【基因测序技术在新生儿遗传病筛查中的应用研究5900字（论文）】

基因测序技术在新生儿遗传病筛查中的应用研究目录TOC\o"1-2"\h\u2891基因测序技术在新生儿遗传病筛查中的应用研究 115129前言 186091.二代及三代测序技术的原理和分类 228491.1二代测序的原理和分类 2149861.2三代测序的原理和分类 3243212.二代测序在新生儿遗传病筛查中的应用 4138862.1NGS在无创产前筛查中的应用 432172.2NGS在产后单基因病筛查中的应用 5142463.三代测序在新生儿遗传病中的应用 696413.1三代测序在单基因病中的应用 6249724.总结与展望 724846参考文献 9摘要：新生儿遗传病是社会公共卫生中一项重要的问题，为防治新生儿遗传性疾病、提高出生人口素质和群体健康水平，新生儿的产前诊断和产后病因鉴定为重中之重。至今，二代测序凭借其高通量、低成本的特点，在临床诊断中的广泛应用成为有力工具，同时三代测序凭借其长读长优势在临床鉴别诊断中崭露头角，两者各有其优势特点，相互补充在更有深度的分子层面发挥作用。本文基于此，针对二代和三代测序技术的原理、优缺性，以及两者在新生儿遗传病筛查中的应用做一综述，为今后测序领域的研究提供总结，为临床应用提供指导和建议。关键词：二代测序；三代测序；新生儿；遗传病筛查前言随着社会的发展要求，基于我国出生率下滑而老龄人口不断增加的现状，为了更好的实现人口结构的优化，我国从2016年起全面开放二胎政策，从而引来了新一轮的生育高峰，进一步增加了高龄产妇的数量，据统计，我国每年出生后存在缺陷疾病的新生儿高达90万[2]，出生缺陷会对患病的儿童、他们的家庭、卫生保健系统和社会产生深远的影响，因此新生儿遗传性疾病筛查尤为被重视，它是降低出生缺陷、提高人口素质的重要手段之一，目前临床中主要通过生化检查、细胞遗传学和基因诊断等方法为诊断遗传病提供依据[3]。基因测序技术也称为DNA测序技术，即获得目的DNA片段碱基排列顺序的技术，是分子生物学领域迅速发展的一项分析技术，在遗传学诊断中发挥重要作用。1977年第一代Singer测序的发明，让生命科学的研究进入了基因组学的时代，经过四十几年的发展，测序技术从一代测序发展到三代测序，经历了革命性的变革。1975年由Sanger和Coulson开创的“双脱氧链终止法”基因测序技术提供了人类探索遗传本质的方向，以此为开端让人类步入基因组时代，但由于一代测序检测成本高，通量较低，同时也无法满足日趋增长的对各类生物基因序列信息的迫切需求，在此背景下，分子检测技术引来了技术革新的二代测序，二代测序技术大幅度提高了测序速度，其准确性在Sanger法的基础上也有所提升，通量高的同时检测成本的也有所降低，使得分子遗传学检测技术逐步被纳入临床实践中，然而二代测序技术还达不到满足临床的快速诊断需求以及对复杂基因序列检测的需求，自此，测序技术引来了新的里程碑，以长读长和快速检测为优势的三代测序应运而生，实现了真正意义上的实时测序。以二代测序技术和三代测序为代表的DNA测序技术迅速发展，成为筛查新生儿遗传性疾病的主要技术手段，实现在分子水平层面对新生儿遗传性疾病的精准检测。本文将查阅关于二代、三代测序技术的相关文献，对二代测序和三代测序技术在新生儿遗传病筛查的应用做一综述。1.二代及三代测序技术的原理和分类1.1二代测序的原理和分类二代测序技术又称为下一代测序技术(NextGenerationSequencing，NGS)，NGS可以对数百万个DNA进行并行测序，延续了Sanger测序的部分技术思路[4]。目前，罗氏（Roche）公司的454测序仪、Illumina公司的Solexa分析仪以及ABI公司的SOLiD测序仪是主要测几个测序平台。不同平台测序技术的核心步骤基本一致，主要包括（1）模板制备，如核酸的提取；（2）文库制备，包括克隆扩增；（3）测序、数据分析比对[5]。2005年，罗氏推出了它的454测序技术，它主要采用了焦磷酸测序技术，即检测核苷酸结合的副产物焦磷酸盐，以识别特定碱基是否被纳入DNA链中[6]。