(高清版)GB∕T 32671.2-2019 胶体体系 zeta电位测量方法 第2部分：光学法

GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012Part2:Opticalmethods(ISO13099-2:2012,ID国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会IGB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012 1 13术语、定义和符号 1 3 3 47zeta电位的计算 88测量步骤 9附录A(资料性附录)毛细管样品池内的电渗 ⅢGB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012 本部分为GB/T32671的第2部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分使用翻译法等同采用ISO13099-2:2012《胶体体系zeta电位测量方法第2部分：光学——GB/T32671.1—2016胶体体系zeta电位测量方法第1部分：电声和电动现象(ISO13099-1:2012,IDT);——JJF1005—2016标准物质通用术语和定义(ISOGuide30:2015,MOD)。GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012zeta电位是用于表征悬浮液和乳液长期稳定性、研究颗粒和与颗粒表面接触液体的表面性能和吸附性能的一个参数。zeta电位无法直接测量得到，它是由实验测量得到的参数如电泳迁移率经适当的的电泳迁移率。本部分提供了用光学法测量电泳迁移率和计算zeta电位的方法。N1GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:20121范围GB/T32671的本部分规定了液体中悬浮颗粒的电泳迁移率的两种测量方法：显微镜影像法和电泳光散射法，颗粒表面电荷的估算和zeta电位的测定，可以通过电泳迁移率的测量并用合适的理论模注：相关理论参见ISO13099-1。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文ISO13099-1胶体体系zeta电位的测量方法第1部分：电声和电动现象(Colloidalsystems—Methodsforzeta-potentialdetermination—Part1:Electroacousticandelectrokineticphenomena)ISOGuide30标准物质通用术语和定义(Referencematerials—Selectedtermsanddefinitions)3.1.1悬浮在液体中的颗粒因液体介质分子热运动而引起的随机运动。3.1.2多普勒频移Dopplershift3.1.3表面电势electricsurfacepotential表面和体相液体之间的电势差。注：单位是伏[特](V)。3.1.4zeta电位zeta-potential5在滑移面处和体相液体之间形成的电势差。注：单位是伏[特](V)。2GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:20123.1.5在电场的影响下，带电荷的液体对带相反电荷的固体介质产生相对运动的现象。带电固体可以为3.1.6Veo远离带电界面的液体运动的均匀速度。注：单位是米每秒(m/s)。3.1.7μ单位电场强度下带电颗粒的电泳移动速度。注2:单位是平方米每伏[特]秒[m²/(V·s)]。3.1.8电泳过程中颗粒运动的速度。注：单位是米每秒(m/s)。3.1.9滑移面slippingplane剪切面shearplane在液/固界面附近因剪切力作用而产生的液体相对于颗粒表面滑动的一个假想平面。下列符号适用于本文件。a:颗粒半径。D:扩散系数。E:电场强度。kg:玻耳兹曼(Boltzmann)常数。NA:阿伏伽德罗(Avogadro)常数。n:介质折射率。Rap:毛细管半径。S(w):散射功率谱。