色谱联用技术

关于色谱联用技术课件7.1色谱联用分析技术概述1.联用技术的必要性每种分析方法都有其特长和局限性。局限性来自两个方面：

原理方面，不可逾越；技术方面，可以改进、发展。在线联用不仅能取长补短，而且还具有协同作用，获得两种技术单独使用时所不具备的某些功能。第2页,共82页，星期六，2024年，5月2.实现在线联用的关键

硬件接口（hardwareinterface）

用于协调联用的两种仪器的输出和输入之间的矛盾，使两种仪器连接成一个整体。第3页,共82页，星期六，2024年，5月3.色谱联用技术发展现状色谱：分离光谱：结构鉴定两者联用，不仅可以对混合物中的各未知组分进行定性，也可用于定量分析。GC-MS,GC-FTIR,LC-MS,LC-FTIR,LC-NMR,LC-ICP-AES…第4页,共82页，星期六，2024年，5月7.2气相色谱－质谱联用

GC-MS第5页,共82页，星期六，2024年，5月

1.气相色谱与“四谱”工作条件的适应性第6页,共82页，星期六，2024年，5月2、气质联用接口（协调输出/输入的矛盾）工作气压不匹配是实现GC－MS联用的主要困难。GC柱的输出为100kPa，而MS离子源在小于10－3Pa的条件下工作。接口的作用是将GC流出的载气气压降低到MS能够接受的程度，并将样品送入MS离子源接口的类型喷射式分子分离器，早期，适合于填充柱；通过传输线直接连接，适合于毛细管柱。第7页,共82页，星期六，2024年，5月喷射式分子分离器的结构作用：①降低气压；②浓缩样品。第8页,共82页，星期六，2024年，5月出口气相色谱高真空泵传输线化学工作站软件（计算机）离子源质量分析器机械泵检测器质谱3.仪器结构第9页,共82页，星期六，2024年，5月GC-MS组成：

GC：低流失毛细管柱载气必须用>99.999%的氦气

离子源：电子轰击源、化学电离源

MS：四极杆质谱仪、离子阱、飞行时间质谱仪

接口：细口径毛细管柱——通过传输线直接连接粗口径——分流

数据系统：计算机数据库

真空系统：分子涡轮泵第10页,共82页，星期六，2024年，5月4、质量分析器四极杆质量分析器飞行时间质量分析器离子阱质量分析器磁质量分析器傅里叶变换离子回旋共振质量分析器多个质量分析器的串联（串联质谱联用）第11页,共82页，星期六，2024年，5月1.四极杆质量分析器

（QuadrupoleMassFilter）+ElectronBeamABCSampleinIonBeam对于给定的直流DC和射频电压RF

，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将DC和RF以固定的斜率变化，实现质谱扫描功能。

第12页,共82页，星期六，2024年，5月特点：

（1）结构简单，体积小，价格便宜

（2）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用

（3）可串联使用

（4）无需狭缝分离，灵敏度高

（5）质量分辨率不高(小数点后1位）

（6）检测的m/z范围小第13页,共82页，星期六，2024年，5月2.离子阱质量分析器(iontrap)特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；第14页,共82页，星期六，2024年，5月特点：

（1）结构简单，体积小，价格低

（2）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用

（3）自身可做多级，有利于定性

（4）质量分辨率6000-9000（5）检测的m/z范围小第15页,共82页，星期六，2024年，5月3.飞行时间质量分析器(TOF)具有相同动能、不同质量的离子，其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。第16页,共82页，星期六，2024年，5月特点：

