DB3717T 23-2024 植物种苗组培技术规程

ICS65.020.20CCSB05

3717菏 泽 市 地 方 标 准DB3717/T23—2024植物种苗组培技术规程Technicalcodeofplantmicropropagation2024-06-28发布 2024-07-28实施菏市市监督理局 发布DB3717/T23DB3717/T23—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1培养基的配制 1母液的配制 1植物接种培养基 1植物材料的选择与外植体灭菌 2植物组培苗外植体母本圃种植 2植物材料选择时间 2植物材料部位的确定和选择 2仪器和植物外植体材料的灭菌 2仪器及培养基的最少消毒时间 2仪器和培养基与外植体消毒 2植物外植体的无菌操作 3组织培养苗试管培养 3愈伤组织诱导分化培养 3增殖继代培养 3植物组织生根培养 3组织苗炼苗移栽 3移栽穴盘苗的管理 3包装与运输 3包装 3运输 4附录A（规范性） 培养基母液配制 5附录B（规范性） 不同植物品种常用培养基配法 6附录C（规范性） 生物调节物质母液的配制 7附录D（规范性） 植物不同器官消毒顺序 9附录E（规范性） 器皿及培养基的最少灭菌时间 10附录F（规范性） 仪器和培养基的消毒压力和温度与排气的关系 11附录G（规范性） 植物外植体材料的灭菌常用消毒剂效果 12附录H（规范性） ABT生根粉种类及使用浓度 8附录I（规范性） 不同植物激素种类与使用浓度 13前 言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由菏泽市林业局提出、归口并组织实施。本文件起草单位：菏泽市林业科学研究院、菏泽市林业产业发展中心、菏泽市自然资源和规划局、菏泽市行政审批踏勘评审中心、菏泽林业技术服务中心、郓城县阳光花卉有限公司。﹑王金国﹑任升﹑李艳玲﹑﹑罗松﹑李新艳﹑刘金锦﹑王海燕﹑苏丽娟﹑张淼﹑王传印﹑左传侦。DB3717/T23DB3717/T23—2024PAGEPAGE10植物种苗组培技术规程范围本文件规定了植物种苗组培的术语和定义、培养基配制、接种操作流程、包装和运输。本文件适用于菏泽市植物种苗的组培。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T1965-2003 日光温室和塑料大棚结构与性能要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件。种苗germchit种子播种发芽后，一般生长到2对真叶，适合移植到其它环境生长的幼小植株。组培苗tissuecultureseedling利用植物器官、组织、细胞、原生质体，在无菌和适宜的人工条件下，培育植株。培养基的配制母液的配制MS培养基母液配制参见附录A。不同植物品种常用培养基配制方法见附录B。配制好的母液瓶上分别贴上标签，注明母液号﹑配制倍数﹑日期及配制1L培养基时应取的量。定容后贮藏于冰箱中保存备用。生物调节物质母液的配制生物调节物质母液的配制见附录C，定容后贮藏于冰箱中保存备用，若贮藏时间过长，发生乳析现象应震荡均匀后使用。植物接种培养基配制先将贮藏的母液依次按顺序摆放好,再准备好各种玻璃器皿﹑量筒﹑烧杯﹑吸管﹑玻璃棒﹑漏斗等。称好琼脂﹑蔗糖，配好生长调节剂。准备好蒸馏水和封瓶口用的绳子﹑封口纸。根据培养基的配方分别用吸管吸取培养基母液，把依母液的浓度量取规定量滴入量筒中。加完母液依培养基的配方计算出所需生长调节剂的量，吸取滴入量筒中，定容到1000ml所需的体积。把定容的培养基液倒入含有0.6%～1.0%琼脂﹑1%～5%蔗糖的加热容器内继续加热，不断搅拌，直至使琼脂完全溶解。接种培养基的pH值控制在5.5～6.0，用0.1N～1N的HCL(NaOH)对培养基pH值进行调整。分装趁热分装培养基，一般占试管、三角瓶等容器1/3～1/4左右为宜。注意避免培养基粘到瓶壁上，防止感染杂菌。消毒分装好的培养基、无菌水、接种工具放入高压消毒锅中(灭菌压力0.11MPa～0.14MPa,120℃～126℃,15min～20min)，不要装入太满影响蒸汽循环。高压灭菌后培养基取出，放置凝固后接种使用。