P:洛伦兹(Lorentzian)半峰宽特征量。E:介质介电常数。3GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012μ:液体电渗速度。v:频率。5:散射光和电场方向的夹角。t:自相关函数延迟时间。w:角频率(w=2πv)。将特定zeta电位的颗粒悬浮液放置于含有一对固定间距电极的样品池内(如图1),样品池的形状用中需要探索。通过显微镜影像法或采用激光多普勒装置的电泳光散射法，测量某一特定位置的颗粒用已知zeta电位的颗粒样品进行标定。有两种不同方法监测电场中颗粒的运动。通过显微镜观察得到颗粒图像是非常经典的一种方法，称为“显微镜影像法”,也称为“微电泳法”。另一种方法是测量运动颗粒的散射光，从散射光信号的多普5显微镜法该方法的主要原理可以追溯到近两个多世纪以来微电泳的发展]。当光源照射到在直流或交流电场作用下迁移的颗粒时，由于散射效应，可以观测到被照射的颗粒。可使用明场照明或暗场照明方径下限到纳米尺度的颗粒运动图像。4GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012颗粒的照明图像。半自动地调节光扫描速度或棱镜移动速度，使得观测到的颗粒图像在显微镜下是静可使用人工显微镜观测和自动电泳光散射信号分析相结合的设计来测量多分散样品的电泳迁CCD图像传感器和计算机的出现使人们有可能捕捉到图像，将图像依次传送到计算机上，然后用精密的图像分析，从时间标记上重建电场作用下的颗粒运动轨迹的视频帧(测量局限于视频中的可视性浓度非常低。于电场。在图2中，电场方向垂直于图所在的平面。为避免电渗，激光照明和显微镜需要电泳光散射(ELS)是一种通过散射光的多普勒频移来测量电泳迁移率的间接测量方法。在电泳光5GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012敏的温度控制、适当的电场持续时间和电场强度都是影响检液体中移动。在封闭的毛细管中，液体呈抛物线移动。因此，测量在没有液体流动的所谓的静止层进样品池。6.3参考光光学装置典型的小角度光散射装置结构如图3所示。6——分束器；9——处理器；图3参考光光学系统结构图小角散射光学装置经常结合外差法探测使用。散射角通常在15°~30°,在此散射角范围内布朗运动导致的频谱展宽将会减少。对于非球形颗粒，颗粒的旋转扩散可能导致频谱展宽增加。在测量单元样品池的折射窗口以照射所述样品中的颗粒。参考光可以通过也可以不通过样品池，与通过传统光学元件或光纤的散射光合并照射到光电检测器的表面上，光电检测器可以是光电倍增管或雪崩光电二极6GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012频率引起的环境干扰最小化。检测器孔径是可变的，以便控制相干检测和散射体积。检测到的信号被6.4交叉光光学装置另一个现在不常见的光学装置是交叉光束法，如图4所示。在交叉光束法中，主光束分成强度相同测器位于两个光束之间。两个光束在不同散射角的光照强度反映了各个颗粒的散射。由散射光引起的品池中形成干涉条纹。这些条纹之间的间距取决于两者的波长和夹角。通过检测颗粒在运动中的带状条纹得到颗粒的电泳运动。用光调制器沿某个特定方向给干涉条纹施加一个已知的频率移动。颗粒在条纹中的运动，若检测明颗粒的运动方向与条纹运动方向一致。条纹运动速度总是设置成大于预期的最大颗粒速度。用这种1——光束1;2——光束2;5——散射光。图4交叉光光学装置结构图在布朗运动和电泳运动。I₁——参考光光强；I;——来自第i个粒子和第j个迁移率粒子的散射强度；7P——第i个粒径的特征洛仑兹半峰宽，对球形颗粒，它与粒径相关；w——角频率；△v;——为第i个粒径和第j迁移率粒子电泳运动的频移；d——电位测量的两点间距离。分母中的“干”符号表示光谱有两个峰。一个在不可见的负频率区域，另一个在可见的正频率区域。如果选择一个大的调制频率wm,使它们的和(wm+2π△vx.;)总是正的，负号可以省去。根据式(1),除了电泳迁移造成的频移外，由于布朗运动，所有样品颗粒的电泳谱都会有本征展宽。这种展宽随着颗粒尺寸的减小和散射角的增大而增大。测量本征展宽的一种方法是在不加电场的情况下测定频谱。