Ultimate3000型高效液相色谱仪自主操作培训教材

Ultimate3000型高效液相色谱仪

自主操作培训教材

福州大学测试中心

2018年9月

第一部分

Ultimate3000型高效液相色谱

原理和仪器配置

一、液相色谱原理简介

1、色谱法起源

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分

离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展

出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

2、液相色谱法的分离原理

溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相(stationaryphase)时,

由于与固定相发生作用(吸附、分配、离子交换、排阻、亲和)的大小、强弱不

同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析

法。英文为HighPerformanceLiquidChromatography,简称为HPLCo

色谱

00

3、HPLC分离模式

包括反相模式(RP-LC)；正相模式(NP-LC)；离子对色谱(IPC)；离子交

换色谱(IEC)；体积排阻色谱(GPC/GFC)；亲和色谱(AC)等。其中，反相和正

相模式又属于液液分配色谱。

•流动相的极性小于固定液的极性(正相normalphase),反之，流动相的

极性大于固定液的极性(反相reversephase)□正相与反相的出峰顺序

相反；化学键合固定相：(将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶(担

体)表面的游离羟基上。C-18柱(常用反相柱)。

4、HPLC与经典液相色谱方法以及气相色谱(GC)方法的比较

4.1HPLC与经典液相色谱方法比较

高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；

而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。

高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很

高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。

高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10%,荧光检测器一一10一七。

4.2HPLC与GC比较

分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，占有机物总

数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占

有机物总数的80%o

流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载

作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择

的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，即流动相对分离的贡献很大,

可通过溶剂来控制和改进分离。

操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。

5、HPLC应用

由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不

稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用

极为广泛。可应用于氨基酸、蛋白质、核酸、烧、碳水化合物、药品、多糖、高

聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析。

二、HPLC基本术语和色谱图

色谱图(chromatogram)一样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲

线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。

基线(baseline)一经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一

段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

噪音(noise)一基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器

不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

漂移(drift)一基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、

流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生

漂移。

色谱峰(peak)一组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上

的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对

称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。

拖尾因子(tailingfactor,T),用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因

子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)□《中国药典》规定T

应为0.95T.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。

峰高(peakheight,h)-峰的最高点至峰底的距离。

峰宽(peakwidth,W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的

距离。W=4o

半峰宽(peakwidthathalf-height,Wh/2)-峰高一半处的峰宽

峰面积(peakarea,A)-峰与峰底所包围的面积。

死时间(deadtime,t0)一不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过

色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

死体积(deadvolume,V0)一由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所

占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被

流动相占据，Vm)、柱出口管路体机检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱

平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减

小。V0=FXt0(F为流速)

保留时间(retentiontime,tR)一从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极

大值的时间。

保留体积(retentionvolume,VR)一从进样开始到某组分在柱后出现浓度极

大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=FXtR

调整保留时间(adjustedretentiontime,t'R)一扣除死时间后的保留时

间。在实验条件(温度、固定相等)一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，

t'R(或tR)可用于定性。t'R=tR—10

调整保留体积(adjustedretentionvolume,VR)一扣除死体积后的保留

体积。

t

O

U

6

-

S

一张色谱图至少能提供以下信息：

1、样品中所含组分的最少个数；

2、保留值一-定性分析；

3、色谱峰面积（或峰高）-一定量分析；

4、色谱峰的保留值和区域宽度--评价色谱柱的分离效能；

5、根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件。

三、HPLC仪器基本配置

高效液相色谱仪通常由五大部分组成：高压输液系统、进样系统、分

离系统、检测系统和数据输出系统。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键

部件。

数据处理

检测器＜

溶剂柜

第二部分

Ultimate3000型高效液相色谱

基本操作

二基本操作

2.1使用前的准备工作

2.1.1接入稳压电源

将稳压电源的输入端插头插在墙上的插孔上。

2.1.2流动相的更换和过滤

1.检查流动相是否太少或放置太久。超纯水或缓冲盐溶液建议每天必需更换

且过滤，以防止长细菌。超纯水必须为新制，这一点尤其重要。（市售小瓶装质

量好的纯净饮用水也是好的选择）

注意：一般情况下，自动进样器清洗液建议使用与样品互溶好的溶液并且不含盐!