（1）结构简单，体积较大，价格略贵

（2）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用

（3）灵敏度高（4）质量分辨率高（5）检测质量无上限第17页,共82页，星期六，2024年，5月气相色谱-四极杆质谱仪第18页,共82页，星期六，2024年，5月第19页,共82页，星期六，2024年，5月4.气质联用系统提供的信息GC-MS-Computer的工作过程：GC：各组分被色谱柱分离，随时间变化依次从柱子流出，通过接口进入MS。MS：连续扫描MS图，每扫描一张MS图需花费约零点几到几秒钟。总扫描时间＝(扫一张图谱的时间)×扫描次数计算机：将得到的所有MS数据存储起来，供下一步的处理和输出。第20页,共82页，星期六，2024年，5月(1)总离子流图（TIC）质谱仪检测到的所有离子信号（不分其质荷比）的总和对时间t作图相当于气相色谱图。没有组分通过时为基线；当组分流出时，即出现峰。记录方法：TIC检测器；计算机采集和存储连续、重复扫描的信息，然后进行数据处理。第21页,共82页，星期六，2024年，5月TIC图中的每一个峰代表一个组分；峰的位置就是该组分的色谱保留时间；峰面积与组分的相对含量有关。某种天然蜡质衍生物的GC－MS总离子流图第22页,共82页，星期六，2024年，5月(2)每个组分的质谱图可从质谱图获得组分的分子量和分子结构信息。谱库检索根据NIST，INCOS，PBM三种算法，将未知物图谱与谱库中的标准图谱比较，匹配度越高，可信度越高88101396第23页,共82页，星期六，2024年，5月序号 化合物名称 序号 化合物名

1 十六碳酸 12 二十九碳烷

29,12-十八碳二烯酸 13 三十碳烷

3 十八碳酸 14 二十六醇乙酸酯

4 二十四碳烷 15 三十一碳烷

5 二十醇乙酸酯 16 结构未定*

6 二十五碳烷 17 三十二碳烷

7 二十六碳烷 18 二十八醇乙酸酯

8 二十二醇乙酸酯 19结构未定*

9 二十七碳烷 20 三十四碳烷 10 二十八碳烷 21 三十醇乙酸酯 11 二十四醇乙酸酯 22～25 结构未定* 由GC－MS确定的某天然蜡衍生物的成分第24页,共82页，星期六，2024年，5月(3)质量色谱图（提取离子流图）以指定质荷比的离子强度（而不是总的离子流强度）对时间t（或扫描号）作图。是计算机进行数据处理得到的图。优点：可在复杂混合物的TIC图中,迅速找到所需检测的化合物或同系物。第25页,共82页，星期六，2024年，5月某天然蜡衍生物的总离子流图和质量色谱图（用于寻找一类成分）第26页,共82页，星期六，2024年，5月1.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100质量色谱图总离子流图（用于寻找微量成分）第27页,共82页，星期六，2024年，5月5.GC-MS的应用

凡是能用气相色谱分析的试样，均适合于GC-MS分析，如环境污染物的分析香精、香料的成分分析和质量评价中草药的挥发性成分鉴定药物及其他化工产品的分析毒物、毒品及违禁药物的鉴定和检测等等。第28页,共82页，星期六，2024年，5月（1）GC-MS定性分析分析条件的设定

GC条件：同普通CGCMS条件：扫描方式，扫描范围，扫描速度,灯丝电流，倍增器电压等定性分析

进样，电离，质谱数据的采集，谱图检索第29页,共82页，星期六，2024年，5月GC-MS定量分析依据用总离子色谱图定量用质量色谱图（提取离子色谱图）定量用选择离子色谱图定量（SIM，选择离子监测）

对串联质谱还可以用MRM（SRM，反应离子监测）定量优缺点…GC-MS定量分析方法：内标法，外标法，归一化

（2）GC-MS定量分析第30页,共82页，星期六，2024年，5月有机氯农药的GC-MS总离子流图第31页,共82页，星期六，2024年，5月第32页,共82页，星期六，2024年，5月7.3液相色谱-质谱联用技术