从总的频谱中减去本征展宽频谱，可在一定情况下减少布朗运动的影响[1]。6.5.2自相关函数自相关函数是频率功率谱的傅里叶变换。式(2)所示，在参考光光学系统下，强度-强度自相关函数是关于延迟时间r的函数：式中：G(2)(t)——自相关函数；I₁——参考光光强；I.;——来自第i个粒子和第j个迁移率粒子的散射强度；P——第i个粒径的特征洛仑兹半峰宽，对球形颗粒，它与粒径相关；t——延迟时间；d——电位测量的两点间距离。图5为一个典型的自相关函数及其电泳速度谱。在自相关函数中，余弦波是由定向的电泳运动引起的，而衰减是由于随机的布朗运动引起的。在光谱中，峰位置是由光调制器和颗粒的电泳运动决定的，而峰形则受颗粒的布朗运动、频谱的迁移速度和激光束宽度的限制。01——自相关曲线；G(²)(r)——自相关函数；t——延迟时间；S(w)——散射功率谱；图5电泳光散射自相关函数和频谱图8GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:20126.5.3相位分析光散射(PALS)在非极性溶剂中，一些颗粒的电泳迁移率是非常小的，从而导致调制频率与电泳产生的多普勒频移之间的差异非常小，这样的频率差甚至可能小于1Hz。当颗粒悬浮在高离子浓度溶液中时，为了避免焦耳-汤普森热效应的影响，两个电极间只能加上一个很小的电场，这进一步导致了可检测到的多普勒频移非常小。由于频率偏移很小，散射光的强度或频谱分析不再有足够的分辨率，在这种情况下，可选择另一种方法——相位分析光散射法[]。相位分析光散射法是一种能反映非常小的频移的方法，这种频移是由颗粒电泳迁移引入的频率分量。在相位分析光散射法处理过程中(也称振幅加权结构函数的处理),调制频率由处理器合成为正弦或余弦波。检测到的信号是由正弦或余弦波相乘，导出两个函数：同相分量和正交分量。把这两个分量反正切分解，得到一个随机的振幅，但它的变化率是单位时间相位差。理论上，这种技术能够分辨的频率差低至0.001Hz,由于噪音和其他限制，实际上不太可能实现，不过，已经可以观察到低至0.002Hz的频移。相位分析光散射法只能得到电泳迁移率的平均值。在实际应用中，综合应用相位分析光散射法和频谱分析，再加上快速和慢速结合的电压反转，用来防止样品池电极极化和由电泳和电渗造成的分离。用这种方法，可以得到电泳的均值和谱图[12]。6.5.4调制布朗运动的功率谱法这种方法利用交流电场下悬浮颗粒散射光的频谱分析，来测量颗粒电泳迁移率的平均振幅，而迁移率信号是由单独的直流电场测量的。可使用量值具有溯源性的迁移率标样作单点校准。6.6电泳迁移率的测量散射光的多普勒频移与颗粒的电泳迁移率p之间的关系，取决于仪器的光学结构。式(3)和式(4)分别为参考光光学装置和交叉光光学装置的计算公式[8]。………式中：△w——多普勒频移；λ。——真空中的激光波长；n——介质的折射率；E——电场强度；θ——散射光与入射光的夹角；ξ——散射光与电场方向的夹角；θ′——交叉光束的夹角。…………7zeta电位的计算ISO13099-1详细描述了多种zeta电位的计算理论。对于非导电球形颗粒，通常使用亨利(Henry)…………9GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:201270——介质黏度；K——德拜长度的倒数；E——介质的介电常数；a——颗粒半径；式(5)有如下假设：a)颗粒所受的总电场是外加电场和颗粒本身所带电荷电场的叠加；b)因颗粒运动引起的电场变形(即弛豫效应)是可以忽略不计的；c)在流体力学方程中的惯性项可以忽略不计；d)表面电位比ksT/e小得多。算和预先知道许多其他关于样品的参数，而这些参数的值往往是未知的或很难得到的。可以在文献中找到稀释液中各类颗粒的电泳迁移率和zeta电位之间的关系，但在实际应用中却是相当有限的。由于大多数样品在粒径分布上的多分散性，因此具有不同的ka值，在实际应用中不可能对每一部分进行复杂和不同的计算来获得完整的zeta电位分布。当ka>>1,典型代表为在水性悬浮液中的大颗粒时，式(5)中f(ka)取值为3/2,称为肖特基(Smoluchowski)方程。当ka<<1,典型代表为在有机液体的小颗粒时，式(5)中f(κa)取值为1,该方程称为休克尔(Hückel)方程。