鹦鹉热衣原体Mip-基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备时间：2017-6-14关于问题的研究选题背景及意义目的基因的获取及扩增目的基因的克隆及鉴定目的蛋白的诱导表达及纯化12341选题背景及意义选题背景及意义

鹦鹉热衣原体(Cps)是一种专性细胞内寄生，有独特生活周期的原核细胞型微生物，也是一种重要的人畜共患病病原体，具有广泛的感染谱。人主要通过吸入有感染性的分泌物而发生感染，感染后可引起非典型性肺炎和败血症等疾病。目前为止，Cps的确切致病机制不清楚，也无有效疫苗上市，开发有效的疫苗是预防Cps感染最根本的措施。选题背景及意义

巨噬细胞感染增强蛋白(Mip)是衣原体含量最丰富的脂蛋白，在衣原体各种属间都存在且高度保守。相关研究表明：Mip可刺激THP1细胞产生一系列炎症因子，参与衣原体对宿主细胞的侵袭及炎症反应。Mip可诱导小鼠产生以Th1型为主的细胞免疫反应，且抗感染实验表明免疫后的小鼠能抵御生殖道衣原体感染及再感染等。由此可见，衣原体Mip蛋白是一种较理想的疫苗候选抗原。

本实验拟克隆CpsMip基因，构建原核表达载体，

诱导表达及纯化可溶性蛋白，并制备多克隆抗体。2目的基因的获取及扩增获取目的基因（CpsMip基因）分离mRNA合成cDNA双链制备载体将重组体导入受体细胞鉴定cDNA文库

分离和鉴定目的cDNA克隆提取总RNA

连接cDNA与载体图1cDNA文库法获取目的基因导入酵母细胞构建重组质粒分离目的基因培养合适酵母重组酵母的方法此实验采用重组酵母的方法原因如下：酵母对培养基的要求低，价廉易得酵母细胞生长快，生长率高酵母系统容易放大扩增目的基因（PCR原理）

CpsMip基因上游引物设计上游引物:5'-CGCGGATCCATGAAAAAACAATGGTATT-3'

下划线为BamHI酶切位点

CpsMip基因下游引物设计下游引物:3'-CCGCTCGAGTCATGAAGCTGTGTTTTT-5'

下划线为XhoI酶切位点PCR反应体系10×缓冲液10μL4种dNTP混合物各200μmol/L引物1、2各10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5U总体积：加水至100μLCpsMip基因的PCR扩增预期结果

CpsMip基因经PCR扩增后，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，预期目的基因大小如下图：目的条带预测位置图2：CpsMip基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳3目的基因的克隆及鉴定1.电泳缓冲液配制2.融胶3.倒胶4.加样5.电泳(先低电压低电流产生细条带，便于切胶，再高电压快速分离)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳回收6.观察7.切胶8.融胶9.结合（吸附柱）10.洗涤11.洗脱感受态细胞的制备（CaCl2法）（1）在无菌环境中，挑取冻存于-70℃冰箱的菌种E.coliBL21划线接

种于不含任何抗生素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养12~16h左右;（2）从平板中挑取单个菌落，接种5mLLB液体培养基中，37℃、200rpm，

过夜振荡培养;（3）次日在无菌环境下吸取1mL菌液加入到50mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养，至菌液的OD600值在

0.3~0.5之间;感受态细胞的制备（CaCl2法）（4）无菌条件下，将菌液转移到冰预冷过的无菌离心管中，冰浴15min，使培养物冷却至0℃;

（5）4℃、4000rpm离心10min轻轻倒掉上清，回收沉淀，加入10mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬沉淀，冰浴10min(务必放冰上);

（6）4℃、4000rpm离心10min，收集沉淀，用2mL冰预冷0.1mol/LCaCl2溶液重悬菌体;

（7）分装重悬好的感受态细胞，每管100µ

L，-70℃冰箱保存待用。将CpsMip基因连接到T载体上重组质粒的转化将重组质粒转化至E.coliBL21感受态细胞中，用含卡那霉素的LB固态培养基培养过夜。用质粒DNA小量抽提试剂盒制备质粒DNA1、菌液培养：挑去单克隆菌落接种到5μL含卡那霉素的液体培养基中，37℃培养12h；2、收集菌体：将菌液转移到1.5mL离心管中，10000r/min，