2.梯度洗脱则有机相用一个通道（如A通道），超纯水或缓冲盐用另一个通道

（如B通道），使用一段时间建议A和B通道进行更换。

3.混合流动相的过滤原则：纯有机相或含一定比例有机相的就要用有机系

0.45Pm的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系0.45Pm滤膜。这一点需特别注意,

因有机溶剂可以溶解水系滤膜,被溶解的水系滤膜更易损坏密封圈和柱塞杆。

4.配好的流动相真空过滤时，当抽滤完后可继续抽滤几分钟，起到抽滤脱

气的作用。

2.1.3流动相的超声脱气

1.过滤后的流动相需要超声脱气约20分钟。

2.建议超声波中的水位尽量高于流动相瓶中的水位，超声脱气效果会更佳。

3.超声的时间不易过长，超声波工作会发热，超声时间过久时，超声波中的

水会发热，随之流动相也发热升温，导致改变流动相的组成比例。

2.2打开仪器电源开关

打开仪器各部份后面板电源线下方的电源开关，仪器将开机自动进行自检。

各部分自检成功后，方可正常进行以下各步操作。

2.3.打开软件

2.3.1打开电脑

打开电脑，等待约1〜2分钟，变色龙服务监视器将会自动启动。

或者双击电脑右下角的变色龙软件的服务管理器，如下图：

将跳出如下图所示界面：方能进行以后的各项操作（包括以后用软件控制仪

器也需要先激活服务管理器）。

睁Chroaeleon服务管理等叵区

仪电劈网照---------

面本地仪器控制器运行空闲.为|口停止仪器控制器⑤)]

胞□系统启动时运行服务®

配皆仪器

其他Chromeleon服务

O其他所有Chromeleon服务正在运行。

2.3.2打开变色龙软件

双击电脑桌面的“Chromeleon7”图标，进入变色龙软件。将出现如下界面:

VChroneleonConsole-H>X

。返回£I创建⑥I文件9编辑⑤视图9工具①帮助篁)向

类似电脑操作系统中的资源管理器，左方为根目录，右方为对应目录下的文

件夹或文件。

左下方有三大模块：

仪器：控制仪器和运行的相关操作界面。

数据：查看和处理仪器分析数据。

eWorkflows：固定工作流程。

单击某一模块，则进入相应的版块。

2.3.3.泵模块

连接/断开：软件与泵的连接或断开。一旦使用软件与泵进行了连接，泵的

前面板上的控制键将不起作用。

暂停：仪器暂停时，计时器也暂停但不回到零点，按“继续”键后计时器和

泵继续工作。

停泵：泵停止工作，计时器也回到零点。

继续：与“暂停”“停泵”配套使用。

流速/压力：设定泵的流速，压力会自动在线监测。

淋洗液：设定A/B/C/D各通道的比例，通过比例阀调节。

马达：泵和比例阀的开关。

快速清洗功能键。

每天或每次使用仪器分析样品前，需先清洗泵头或管路中残留的气泡或溶剂。

在使用此键前需先向上掀开泵头前面板，然后拧松快速清洗阀（反时针两圈

左右）。然后在软件中按此“冲洗”键，泵将以3.0ml/min的速度自动快速清

洗泵内残留的气泡，5分钟将自动停止。若想手动停止，只要再按“冲洗”键，

将停止清洗。

注意：若长时间未使用仪器，或该通道更换了另外的流动相，清洗时间不易

太短，一般以5分钟为宜。否则，有残留气泡或溶剂留在真空脱气机内，易造成

流速不稳定，所分析成分的保留时间不稳定而影响正常的分析。

要使用的每个通道（A/B/C/D）都需要设100%A,B,C,D单独快速清洗来排气

泡。如果通过分别设定每个通道的比例让多通道进行同时快速清洗，泵流速建议

控制在3ml/min以下，否则容易损坏比例阀。

清洗有缓冲盐的那个通道前后，一定要用去离子水清洗管路和泵头。以防止

缓冲盐直接与纯有机相（甲醇、乙晴等）混合而产生结晶堵塞比例阀。

清洗完毕，先停泵，再拧紧快速清洗阀。切记：不要在泵未停止清洗前拧紧

快速清洗阀。

如下图，为按“冲洗”键前的警告信息。

：。启动eWorkflow，智能启动▼户智能关机▼.释放控制日监视基线办命令|'分离曰＜自动生成＞▼

UltiMate3000x2DualHomeDGP-3600(BS,SD)WPS-3000SLTCC-3x00DiodeArrayDetector审计(J)启动化)队列@)