对于这些理论的全面描述，参见ISO1308测量步骤8.1要求的干扰。操作区域应符合当地的健康和安全法规。仪器应当包含一个刚性的内置光学平台，或安装在警示——仪器中激光光源的辐射可能导致眼睛永久性的损伤，切勿直视激光束或其反射光，避免用具有镜面反射能力的物体阻挡激光束，遵守当地相关的激光辐射安全法规。确认样品池与所用介质的兼容性。颗粒的电泳迁移率完全取决于悬浮液的化学特性，如果需要对的稀释剂进行稀释。可以针对不同的测量选用不同的样品池。有些样品池是一次性的。为了避免污染应仔细清洗已使用过的样品池。如果在一个高离子浓度样品的测量后进行一个低离子浓度样品的测量，测量结果可能错误的电位差梯度。如果样品池被污染，那么样品池内的电渗情况也将和原先的不一致。GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012量结果的误差约为每度2%。颗粒的最终运动速度取决于液体的黏度。电极间施加的电位差可以是在极性反转前有限时间内施加的一个直流电压，尤其是对于高导电液体必需采用这种方法，可有效抑制焦耳-汤普森热效应的影响。这种方法的操作可能会导致脉冲很短，以至于在频谱图中出现边峰，在这种情况下可采用相位分析光散射如果测试的样品采样充分并具有代表性，测定得到应谨慎以避免在样品制备过程中改变待测样品的电泳迁移率。任何容器诸如玻璃烧杯或注射器的表面有可能吸引来自样品中的特定离子，或之前清洁过程中残留的污染物，或部分容器材料有可能会在一些情况下，使用特殊设计的样品池，可以在很小的散射角下测量中等浓度样品的电泳迁移率[]。但在大多数情况下，小角散射光学装置仪器要求对样品进行稀释，从而允许散射光通过测量zeta电位不仅是颗粒的一项属性，而且还依赖于颗粒表面和液体之间的化学平衡。液体化学性质和离子成分的任何变化都会影响这种平衡，并因此影响zeta电位。备应遵循这样一个原则，稀释后的样品不改变原始体系的zeta电位。改的唯一参数是颗粒浓度。只有基于平衡稀释样品制备过程，才能保证原始体系和稀释后样品具有相有两种方法可用于稀释液体的收集。一种方法是采用沉淀或离心技术提取上层清液，该上层清液应在报告测量结果的同时附一份详细的样品制备方法和稀释剂准备过程，通过几次彻底的稀释和样品测量以证明采用的方法至少是稳定的且测量结果具有一致性。标准物质的使用应遵循ISOGuide30中的要求。电泳迁移率标准物质(RM)应足够均匀和稳定，应包含电泳迁移率在时间和温度变化下的测量值，GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012泳迁移率有证标准物质(CRM)可用于仪器校准、测量方法验证和材料赋值，其标准值应具有量值溯源性和某一置信水平下的不确定度。许多标准物质的标准值尚不具有量值溯源性，目前尚未有电泳迁移率的具量值溯源性的有证标准物质。b)按操作规程进行测量；c)在适当浓度下或对稀释样品连续3次测量。在本部分中规定，当标样标准值的绝对值大于2×10⁸m²/(V·s)时，平均电泳迁移率测量的相对标准偏差不应大于10%。除特别样品或稀释后样品，中间精密度试验应遵循8.2.2所述。在本部分中规定，当标样标准值的绝对值大于2×10⁸m²/(V·s)时，平均电泳迁移率测量的相对标准偏差不应大于15%。仪器的测量准确度应采用国家或国际标准化组织认可的有证标准物质，或符合ISOGuide30要求的标准物质。可采用各向同性的刚性球形颗粒，电泳迁移率的标准值应通过光学方法在规定的条件下测量得到，其量值具有可溯源性。中间精密度试验应按照8.2.3规定的程序测量。时，测量的平均值与标样标准值的相对误差不超过10%。如果测量误差较大，应寻求专家建议并检查仪器操作情况。8.3测量误差来源颗粒系统的zeta电位在很大程度上受悬浮液的影响。如果测试样品是高浓度悬浮液，应制备相同化学成分的稀释液来稀释，能保持与真实zeta电位相一致的液相离子浓度悬浮液。可以通过过滤或沉淀来得到上清液，或通过缓冲液来模仿悬浮液。任何用于上述悬浮液制备的玻璃器皿或其他容器都应是清洁的且无离子污染。够的可以检测到的散射光。GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012相位分析光散射方法可用于测量具有较低流动性的非常小的颗粒，该方法可以大大减少布朗运动上消除了扩散的影响。