据其结构性质以及饲料复杂的基质情况，在方法研究过程中，试验比较了WatersACQUITYUPLCBEHC18(100霉烯酮标准溶液（图7）。结果表明，三种色谱柱的峰型和分离度均较好，目标物色谱峰附近无杂质干扰，进一步考察色谱峰面积（表6），发现使赤霉烯酮响应最低（峰面积值为125451使用WatersACQUITYUPLCBEHC18(100mm×3mm，2.5μm)色谱柱时玉米赤霉烯酮的响应有所提高（峰面积值为201254使用WatersACQU烯酮的色谱峰型最为尖锐，响应最高（峰面积值为211479因此选择HSS（高强度二氧化硅）颗粒技术，能提供出色能耐受100%水相，且耐受压力高达18000psi，它还能提高保留率，因此可作为开发极性和非极性化合物分离方法的理想化效率，从而影响灵敏度。本实验分别考察了乙腈-水、乙腈-5mmol/L乙相比于乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液体系，0458根据玉米赤霉烯酮的理化性质，其具有一种酚的二羟基苯酸的内酯结氯仿、二氯甲烷等溶剂。结合相关文献与其余相关标准中真菌毒素的提取方法，本试验主要考察的提取试剂为甲醇、乙腈以及不同比例的乙腈水混向其添加标准溶液使最终加标浓度为50μg/kg，用5种提取溶液分别进行提取操作，平行试验三次，过滤膜上机测试，计算回收率，所得结果如下浓度为50μg/kg，分别使用震荡、超声和混匀三种提取方式进行提取，平时回收率最高，提取时间达到60分钟时回收率反而下降，因此选择超声饲料基质比较复杂，需要进一步净化，其最主要的杂质是油脂、蛋白质等，考虑到玉米赤霉烯酮的理化性质，结合文献资料，主要考察了固相度为50μg/kg，分别使用不同的净化小柱对空白饲料加标样品进行净化，），与真菌毒素分子具有高度亲和性和专一性的特点，实现待测样品净化和富集的净化材料，其具有高特异性，相比传统的固相萃取小柱和多功能净化柱，使用免疫亲和柱净化可以获得更为纯净的样品提取物，结合高效液相色谱串联质谱可以获得准确的定量检测结果，因此本试验选择免疫亲和柱UptentC18UptentPSA飞测IAC柱本标准制修订小组所在团队在接到制修订任务前已经开始对玉米赤霉每次试验时，分别精确吸取玉米赤霉烯酮标准储备溶液适量，逐级稀释配次，峰面积的相对标准偏差（RSD）小于5%。试验结果表明，标准储备（0天）（2月）（3月）（6月）（9月）RSD/%平均峰3948263953824091534077214175594211264230124016372.5本标准制修订小组所在团队在接到制修订任务前已经开始对玉米赤霉烯酮标准中间溶液（10μg/mL）的稳定性进行了长期考察。根据确定的色谱质谱条件，取配制好的玉米赤霉烯酮标准中间溶液（10μg/mL），分别标准偏差（RSD）小于5%。试验结果表明，标准中间溶液在－18℃下保（0天）（2月）（3月）（6月）RSD/%平均峰面积2031692117441995271945121975942117443.2本标准方法学考察涉及小麦、玉米、仔猪配合饲料、育肥羊精料补充料、猪浓缩饲料共五种代表性饲料原料及饲料基质。基质效应会影响高效液相色谱串联质谱的分析结果，出现信号抑制或者信号增强，采用初始流20动相和空白样品基质液分别稀释标准中间溶液，配制成标准系列溶液。基质效应通过基质标准曲线的斜率和溶剂标准曲线的斜率的比值（百分比）围为51.2%-76.0%，为保证结果的准确性，采用基质匹配校准曲线消除基取基质空白试样，经提取净化得到空白基质溶液，取标准中间溶液适质谱仪测定，以定量离子色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。各种基质匹配标准曲线方程、线性范围及相关系21ResponseResponseResponseResponseResponseResponse22ResponseResponseCompoundname:ZENCorrelationcoefficient:r=0.999321,r^2=0.998642Calibrationcurve:636.215*x+988.097Responsetype:ExternalStd,AreaCurvetype:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axistrans:None0000000000三5000025000500002500075000-0Conc-01020304050607080901001101201301401501601701801902002.7.2检出限和定量限饲料基质复杂，因此本试验选择小麦、玉米、仔猪配合饲料、育肥羊精料补充料和猪浓缩饲料共五种饲料作为考察对象。在上述空白饲料中添加一定浓度的玉米赤霉烯酮，按照本标准进行试验。