模块状态左泵左泵藐速/压力左泵藐动相左泵压力和梯度

]mL/min---范围％A%C65,

Connected

更多选项…]।--------：3||：10。]斗mpLeft_Press

保留时间：

II

模块连接

连接6.r

|更多选项…]

[系统维护…]

[维修…]

|验证…]

|忽略警告执行(£)][取消]

[Relays/lnputs…]

命令

■|暂停]

■[停泵|

2.3.4进样器

在U3000仪器控制界面上方的“WPS-3000SL”，将显示下图：

：O启动eWorkflow▼终释放控制[用监视基线j■命令|口分离占＜自动生成)▼

UltiMate3000HomexPG-3x00州,SD)^IPS-3000SL^CC-3x00|DiodeArrayDetector|审计Q)启动9队列@)

模块状套启动样晶盘控制温度控制

45f

温度控制

30

设定温度20

104u

温度就绪差

|1#循环次数

实际温度Ready20.0[*C]

清洗^冲环

(300间

外部清洗针

200面前$

进样闲

当前位置：

Load

自动样品盍景荡

|到进祥位置]B^次数

停止进样I~~到装样位置I

位置：

三个扇形区分别为；R、G、Bo以分析型自动进器为例，每个区可放置一个

标准的分析型孔板和一个大号的孔板。

标准的分析型孔板(2ml)如下图所示：

12345678

以R区为例，使用该孔板时，样品瓶的位置可定义为RA1-RA8、RB1-RB8,

RC1-RC8,RD1-RD8、RE1-RE8,共40个样品瓶位置。

大进样量用大号孔板（10ml）如下图所示：

以R区为例，使用该孔板时，样品瓶的位置可定义为RI、R2、R3、R4、R5,

共5个样品瓶位置。

体积：

RS/SD型的进样器标准注射器为100口1,最大进样量不能超过100口1。若需

要进更大体积，需更换注射器和相应的定量环。

2.4分析样品前的准备工作

2.4.1系统的准备

1.分析样品前先用甲醇或乙晴冲洗流路约20分钟，平衡活化色谱柱，并赶走

管路中的杂质和水分。

2.若流动相为有机相与水相的混合物，则第1步完成后，按照分析样品的需

要调节比例阀的比例后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。

3.若流相相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸或其它电解质，则第1步完成

后用95畀左右的去离子水冲洗流路约20分钟后，再按照分析样品的需要调节比

例阀的比例后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。

2.4.2分析样品的准备

1.按照样品的前处理要求处理好样品。例如用甲醇/水溶、超声、萃取、索

氏提取、过C18小柱等前处理方法。

2.注意：大约估计一下待测样品所测成分的浓度或含量，将待测样品与标准

品配成浓度大致相当的溶液，以满足线性要求，保证所测样品含量或浓度准确。

2.4.3排系统气泡

1.首先将所需要使用的流动相通道分别在软件泵的控制面板中进行“冲洗”