1min,将培养液彻底吸掉；3、离心管中加250μL预冷的SolutionI；4、加入250

μLSolutionII上下翻转4-6次，呈蛋清状；5、加入350

μLSolutionIII上下翻转8-10次，室温放置2-5min，12000r/min，5min；用质粒DNA小量抽提试剂盒制备质粒DNA6、将上清液转入吸附柱中，6000r/min，1min弃去废液；7、加入500μLW1Solution12000r/min，1min弃去废液；8、加入500μLWashSolution12000r/min，1min弃去废液；9、将8重复一次；10、12000r/min，1min空转一次；11、开盖挥发乙醇；12、超纯水分两次洗下DNA。质粒的双酶切将鉴定后的阳性重组质粒用

BamHI/XhoI进行双酶切。ddH2O36μL10×MBuffer8μLBSA8μL

BamHI4μL

XhoI4μL质粒20μL37℃水浴5h重组质粒的双酶切鉴定预期结果

重组质粒经BamHI和XhoI双酶切后，1.5%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，预期目的基因大小如下图：目的条带预测位置图3：重组质粒双酶切鉴定按特殊设计构建的，能使克隆于特定位点的外源基因在宿主细胞中正常转录并翻译成相应蛋白质的载体。组件主要包括：启动子及操纵位点序列、多克隆位点、转录及翻译信号、复制起始区、抗生素抗性基因等。外源基因按正确读码方向克隆于启动子下游的多克隆位点上，使外源基因获得转录及翻译。表达载体表达载体Ⅰ型：转录起始区(调控序列＋启动子)＋终止子Ⅱ型：转录起始区＋翻译起始区(核糖体结合序列和起始密码子)＋终止子Ⅲ型：转录起始区＋翻译起始区＋信号肽链编码区＋终止子(分泌型)ⅠⅡⅢⅤⅣ转录起始翻译起始信号肽成熟蛋白转录终止区ATGTAAⅠⅤ插入位点Ⅰ型ⅠⅡⅤ插入位点Ⅱ型ⅠⅡⅢⅤ插入位点Ⅲ型ATG常用的质粒载体常见质粒特性及复制子类型质粒复制子类型拷贝数用途pBR322pMB115～20早期克隆载体pUC系列pMB1(改良)500～700常规克隆载体pET系列pMB115～20常规表达载体(T7)pGEM系列pMB1(改良)300～700克隆与表达载体(T7)pSP系列pMB(改良)300～700克隆与表达载体(T7)原核表达载体的选择BamHIXhoI原核表达载体的选择原核表达载体的构建

纯化的CpsMipPCR扩增产物和pET-28a(+)质粒经BamHI和XhoI双酶切后，用T4连接酶连接，构建原核表达载体pET-28a(+)-CpsMip。重组质粒的转化将重组质粒转化至E.coliBL21感受态细胞中，用含卡那霉素的LB固态培养基培养过夜。阳性重组子的筛选挑取初筛阳性PCR单个菌落，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，提取质粒做双酶切鉴定，并送往生物公司测序。4目的蛋白的诱导表达及纯化CpsMip蛋白的诱导表达挑取经测序鉴定的阳性菌接种到含卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃过夜培养。第2d以体积比1:100接种于含卡那霉素的LB液体培养基，37℃振摇至OD0.8左右，向菌液中加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，30℃诱导3h，同时设未诱导(不加IPTG)的重组体组和空载体组为对照。(IPTG:异丙基硫代半乳糖苷,是一种作用极强的诱导剂,是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质，相当于异乳糖。）离心收集菌体，并用PBS洗涤沉淀，再将沉淀重悬于裂解缓冲液中，并加入溶菌酶(4.0mg/ml),室温放置30min，离心取上清，进行SDS－PAGE检测。pET－30a－CpsMip在E.coliBL21中诱导表达CpsMip蛋白的诱导表达预期结果将PET-28a(+)-CpsMip重组质粒转化至E.coliBL21，IPTG诱导表达后，重组菌在Mr约为34KD处有一明显条带。预期目的蛋白大小如下图：图3：PET－28a－CpsMip在E.coliBL21中诱导表达目的条带预测位置CpsMip蛋白的纯化同样条件对重组蛋白进行大规模诱导表达，离心后，取上清，经HIS纯化树脂纯化，利用咪唑洗脱吸附在Ni－NTA－His亲和层析柱上的CpsMip蛋白，从而得到纯化的CpsMip蛋白。CpsMip蛋白