LC-MS第33页,共82页，星期六，2024年，5月一、实现LC-MS的困难

1.LC流动相对MS工作条件的影响1ml溶剂气化生成500-1300ml的蒸气，而质谱仪只能接受10ml/min气体流量。有时流动相中含难以挥发的缓冲盐2.质谱离子源温度、电离方式不适宜液相色谱所分析的样品。第34页,共82页，星期六，2024年，5月二、接口系统1.脱溶剂2.使被测物电离第35页,共82页，星期六，2024年，5月1.粒子束接口（Particle-Beam,PB）根据流体力学原理，利用样品与溶剂动量的不同将它们分开形成气溶胶→脱溶剂→动量分离得到的谱图与电子轰击质谱图非常相似，可利用标准谱图检索现少使用第36页,共82页，星期六，2024年，5月EIPB第37页,共82页，星期六，2024年，5月2.电喷雾电离（ESI，接口+软电离技术）RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets试样离子准分子离子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他离子第38页,共82页，星期六，2024年，5月电喷雾电离，Electrospray流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘。气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子第39页,共82页，星期六，2024年，5月特点：是LC-MS的基本配置接口是一种软电离方式，适合稳定性差、极性大、分子量大的物质的电离。主要生成准分子离子（[M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+等），生物大分析产生多电荷离子。灵敏度高不能进行谱库检索不适用于非极性化合物的分析第40页,共82页，星期六，2024年，5月对于大分子化合物，电喷雾产生多电荷离子，相对分子质量Mr计算方法如下：选相邻峰，电荷n，n+1m1=(Mr+n+1)/(n+1)m2=(Mr+n)/n第41页,共82页，星期六，2024年，5月分子量约为12200的细胞色素的ESI质谱图第42页,共82页，星期六，2024年，5月3.大气压化学电离(AtmosphericPressureChemicalIonization,APCI)电离主要生成溶剂离子样品分子与溶剂离子反应生成离子簇离子去簇后送到质谱计中MS放电针喷雾LC第43页,共82页，星期六，2024年，5月热喷雾(100-120

C)，化学电离;适用于弱极性和热稳定化合物分析.第44页,共82页，星期六，2024年，5月特点：化学电离，软电离技术，产生的碎片很少适用于弱极性、分子量小（<2000Da）和热稳定化合物分析灵敏度高

ESI的补充技术第45页,共82页，星期六，2024年，5月ESIAPCI硬件毛细管有几千伏高压放电针

电离液滴中的离子蒸发类似于化学电离原理属于液相电离属于气相电离应用*适合的LC流速为

0.2～2ml/min0.2～0.3ml/min*极性和离子化合物极性较小的化合物*可产生多电荷离子产生单电荷离子第46页,共82页，星期六，2024年，5月

LC-MS(四极杆)联用仪器结构示意图第47页,共82页，星期六，2024年，5月LC-MS(离子阱)联用仪器结构示意图第48页,共82页，星期六，2024年，5月医药、临床：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析、疾病诊断生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物化学：有机合成物三、液质联用的应用第49页,共82页，星期六，2024年，5月%%MultiView--©1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%%%MultiView--©1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%%%MultiView--©1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%.2468101214Time,min200400600800100012001400160018002000220024002600Intensity,cpstanshinoneItanshinoneIIAcryptotanshinonedihydrotanshinoneTICSpectrumofFourDiterpenoidsofRadixSalviaeMiltiorrhizae丹参中四种丹参酮的lc-ms-ms测定第50页,共82页，星期六，2024年，5月LC-MS-MSMRMChromatogramsofRadixSalviaeMiltoirrhizaeSample反应离子监测第51页,共82页，星期六，2024年，5月7.4高效液相色谱-核磁共振联用技术LC-NMR第52页,共82页，星期六，2024年，5月一、HPLC与NMR的比较及联用的困难

HPLCNMR分析对象

有机物样品状态

液态操作温度

室温扫描时间

大体相同操作方式连续流动间歇灵敏度

g～ngmg溶剂普通氘代溶剂第53页,共82页，星期六，2024年，5月二、问题的解决

主要取决于核磁共振技术的提高和发展（1）灵敏度仪器方面高频仪器的使用：NMR的信噪比与磁场强度的平方成正比，800MHz(18.79T)与100MHz(2.35T)仪器相比，信噪比增大约64倍。用新技术提高信噪比：软件滤波，消噪技术第54页,共82页，星期六，2024年，5月