主要步骤是将待测DNA样品打断成长度为400-700bp的单个DNA片段后，使得片段连接至衔接子构成DNA文库，然后通过乳液PCR（EmulsionPCR）进行片段扩增，测序时在特质的PTP平板上将磁珠固定住，启动后每次向PTP平板中加入一种dNTP，而后对DNA合成反应进行化学检测，当待测核苷酸掺入合成链时，利用光反应检测焦磷酸盐的释放，最后通过计算机处理光信号从而检测出样品的核酸序列。Illumina是二代测序技术中运用较为广泛的一个平台，主导着整个测序市场，其下的Solexa测序仪主要采用可逆终止化学反应的原理，是基于一种称为“桥式扩增”的技术[7]。它将片段化的DNA碎片末端连接至两个固定的接头，构成单链DNA测序文库，然后进行桥式PCR扩增以形成包含克隆DNA片段的簇。每个可逆终止子核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP）在3'-OH基团处受到保护，并包含可裂解的荧光染料。在合成过程中，在脱氧核糖核苷酸被添加到合成链上后，洗脱掉游离的dNTP和DNA聚合酶，并释放出荧光信号，最后使用CCD相机进行成像捕获和记录，每一个循环按顺序测定序列中的一个碱基。1.2三代测序的原理和分类与第二代测序方法相比，第三代测序技术旨在对长DNA和RNA分子进行测序，并且测序也无需进行PCR扩增环节，在检测时间方面有巨大提升。目前在该领域商业化的技术领先者包括PacBio公司的单分子实时测序（singlemoleculereal-time，SMRT）技术和OxfordNanoporeTechnologies（ONT）公司的纳米孔单分子技术[8]。SMRT技术的单分子测序和长读长主要是通过零模波导孔和荧光标记脱氧核苷酸实现的，纳米级的零模波导孔能够包含一个DNA聚合酶和一条样本DNA链，当在DNA链上探测到被荧光标记的脱氧核苷酸时，显微镜就实时记录其荧光强度，根据不同荧光信号标记从而鉴定DNA链上的核苷酸分子类别，从而计算出待测样品的序列[9]。PacBioSMRT测序技术之下有RSⅡ和Sequel两种测序平台，在不同的范畴内发挥效用。2.二代测序在新生儿遗传病筛查中的应用2.1NGS在无创产前筛查中的应用2.1.1胎儿染色体非整倍异常在胎儿染色体非整倍异常中最常见的是由配子发生过程中的不相交引起的21、18和13号染色体的三体性引起的。目前，国内主流的三大NIPT平台为：达安DA8600、贝瑞和康NextSeqCN500以及华大基因的BGlSEQ500。大量数据研究证明NIPT对于13、18、21号染色体拷贝数异常的检测特异性均大于99.9%；T21在检测敏感性方面最高可达到99.5%，T18为93.1%，T13为92.7%，敏感性略低[11]。而侯伟、周红辉[12]等人通过选取2018年1月16日-2020年6月30日在解放军总医院第一医学中心的孕妇，结果分析后显示NIPT整体的特异度为97.61%，阴性预测值97.20%，诊断符合率95.16%。结果存在一定的不确定性，例如存在一部分NIPT显示低风险但侵入性产前筛查显示异常的人群，其中主要包括胎儿微缺失重复、嵌合体、杂合性缺失、单亲二倍体的染色体异常。该专家组认为NIPT对染色体非整倍异常的检测具有高敏感性，不推荐将检测范围扩展至微缺失重复以及其它染色体异常。2.1.2胎儿染色体微缺失和微重复染色体微缺失微重复一般会导致胎儿智力和身体上的异常，张春花、贺权泽[13]等专家检测了NIPT的主流三大平台DA8600、CN500和BGlSEQ500对23170例孕妇外周血样本进行胎儿染色体微缺失和微复制的筛查，结果表明三大平台间的阳性预测值无差异，而筛查阳性率存在差异，BGlSEQ500平台的阳性筛查率为0.58%，高于0.38%的DA8600和0.26%的CN500。