排气泡，详细说明参考前面讲到过的泵的控制面板。

2.若为手动进样阀，则需将进样阀处的扳手反时针扳到头后，用一次性医用

注射器吸几毫升的50舞甲醇或流动相，从进样口注入，清洗定量环和管路。

3.若为自动进样器，则需按软件中自动进样器面板上三个清洗的“启动”键

洗针并排掉注射器和进样针中残留的气泡。若仪器长时间未用，可能按一次“启

动”键无法排气泡，可再按“启动”键，直至气泡排完为止。

4.若仪器较长时间未使用，流通池中可能有气泡，可以不接色谱柱，加大流

速冲洗流通池中的气泡。

5.系统气泡排完后，可以参考2.5.1步骤进行系统的平衡。

2.4.4监视基线

点工具栏中的“监视基线”或左下角的“采集打开”，开始设置采集基线。将

跳出如下窗口，选择UV：

：c＞启动eWorkflow▼

智能启动•4智能关机-c「一®监视基线’弱里分离国〈自动生成），

UltiMate3000x2DualHomeDGP-3600(RS,SD)WPS-3000SL幅就友葭产盯Detector审计工)启

模块状套信号

|1Q0HZZ[Tooos$|

I更多信号…UV1UV2|UV3UV4

A1254.0nm

波长230.0nmYi270.0nm

A|lnm

带宽1nmY1nm1nm

模块连接

Off4Off

参比波长Yw

连接A1nm,J

参比带宽1nmV1nm1nm

在线造图

IZO-n——

100-

bar

80-

60-

命令

。“紫外灯40-

可见光灯

20-

采集打开

采集关闭

选择监视通道

设定完成后，按“确定”键，便可进行基线的采集。

2.5进样与数据处理

等基线平衡后，根据设定好仪器方法/序列文件进行样品分析。

251建立一个仪器方法

新建一个仪器方法，在U3000色谱仪器控制区（ChromeleonConsole）”创

建”菜单下拉菜单中点击“仪器方法”。

爹ChromeleonConsole

创建文件电）编辑量）视图9工具⑴帮助国）

仪器：◎启动eWorkHow，'智能启动，«智能关机，巴监视基线委命令分离士〈自动生成》，

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昌H既机谡崎

系统：U3000

用户:

泵

□0.000[ml/min]

进样器

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日期时间保留时间设备信息

用仪器

2012-1-1911:13:51仪矗配颤雷瓢许丽丽

数据2012-1-19许可错误：许可不可用

eWorkHowsjQ2012-1-1932ColumnOven.Column_B发现芯片卡.

A2012-1-19ColumnOven.Column_A.发现芯片卡.