液体介质在激光波长范围内应是透明无吸收的，液体介质黏度不宜太高(最好低于10mPa·s),在测量温度下无挥发。由于颗粒在电场梯度下获得的最终速度与黏滞力有关，因此zeta电位测量的准确性依赖于温度测量的可靠性。应有足够的时间使样品达到热平衡，水在室温附近的黏度变化约每度2%。实验室可在最初测量时建立在仪器允许温度范围内不同温度下的zeta电位测量值。对于低于室温下的测量，应采取预防措施以避免光程中样品池表面可能出现的冷凝现象。可使用干燥空气或氮气吹扫。当使用参考光光学装置时，样品池表面的划痕或污染会产生微量的不利影响。当使用交叉光光学当悬浮液具有较高离子强度时，如在生理盐水中的血红细胞溶液，会因焦耳-汤姆逊热效应引起热气泡可能来自装样过程中溶解在液体中的空气，或由于电化学反应如在电极表面发生的电解等。黏附在毛细管壁上的气泡会使电场畸变，导致静止层位置的不确定性。附着在电极表面的气泡会导致不正确的电导率测量结果。zeta电位是通过测量电泳迁移率计算得到，计算理论和方程的合理性依赖于悬浮液的性质，详见ISO13099-1。GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012而产生的变化将导致最终的测量结果的变化。在此情况下，建议报告测量结果的变化率，而不是绝b)样品标识和接收样品日期； h)检测报告结束标识。GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012(资料性附录)毛细管样品池内的电渗电渗是液体相对于一个固定的、带电表面的运动。对毛细管电泳池施加电场时，靠近毛细管表面的液体将沿着所施加的电场移动。当整个毛细管是封闭系统时，在管壁处运动的液体必将在毛细管末端回流，并推动液体以反方向流向毛细管中心部分，形成抛物线的液体流，如图A.1所示。对于固定形状、几何尺寸简单的毛细管样品池，如果所有管壁都具有相同的表面电荷状态，我们可以从理论上预测其电渗的情况。1——静止层。图A.1毛细管样品池内液体流动剖面图对于圆柱形毛细管样品池，电渗液体流动分布可用式(A.1)表示。…………A0.——电渗液体在滑移面的流动；r轴间距；Rap——毛细管半径。类似的公式可衍生到矩形毛细管样品池[4]。抛物线的形状流量曲线随取决于表面状况的μo..而变化。由于电渗对液体运动的影响，观察到的多普勒频移不再是纯粹来源于颗粒的运动，而是电泳、颗粒布朗运动以及液体电渗的最终结果。为了正确地测量颗粒的运动，测量应是在液体静止不动的位置进行，即μ=0,称为静止层。对于圆形的毛细管，静止层是一个圆，r=0.707Rp。对于矩形毛细管，静止层是一个矩形，到管壁的距离取决于毛细管的宽度与高度的比率，宽高比为3时，上、下静止层分别位于毛细管高度的84%和16%。图A.2显示了矩形毛细管样品池中不同位置的电泳迁移率值。方形标注的曲线来自聚苯乙烯胶乳样品PSL(a=155nm),其电泳迁移率为-4.2×10⁸m²/(V·s),三角形标注的曲线来自浓度为1mmol/L的NaBr溶液中吸附了正十二烷基离子的PSL样品(a=45nm)。曲线的对称形状表明，上、下层样品池表面具有相同的zeta电位。两个箭头处表示电渗量为零的两个静止层位置，在此位置测量可以获得真正的电泳迁移率。GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012在实际情况中，当入射光束被放置在静止层位置时，可以消除大部分液体电渗的影响。由于光束有一定厚度，被测颗粒实际是在静止层周围的非零厚度层中被观察到。对于矩形毛细管，可以预计，静止层上、下方的液体只有少量与平均净零电渗速度方向相反的电渗。对于圆形毛细管样品池，由于静止层不是一个平面，即使当光束中心正好位于静止层上，也会导致零液体速度的偏差。x/% 图A.2在样品池不同位置获得的表观电泳迁移率值[8]如果受离子和其他物质的吸附作用、空气或气体气泡的影响，毛细管的不同侧面的表面电位会变得不均匀，然后产生不对称的液体曲线。这个曲线可以用来确定矩形毛细管上下表面的表面电位[15]。电渗的另一个影响是测量得到的迁移率分布变宽。