该研究表明，用于唐氏综合症筛查的NIPT对于染色体微缺失和重复具有一定的预测价值，同时检测人员和临床医生也要充分意识到NIPT在微缺失微重复的检测中可能存在假阴性或假阳性的情况，对于NIPT结果阳性的孕妇，临床医生还需要参考额外产前诊断项目才能进行确诊，因此也有研究认为对于染色体微缺失微重复的妊娠结局通过NIPT无法在产前可靠地预测[14]。2.1.3单基因病检测单基因疾病即是由一对等位基因控制的遗传疾病，因组成基因的碱基发生改变，导致基因序列异常或者表达异常。软骨发育不全是第一种通过NIPT检测并被引入临床实践的单基因疾病[15]，尽管NIPT已广泛用于染色体非整倍性疾病的检测当中，但将其用于诊断单基因疾病的临床应用相对较少，这是由于当前技术下很难区分母体血样中胎儿和母体等位基因，尤其是在多个遗传基因座上，因此这些技术障碍限制了使用cfDNA筛选胎儿单基因疾病的广泛实施[16]，随着基因组测序技术的不断发展，可能需要克服诸如精确鉴定胎儿等位基因之类的挑战。2.2NGS在产后单基因病筛查中的应用2.2.1SNV、InDel的检测单核苷酸变异和插入缺失（<50bp）构成了人类基因组中的绝大多数基因变异的情况。WES和WGS可以准确识别单核苷酸变体（SNV）和InDel[17]，当SNV和Indel发生于基因组外显子区域或者明确的靶区时，可以选择全外显子测序或者靶向测序，而当SNV和InDel发生在全基因组时，全基因组测序更为合适[18]。对于临床诊断较为明确、致病基因有限或突变机制复杂的单基因病，应用TGS能够保证足够的测序深度，不仅能够反映SNV、InDel，还能一定程度上检出CNV等复杂致病变异，使临床检测具有更高的针对性;对于临床症状不典型、难以确诊的遗传病，WES较TGS有更大的覆盖范围，能从全外显子组的水平对基因功能区进行评估，有利于快速地诊断。例如段丽芬[19]等人使用全外显子组测序筛选腓骨肌萎缩综合征的先证者中的致病基因，并进行生物学分析，根据人类外显子数据库的数据，东亚人群中并未发现MFN2基因c.1090C>T突变，但经WES技术的检测以及计算机辅助预测，认为在该位点上存在潜在功能影响，该位点存在有害的致病性。2.2.2CNV的检测拷贝数变异其实也是作为结构变异中的一部分，异常的DNA拷贝数变化是许多人类疾病的重要分子机制。Pfundt等[20]对2603例遗传性疾病患者的WES数据进行分析，最终确定123个致病性CNV，说明WES和WGS确实可以从基因组全局水平去提示基因组大片段CNV，提高致病位点检出率，但是在CNV中还存在着由许多人类疾病基础的非等位基因同源重组形成的复杂性CNV，NGS并不是最佳的检测手段，对于此类CNV联合性检测更具有效用，可以选择染色体微阵列分析(CMA)或CNV-Seq来确定发生拷贝数变异的染色体，进一步的断点分析可以联合WGS或者三代测序的技术进行检测。DarrelWaggoner[21]等人使用CMA技术评估神经发育障碍和先天缺陷，结果显示对于患有神经发育障碍和先天缺陷的患者，在进行CMA检测后存在遗漏的细胞基因组异常，例如平衡重排、部分或整个染色体非整倍性的镶嵌等，因此针对此类拷贝数异常遗传性疾病，在分析技术的选择上十分重要。3.三代测序在新生儿遗传病中的应用由于NGS短读法的技术特性，难以通过NGS检测结构变异、重复元件、鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量高的序列[22]。基于NGS的这些缺点，极大地推动了研发新技术提高准确性和减少遗传疾病诊断时间的进程，由PacBio和ONT引入的三代测序的功能允许实时长读实时测序，并且在构建文库时具有较低的比对和定位错误[23]，因此对于特殊致病机制的单基因病，例如SV、动态突变的检测，可以采用三代测序以弥补NGS的缺陷。当然三代测序本身也能在一些非整倍体异常的情况下使用，并且达到快速检测的效果，但就检测成本而言适用性不是很大[24]。