操作参数的影响提高LC柱的负载量内径4.6mm色谱柱，合适的负载量为100g。采用停流技术增加检测的有效时间（多次扫描累积）。把射频线圈直接绕在流通池壁上，减少死体积。（2）溶剂使用氘代溶剂使用脉冲序列等溶剂抑制技术第55页,共82页，星期六，2024年，5月采用WET序列进行溶剂峰抑制的实例乙腈溶剂峰第56页,共82页，星期六，2024年，5月三、联用方式实验布局泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组成的LC系统，通过一条2-2.5m的特制毛细管连接到NMR液相探头上，探头底部有阀控制NMR测定方式。第57页,共82页，星期六，2024年，5月第58页,共82页，星期六，2024年，5月

液相探头带有一个流动腔；射频发射线圈垂直固定在流动腔的玻璃管上；接受线圈平行于玻璃管；流动腔不能旋转，NMR测定分辨率较差。第59页,共82页，星期六，2024年，5月联用模式

连续流动模式LC的载液带着试样组分连续不断流入NMR的流动腔，NMR仪器用溶剂峰抑制技术采集NMR谱图，得到化学位移－LC保留时间的假二维谱。得到的谱图分辨率和信噪比差。停流技术（时间切割谱）当色谱峰的最高点到达流动腔的检测位置时，关闭液相探头底部的进口阀，同时LC的泵停止工作，NMR进行采样直到获得满意的谱图。第60页,共82页，星期六，2024年，5月

峰存储模式(peakparking)

实际上是一种离线模式。由LC流出的峰存储在毛细管回路中，然后通过适当的阀系统依次送入NMR探头中进行NMR测定，LC分析过程不中断。体系中有三个阀，12个存储峰的毛细管回路，整个过程由计算机控制。第61页,共82页，星期六，2024年，5月

峰存储模式第62页,共82页，星期六，2024年，5月三种联用模式的比较流动模式：灵敏度和信噪比差，适合于测定富核，如1H、19F、31P和富集的13C、15N；对1H最小检测量（16次累加）为10g（500MHz），30g（300MHz）；停流模式：有较好的灵敏度，可测1H、13C、15N等。最小检测量1H为1g；峰存储模式：与停流模式类似。第63页,共82页，星期六，2024年，5月应用实例耐哌地尔杂质的检测第64页,共82页，星期六，2024年，5月7.5色谱-傅立叶变换红外光谱联用(GC-FTIR)第65页,共82页，星期六，2024年，5月1.GC-FTIR联用概述（1）GC-IR联用的作用MS一般难于区分同分异构体，IR是很好的补充。（2）实现GC-IR的困难

扫描速度、灵敏度、物理状态均不匹配

（3）解决方法

FTIR：具有信噪比好、扫描速度快等优点，与GC的匹配性大大提高。

物理状态：测气体红外。第66页,共82页，星期六，2024年，5月2.GC-FTIR系统FT－IR光学台数据系统GCMCT检测器GC－FT系统的示意图光管第67页,共82页，星期六，2024年，5月第68页,共82页，星期六，2024年，5月GC-FTIR接口示意图第69页,共82页，星期六，2024年，5月接口--光管用硼硅玻璃制成；两端装有KBr盐窗，红外干涉光可以通过；内壁镀金，有高的反射率，红外干涉光在其中多次反射，增加光程以提高灵敏度；可加热，保证GC流出物不在此冷凝；适当的容积，以获得最佳分辨率和灵敏度；尾吹装置：用以解决毛细管GC柱与传输线（i.d.2mm）、光管(1mm)中线速变化的问题。即柱外效应的问题第70页,共82页，星期六，2024年，5月3.GC-FTIR提供的信息(1)三维实时显示图波数时间吸光度第71页,共82页，星期六，2024年，5月(2)化学图（Chemigram）(官能团色谱图)指定官能团频率范围对时间所作的图；是一个“色谱图”，每个峰