色谱分析-薄层色谱（分析化学课件）

1、薄层板的制备在制备吸附薄层色谱中，固定相的选择十分重要。其选择应从两个方面考虑：①被分离物质的性质（如极性、酸碱性、溶解度等）②吸附剂吸附能力的强弱。若被分离物质极性强，应选择吸附能力弱的吸附剂；若被分离物质极性弱，应选择吸附能力强的吸附剂。薄层色谱测定步骤吸附剂就其性质而言，可分为有机吸附剂（如聚酰胺、纤维素和葡聚糖等）和无机吸附剂（如氧化铝、硅胶、硅藻土、磷酸钙、磷酸镁和硅酸钙镁等）。最常用的是氧化铝和硅胶，它们的吸附性能好，适用于多种化合物的分离。常用的吸附剂厚度为0.5～2.5mm，色谱板的尺寸一般为20cm×20cm或20cm×40cm。薄层厚度与薄层板的尺寸限制了PTLC可以分离的样品量。1.0mm厚的硅胶板最多可上样5mg／cm2。硅胶是最常用的吸附剂，可用它来分离亲脂或亲水性物质。薄层色谱测定步骤2、流动相（展开剂）的选择选择展开剂主要是由被分离物质的极性、吸附剂的活性以及展开剂本身的极性来决定.①一般先选择单一溶剂作展开剂；对难分离组分，则需要使用二元、三元甚至多元的溶剂；②先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，直到选出合适的展开剂组合为止。

薄层色谱测定步骤

③对普通酸性组分：特别是离解度较大的弱酸性组分应在展开剂中加入一定比例的酸，可防止拖尾现象；④对于碱性物质：如某些生物碱，多数情况是选用氧化铝为吸附剂，选用中性溶剂为展开剂。若采用硅胶为吸附剂，则选用碱性展开剂为宜；但对某些碱性较弱的生物碱可使用中性展开剂。理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大。各组分理想的比移值在0.2-0.8之间。薄层色谱测定步骤3、点样

①选用挥发性溶剂(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等)；②最好用与展开剂极性相似的溶剂，应尽量使点样后溶剂能迅速挥发，以减少色斑的扩散。水溶性样品，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。薄层色谱测定步骤

点样示意图反应混合液样1-2cm点样直径≤2mm1cm≤点间距≤1.5cm原料样薄层色谱测定步骤

③注意事项：A样品的浓度应在5％～10％左右。点样带应尽可能狭窄，以获得更好的分离效果。溶解样品的溶剂要尽量避免用水；B适当的点样量，可使斑点集中，点样量过大，易拖尾或扩散；点样过少，不易检出。一般是几微克到几十微克；C尽量用小的点样管，如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。薄层色谱测定步骤4.展开展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。薄层板呈倾斜状。盖上盖子，容器密闭。防止边缘效应。薄层色谱测定步骤5.显色常见的显色方法：①物理显色法②生化显色法③化学显色法

薄层色谱测定步骤6.样品的收集在确定色带位置后，可用刮刀或一与真空收集器相连的管形刮离器将该色带吸附剂从板上刮下。后一种方法并不适用于敏感的物质，因吸附剂持续与气流接触，所含的纯化合物有被氧化的危险。薄层色谱测定步骤注意：A无论采用何种回收方法，都应以极性尽可能小的溶剂将化合物从吸附剂中提取出来(1g吸附剂约使用5mL溶剂)。B化合物与吸附剂接触的时间越长，被破坏的可能性越大。可先用4型玻璃砂芯漏斗过滤洗脱液，然后再用孔径为0.2～0.45μm的滤膜过滤。C甲醇可溶解硅胶及其中含有的一些杂质，因此，并不适用于从吸附剂上洗脱被分离的化合物，较合适的溶剂是丙酮、乙醇或氯仿。薄层色谱测定步骤薄层色谱定量分析方法定量分析：1、间接定量法：

将TLC已分离的物质斑点洗脱下来，再借助分光光度法、HPLC法或者GC法对该洗脱物质进行定量分析；2、直接定量法：

（1）斑点面积测定法：以半透明纸扫TLC图上的斑点界限，然后测定其面积。将斑点面积同平行操作的标准样品面积进行定量；（2）目测法：

将被测样品和标准系列溶液点在同一薄层板上，显色后，将被测样品的斑点面积大小和颜色与标准系列相比较，可推测样品的含量范围。该方法适用于对常规大量样品的重复分析。

现薄层扫描仪定量是薄层色谱定量的主要方法：用一定波长、一定强度的光束照射到薄层板上被分离组分的色斑上，用仪器进行扫描后，求出色斑中组分的含量。薄层色谱定量分析方法

薄层色谱又称薄层层析（ThinLayerChromatography）：是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。常用TLC表示。属于固-液色谱的一种。分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻）；特点：分析快速、灵敏、显色方便；应用：中药成分的鉴定和药物杂质检查。

薄层色谱法概述分离原理：

吸附薄层色谱是应用最广泛的。样品中的A、B两个组分，吸附系数大的组分在薄层色谱的迁移速率慢，而吸附系数小的组分在薄层色谱的迁移速率快，经过一定时间的完全分离，在薄层色谱上形成两个斑点，从而进行分离。

薄层色谱法概述比移值（Rf）

被分离混合物一、比移值和相对比移值比移值与相对比移值说明：1.分配系数K↑大，Rf↓小2.Rf范围：0<Rf<1

Rf=0.2~0.8（常用）0.3~0.5（最佳）

二、相对比移值Rs比移值与相对比移值影响Rf值的因素：展开温度：室温对分离影响不明显。其他条件相同，温度低比温度高时展开慢，分离好。薄层厚度：板厚度变化对比移值影响明显；厚度达0.2mm时，影响较小；在0.25mm时，分离效果最佳。吸附剂含水量：与吸附剂的种类、使用时的加水量、风干时间、活化温度和活化时间等因素有关。比移值与相对比移值层析缸中蒸气：缸中蒸气未达饱和时，比移值不能重现。为使缸中蒸气饱和，可以在缸内壁附上一层滤纸，让展开剂全部湿润；把展开剂放入层析缸一段时间后再放薄层板；尽可能在恒定温度下层析。其他影响因素：展开剂的pH、展开时间、展开距离、样品浓度、点样量、薄层板所用吸附剂中的粘合剂的种类和用量等，都有可能影响样品组分比移值的大小。比移值与相对比移值实验原理实验仪器与试剂实验步骤实验数据的处理二甲基黄与罗丹明B的薄层色谱的鉴别一、实验原理：

薄层吸附色谱是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上做固定相，经干燥活化后点上样品，以适当极性的有机溶剂作为展开剂。由于组分的性质差异，易被固定相吸附的组分移动慢，难被固定相吸附组分移动快。经过一段时间的展开后，不同组分彼此分开，形成相互分离的斑点。

本实验以硅胶为固定相，以95%乙醇溶剂为展开剂分离二甲基黄、罗丹明B以及两者的混合物。二甲基黄与罗丹明B的薄层色谱的鉴别

二、实验仪器及试剂：仪器：玻璃片、毛细管和层析缸；

试剂：二甲基黄溶液、罗丹明B溶液，两者的混合液、硅胶、0.5%羧甲基纤维素钠；

二甲基黄与罗丹明B的薄层色谱的鉴别三、实验步骤：铺板点样展开计算Rf值

采用倾注法：称取5g硅胶于研钵中，并加入8mL的CMC-Na，调成糊状，将调好的糊状物倒在玻璃板上，用手摇晃，使糊状均匀地分布于整块薄板上，