任何光束具有一定的厚度，当光束中心位于静止层时，部分光束照射到右侧的液体、部分光束照射到左侧的液体，即使颗粒具有理想的单分散流动性，所报告的流动性也将是一个分布，而不是一个单一的值，虽然其平均值可能仍然是正确的。在毛细管中心的流动曲线，有一个非常平坦的斜坡，在此位置，液体和颗粒的流速相似，迁移率分布变宽是最小的。的迁移率分布可以修正在静止层获得的迁移率分布的平均值。减少电渗的一种方法是在毛细管内表面涂覆特定材料，以减少管壁的zeta电位。通常采用聚乙二醇-聚乙烯亚胺(PEG-PEI)涂层或嫁接，以显著降低宽范围pH、离子强度的电渗。当作为常规程序时，需要进一步证明涂层的稳定性和易用性。避免电渗的另一种方法是使用高频率极性变化的直流电场(>10Hz)。主要的想法是，液体比颗粒需要更长的时间到达终点速度。对于非移动的颗粒到达它们的电泳速度的加速时间在纳秒到微秒的范围内，但对于液体它是在分秒的范围内，如果电场极性变化迅速，液体是静态的，就可消除电渗的影波，不可避免地降低了频谱分辨率。这使频谱变得复杂，特别是对于多分散性的流动材料。可采用普通直流测量和高频电场反转测量相结合的方法，高频场反转测量得到样品的移动平均值，直流测量得到无GB/T32671.2—2019/ISO13099-2:2012[1]Reuss,A.Mem.Soc.Imp.D.Moscow1807,11,p.327.[2]Zsigmondy,R.Colloidsandtheultramicroscope.NewYork,NY:Wiley,1914.[3]Gittens,G.J.,James,A.M.Animprovedmicroelectrophoresisapparatusandtechniqueforstudyingbiologicalcellssurfaces.Anal.Biochem.1960,1,pp.478-485.[4]Goetz,P.J.,Penniman,J.G.Anewtechniqueformicroelectrophoreticmeasurements.Am.Lab.1976,8,pp.21-30.[5]Goetz,P.J.System3000automatedelectrokineticanalyzerforbiomedicalapplications.In:Schutt,W.,Klinkmann,H.,editors.Cellelectrophoresis.NewYork,NY:deGruyter,1985,pp.41-55.[6]O'Brien,R.W.,Cannon,D.W.,Rowlands,W.N.Electroacousticdeterminationofparticlesizeandzeta-potential.J.ColloidInterfaceSci.1995,173,pp.406-418.[7]Sutherland,W.H.,Pritchard,J.A.V.Animprovedapparatusformicro-electrophoresis.In:Preece,A.W.,Sabolovic,D.,editors.Cellelectrophoresis:Clinicalapplicationandmethodology.Elsevier,1979,pp.421-31.[8]Xu,R.Particlecharacterization:Lightscatteringmethods.Chapter6.Dordrecht:Kluwer,2000,pp.299-343.[9]Xu,R.Progressinnanoparticlescharacterization:Sizingandzeta-potentialmeasurement.Particuology2008,6,pp.112-115.[10]Xu,R.Methodstoresolvemobilityfromelectrophoreticlaserlightscatteringmeasurement.Langmuir1993,9,pp.2955-2962.[11]Miller,J.F.Thedeterminationofverysmallelectrophoreticmobilitiesinpolarandn