3.1三代测序在单基因病中的应用3.1.1动态突变的检测动态突变是由DNA中重复单位拷贝数发生扩增而导致的突变，第一个被发现由动态突变引起的单基因遗传性疾病是脆性X综合征（fragileXsyndrome，FXS），其发病机制是由于X染色体上FMR1基因5'端非翻译区三核苷酸重复序列（CGG）n动态变异引起[25]，FMR1基因5'端非翻译区存在大量的GC碱基片段的重复，二代测序技术的短读长特性难以在该区域发挥作用，而Loomis[26]等专家采用SMRT技术对FXS患者FMR1基因5'端非翻译区进行检测，完成了对(CGG)n重复片段鉴定，该重复片段长达2kb，由此可见三代测序技术在重复碱基区检测序列的优势。3.1.2结构变异（SV）的检测结构变异在遗传病中起到重要作用，SV包括删除，插入，倒位，移动元件易位，易位，串联重复和拷贝数变异等形式。SV可以通过改变基因剂量，破坏基因功能或重新排列调节元件或基因来改变基因组背景来发挥功能作用[27]。SV被认为是最难以从短读数据中可靠检测出的变异形式，因此单分子和实时测序在SV中显示出了更好的发现结构变异事件的能力。Merker等[28]在初次尝试使用IlluminaHiSeq测序技术对Carney综合征进行研究，但没有发现与该综合征致病相关的基因突变，随后改用了PacBio的SMRT测序技术，SMRT技术检测出了6971个缺失和6821个插入，通过筛选获得了1个杂合子缺失与Carney综合征中相关基因PRKAR1A的第1个编码外显子重叠的情况，该结果表明此杂合子的缺失与Carney综合征的致病有关，证实了SMRT技术在较为复杂的结构变异中的适用性。4.总结与展望随着基因组测序技术和基因组数据分析的不断发展，新生儿遗传学筛查的领域正在迅速扩大，对筛查胎儿遗传性疾病的选择方案也愈加丰富。目前二代测序方法在分子检测领域的发展中已经趋于成熟，三代测序技术发展迅速但仍处于研究开发的状态中，他们存在各自的有优缺性。二代测序技术的优势在于它的高通量性，对于检测低频变异的片段具有较高的灵敏度，同时在较多样品量的情况下，具有更快的周转时间以及较低的成本去完成检测工作，但二代测序也面临着较大的限制，其短读长特性限制了NGS在基因的重复区域或复杂变异中的检测效果。三代测序技术更长的序列读取长度且无需进行PCR扩增是其最主要的优势，同时三代测序的样品制备时间及测序运行时间较NGS相比来得更短，部分平台例如ONT公司的MinION测序仪还有较高的便携性和实时测序能力，但是三代测序的成本昂贵，限制了其大规模的应用于临床检测，测序错误率也相对较高，只有通过对同一样本进行反复测序来纠正测序结果，也会因此而增加耗费。另外生物学信息分析软件的发展也尤为重要，三代测序不及二代测序发展全面，信息分析技术还在研究开发的状态，积累的数据也较少。总而言之，新生儿遗传性疾病的筛查对社会人口结构的优化、对公共卫生的发展以及个人的身体素质都具有重要意义，希望通过本文能够优化临床诊断和遗传咨询时技术方法的抉择。同时，也为后续的研究者提供研究方向的思考，期望未来更多新生儿遗传性疾病的筛查从产后诊断向产前筛查发展，扩大无创产前筛查的检测范围，提高无创产前DNA筛查的社会普及程度，2018年我国新生人口是1500万左右，而全年NIPT的样本量约为400万，NIPT检测只覆盖我国27%的人口[30]，希望在未来该数据能有明显增长。针对二、三代测序的发展而言，三代测序技术的检测范围目前基本囊括二代测序的适用范围，甚至解决了二代测序无法准确检测的复杂序列，因而期望未来二、三代测序技术能够相辅相成结合并行，以此来降低三代检测成本的同时，也能利用三代测序提高诊断准确率，逐步向更大规模的临床早期筛查进发，为出生缺陷的防控尽一份力，推动发展精准医学，优化人口结构。参考文献[1]欧阳健为.浅谈基因测序的重大意义及应用前景[J].神州，2019(5)：239-239.[2]张伟然，赵正言.新生儿疾病基因筛查研究进展[J].中华儿科杂志，2020，58(12)：1033-1037.[3]马潞林，宋一萌，葛力源.基因测序技术的发展与临床应用概述[J].重庆医科大学学报，2018，43(4)：7-9.[4]吴爽，强荣，张瑞雪.高通量测序技术在新生儿疾病筛查中的应用进展[J].中国妇幼健康研究杂