以当色谱峰的信噪比2324），），），25），），），本方法采用液相色谱-串联质谱法考察了玉米赤霉烯酮在小麦、玉米、玉米DDGS、喷浆玉米皮、玉米浆干粉、仔猪配合饲料、育肥羊精料补充及GB/T23182-2008《饲料中兽药及其他化学物检测试验规程》等标准，考虑本试验添加回收水平需包括定量限及规定限量，确定了玉米基质的添26行试验考察批内精密度，进行5个不同批次的试验考察批间精密度，发现内精密度在1.4%~9.4%之间，批间精密度在2.9%~9.5%之间，具体结果见27(μg/kg)测定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ28(μg/kg)测定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ29(μg/kg)测定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ30(μg/kg)测定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ31(μg/kg)回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ323免疫亲和柱净化-高效液相色谱法的验证提取剂，于振荡器上振荡60min，或于高速均质器均质2min后，用定量滤纸过滤，准确移取10.0mL滤液并加入40.0mLPBS溶液稀释，用玻璃慢通过免疫亲和柱，抽干。分别以10.0mL纯水淋洗柱子两次（对颜色较），3334 0.002.004.006.00分钟0.800.60 0.400.200.00 -0.200.002.004.006.008.0010.0012.00分钟35 4.00 2.00 0.002.004.006.00分钟高效液相色谱法用于检测饲料中的玉米赤霉烯酮，考察方法准确度和综上所述，通过对标准曲线的验证以及在玉米、玉米DDGS、喷浆玉米皮、玉米浆干粉、羊精料补充料和猪配合饲料中添加回收率、准确度和精密度的验证，证明了高效液相色谱法能继续适用于饲料中玉米赤霉烯酮36浓度 率RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ4本标准方法适用性考察对本标准中两种测试方法以及NY/T2071-2011标准方法进行了方法适37用性考察并对结果进行了对比分析，选择了包含饲料原料、配合饲料、浓），/MS法NY/T1/2/3/456/789///38三、标准复核验证情况，技术经济论证，预期经济效果海）、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、江苏省畜产品质量检验测试中心共三家有资质的检测机构对该标准进行复核验证，不同实验室间国标修订版修改完善了饲料中玉米赤霉烯酮的测定方法，删除了薄层串联质谱法，为定量和定性提供了依据。经试验验证，采用《饲料中玉米赤霉烯酮的测定》规定的方法测定饲料中玉米赤霉烯酮，方法重复性好，精密度符合标准要求，能满足饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充玉米赤霉烯酮是饲料质量控制的重要指标。修订其测定的国家标准方法，对于规范饲料原料生产、提高产品质量和安全水平、加强饲料质量安全监管具有重要意义，保障了我国畜产品质量安全，有助于推动畜牧产业和畜牧业经济快速健康发展。本标准作为饲料质量安全基础性标准，建议四、与国际、国外同类标准技术内容的对比情况17194:2019进行比较，选取空白玉米粉和猪配合饲料样品加标（20μg/kg和100μg/kg）进行回收率考察，结果见下表25，本39方法定量限（10μg/kg）低于欧盟标准EN17194:20），五、采标情况，以及是否合规引用或采用国际国外标准六、与有关法律、法规的关系格执行强制性国家标准和行业标准。与相关的各种基础标准相衔接，遵循了政策性和协调同一性的原则。本文件制定过程中参考了GB13078-2017《饲料卫生标准》中玉米赤霉烯酮在各类饲料原料及饲料产品40七、重大分歧意见的处理经过和依据八、涉及专利的有关说明九、贯彻国家标准的要求，以及组织措施、技术措施、过渡期和实施日期的建议等措施建议饲料工业标准化技术委员会组织标准起草单位通过标准培训、会议宣贯、十、其他应予说明的事项41参考文献[7]DB42/T808-2012中华人民共和国湖北省地方标准《饲料中黄曲霉毒素B1、玉[8]DB37/T4045.2-2020中华人民共和国山[10]谢瑜杰,陈辉,胡雪艳,等.QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱[11]李洪波,宋志超,陈蔷,等.[12]宋月,杨丽君,吴平谷,等.复合柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定粮油中42[15]