仪§F雨丽被选定

，大智慧-［奥特迅］片IC-HPLC变色龙7-U3000样品表的.ChromeleonConsole

.采集时间和采集通道设置

在弹出的“仪器方法向导”窗口中输入分析运行时间；诊断通道下有三种选

择：柱温箱温度、泵压、和灯室温度，如果选上泵压则在采集色谱数据的同

时也采集泵压曲线，点击“下一步”。

.LPG-3400SD泵常规设置

在溶剂名称下面的方框中输入所用流动相的名字，如%A:“100%水”％D:“100%

甲醇”。在“压力限值”处的压力下限设5bar左右，当流动相走完时，可防止空

走。压力上限可设定正常使用值的L5倍左右，用于保护柱子。

最大流速加速度为开机后流速从0到设定值所需的时间，减速度为关机时从

使用值回到0所需的时间。加速度和减速度可设流速的1/3-3倍。点击下一步。

2.5.2.泵流速梯度的设定

在弹出的''流速梯度”窗口中，上图显示所设定的梯度曲线，下表中列

有时间、流速、各通道流动相比例及梯度曲线。其中有流动相B、C、D通

道的％,A通道会自动计算剩余比例，即酰=100%-B%-C%-D%o下表中

可以根据需要随意设定一个梯度程序。例如：流速1ml/min,0-20min从20%D

-80%D的线性梯度（每一行右边有Curve曲线设定，默认线性梯度为5）20min

分析完成后，设Imin从80%D迅速回到20%D,再在20%D平衡数分钟待基线走

稳后可进下一个样品。在设定梯度过程中可以点击右边的“插入”行和“删

除”行进行编辑。如果样品复杂，如17种氨基酸的分析，要设定多步梯度。

对反相色谱而言，一般梯度过程为水系比例越来越少，有机系比例越来越多，

使强保留组分能较快洗脱。（双三元可以设一3mim,20%D走平衡

阶段，使冲洗掉自动进样器管中另一序列用的流动相）点击下一步。

2.5.3.WPS-3000自动进样器的常规设置

若配置有自动进样器，则需要进行此步设置，手动进样阀没有此项设置。根

据吸样量决定吸取速度，要求进完一针样品要保证有5秒的吸样时间。通常吸取

速度设定慢一些，不容易产生气泡；排出速度设定快一些一般10—20ul/s；排

出到废液10—20ul/s；吸取和排出延迟可取默认值。取样高度指进样针离瓶底

的距离，常规分析可取默认值，在用到内衬管时要根据情况设高些，确保进样针

吸到样品液又不至于扎破瓶底。

下面进样冲洗，可选择做样期间不洗针或进样后洗针及进样前洗针。如果样品浓

度高低差小于30%可以不洗针，选NoWash。点击下一步。

2.5.4.进样模式

下图中分析型LC一般采用默认设置，设定完成后，点击下一步。

%仪益方法向导-Saapler(IPS-3000):进样模式

如果选择WPS-3000自动进样器带温控的，可在“使用温度控制"前打““‘。

一般只需在“温度”后输入需要的温度值后回车即可。其它各项均可采用默认值。

设定完成后，点击“下一步。

2.5.5.TCC-3100柱温箱常规设置

若采用常温分析样品，而不需要对色谱柱进行精确控温的情况下，则不用在

“使用温度控制”前打“J反之，则需要打“J

一般只需在“温度”后输入需要的温度值后回车即可。其它各项均可采用默

认值。

设定完成后，点击“下一步。

如果配有两根色谱柱，下图中有色谱柱A和B信息显示。

承仪器方法向导-ColuanOven(TCC-3100):色诺柱

色谱柱forColumnOven(TCC-3100).X

色诺柱活动压力源

Columr)_APump

Column_BPump

屈性Colvnin_AColumn_B

文帝下限5.0[°C]5.0[°C]

温度上限70.0[°C]70.0[°C]

压力上限400.0[bar]400.0[bar]

产品ID059124059133

批号018-01-003018-01-026

生产日期19Jan201219Jan2012

生产商DionexCorp.BionexCorp.

描述Acclaim120C83黔120AAcclaim120C183必20A

直径2.10[mm]4.60[mm]

长度150.00[mm]150.00[mm]

粒径3.00[Mm]3.00[Mm]

埴料C8C18

空隙体积360.0[Hl]1750.0[Hl]

pH上限12.012.0

pH下限2.02.0

有效期

进样限值5000050000

TCC-3100柱温箱内如果配置了两根柱子并要做柱切换，可在下图中点击“添

加”出现第二行，如图中阀开始时位置为10-1,5min时进行阀切换到位置

1-2。点击下一步。

2.5.6.UV(DAD-3000RS)紫外二极管阵列检测器通道设定

二极管阵列检测器可以同时选择4个紫外通道采集数据，可以分别设定需要

的检测波长，需要采集3D光谱时要选上3DFIELD。常规分析时可以选一个通道

采集数据，一般参比波长选OFF。数据采集速率和响应时间使用推荐值5Hz和

1.0s,每个峰的最佳数据采集点数一般为20-40个点，这样既考虑到积分的正确

又不增加数据处理的时间也不会漏峰。采集3D光谱图时可以设定最小和最大波

长

（备注：狭缝宽度：仅DAD3000RS有此参数，选Narrow分辨率高而灵敏度

低，反之选Wide分辨率低而灵敏度高）点击下一步。

仪器方法设定已完成，在下图注释中输入仪器方法的名称，如2012测试样

品，点击完成。

乐仪器方法向导-完成

您现在已经输入创建仪器方法所需要的所有数据。

注释C）

[2012测试样品

描述

仪器：U3000

创建时间:2012-1-2120:01:13

由LZhang创建

点击"完成”在ChromatographyStudio中打开仪器方法。

2.5.6.新建立仪器方法的预览与修改

下图中左侧“仪器方法”下选中“脚本编辑器”，右边方框中把刚才的所有

设置项转化成了程序，在此程序中的所有项设置仍可重新修改，只要点击左边仪

器方法下对应的各个设备的直观的图示，更改其中的某项也同样起作用。

新的仪器方法（仪器方法）-ChromeleonChromatographyStudio-BX

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