农业部2406号公告-7-2016 转基因动物及其产品成分检测 DNA提取和纯化

农业部2406号公告一7—2016转基因动物及其产品成分检测DNA提取和纯化2016-05-23发布2016-10-01实施中华人民共和国农业部发布I农业部2406号公告—7—20161化的DNA。4.3乙醇(C₂H₅OH),体积分数为95%。4.4二水乙二铵四乙酸二钠盐(Na₂E4.6盐酸(HCl),体积分数为37%。4.8蛋白酶K(>20U/mg)。4.10氯化钠(NaCl)。4.11氢氧化钠(NaOH)。4.15甲醛(HCHO),体积分数为35%～40%。2农业部2406号公告一7—2016pH至8.0,加水定容至100mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。4.191mol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用盐酸(HCl)调pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌204.205mol/L氯化钠溶液：称取29.22g氯化钠(NaCl)溶于80mL水中，加水定容至100mL。在103.4kPa蒸汽压(121℃)条件下灭菌20min。4.213mol/L乙酸钾溶液(pH4.8):称取29.43g乙酸钾(KAc)溶于60mL水，用冰乙酸(HAc)调pH至4.8,加水定容至100mL。在103.4kPa蒸汽压(121℃)条件下灭菌20min。4.22DNA提取细胞裂解液：在约700mL水中，依次加入10mL乙二铵四乙酸二钠溶液(4.18),20mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(4.19),80mL氯化钠溶液(4.20)。另称取10g十二烷基硫酸钠(C₂H₂₅O₄SNa,SDS),混合后加热至完全溶解后冷却至室温，用水定容至1000mL,室温保存备用。解后，加水定容至10mL。于-20℃保存备用。4.24Tris-饱和酚4.25氯仿/异戊醇(24:1)将氯仿和异成醇按照24:的比例配制。4.26TE缓冲液(pH8.):在约800ml水中，依次加入10m4羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(4.19)和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液(4.18)用盐酸(HCl加水定容至1000mL。在4kPa(121℃)条件下灭菌20min。4.27磷酸缓冲液(PBs:分别称取NacL8.og.KC0.2g(Na₂HIPO-1.44g、KH₂PO0.24g,将各种物质溶解于200mL灭菌蒸馏水中，用盐酸溶液调pH至7.4,加灭菌蒸馏水定容体积至1L,室温保存备用。4.28体细胞固定液量取35%≈40%甲醛9.4mL,加水定容至100mL,室温保存备用。4.29乳化剂：量取20mi90%的聚乙二醇辛基苯基酸(Tion-x100),125mi5主要仪器和设备5.1分析天平：感量0.ng5.2高速冷冻离心机5.3高速台式离心机。5.4紫外分光光度计。5.5磁力搅拌器。5.6高压灭菌锅。5.7恒温水浴摇床。5.8凝胶成像系统或照相系统。6操作步骤6.1.1血液样品：取5mL,-6.1.2固态样品：加工产品称取5g备用，新鲜组织样称取5g冷冻保存备用。6.1.3鲜乳样品：每个鲜乳样品采集800mL以上。6.2试样的预处理3农业部2406号公告一7—20166.2.2液态试样：血液样品可直接用于DNA的提取。细胞培养物按照A.1进行离心处理。鲜乳等液态加工品可取50mL以上试样(根据不同试样和不同检测要求，可以适当增加试样量),按照A.2进行固态试样及液态试样经预处理并充分混匀后，取2份相同的测试样进行DNA提取和纯化。每份4A.1.3.5加