植物材料的选择与外植体灭菌植物组培苗外植体母本圃种植将性状优良的组培苗种植在温室内,加强水肥管理,使植株生长健壮,减少植物体表面的细菌﹑真菌﹑微生物的数量。植物材料选择时间3月植物外植体形成愈伤组织最多，7月次之，最次12月愈伤组织形成最少，确定最佳时间为3月份。植物材料部位的确定和选择根据组织培育目的，可选择根﹑茎﹑叶等组织和器官，一般选择植物的茎段作为植物培育外植体。植物不同器官灭菌顺序见附件D。仪器及培养基的最少消毒时间见附录E。器皿和金属器械灭菌采用高温高压蒸汽灭菌法，器皿、金属器械和培养基的最少灭菌时间参见附录。仪器﹑培养基与外植体消毒仪器﹑培养基的消毒压力和温度与排气的关系见附录F。植物外植体材料的灭菌常用消毒剂效果见附录G。无菌室的灭菌接种前一天,高锰酸钾与甲醛混合产生的雾化气体封闭无菌室灭菌，并紫外灯照射30min。植物外植体的无菌操作植物组织的整个接种过程均需无菌操作。将灭菌冲洗干净的嫩梢0.5cm～1cm小段放在超净工作台无菌的环境中,用左手镊子夹住茎尖,右手用解剖刀除去幼芽的外面部分,切取顶端0.5mm～1mm大小的芽接种在灭菌的培养基中进行愈伤组织分化培养，可将病毒除去。组织培养苗试管培养愈伤组织诱导分化培养MS+6-BA0.5mg/L+2·4-D1mg/L+KT0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH值为6.0左右，培养室温25±2℃，每天12h光照。（不同植物激素使用种类与浓度见附录H）。增殖继代培养愈伤组织脱分化培养后，切下形成的小芽，接种在MS+6-BA2mg/L+IAA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH6.02∼4周器官分化,形成纤弱小芽。6.2.2 芽长至1∼2cm时切下转到MS+6-BA（2mg/L）+KT（0.3mg/L）+IAA（0.5mg/L）+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH值为6.0左右的培养基上,用于壮苗。随着继代增殖培养逐渐减少6-BA的用量，最后一次继代增殖培养可以加少量的IAA﹑NAA﹑IBA便于外植体的复壮与生根。植物组织生根培养生长健壮、适于生根的丛生无根苗,接种在1/2MS(大量元素减半)+NAA0.2-0.5mg/L+IBA2.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,PH值6.0左右的培养基上，培养30～40天,基部切口处产生新根。组织苗炼苗移栽1～55cm～8cm23℃～25℃的温室中接受自然光的照射，3～6将清洗干净的试管苗在50%可湿性粉剂多菌灵30～70倍液与ABT生根剂液中浸泡（ABT生根粉种类与浓度见附录I），定植在混合基质中，混合基质配方是泥炭：蛭石：珍珠岩（2：1：1）。注意覆盖小拱棚及遮阴网，避强光且保湿；移栽前试管苗浇灌0.5g/L的多菌灵溶液进行基质消毒。移栽穴盘苗的管理15℃～28℃，相对湿度控制在80%～90%，光照强度控制在5000LX～10000LX～1500倍的多菌灵或百菌清等杀菌剂一次。包装与运输包装试管苗及穴盘苗包装:将代有试管的组培苗装在泡沫箱里,外面在用纸箱包装；穴盘苗连同穴盘放在纸箱里，层层放置，保持立体空间。每箱贴上标签,注明品种﹑等级﹑规格﹑数量、产地等放在托盘上运输。运输及时冷藏运输,避免极端天气。培养基母液配置见表A.1。

附 录 A（规范性）表1.1培养基母液配置母液编号化合物名称规定量扩大倍数称取量母液体积(ml)1L培养基吸取量(ml)母液1KNO₃190010190001000100NH4NO₃16501016500S4·2O370103700KH2PO4170101700al2·2O440104400nS4·2O22.31002230nS4·2O8.6100860H3BO36.2100620母液2nS4·2O22.31002230100010nS4·2O8.6100860H3BO36.2100620IK0.8310083aMoO4·2O0.2510025uS4·2O0.0251002.5CaCl26H2O0.0251002.5母液3a-EDA3730010005FeSO4•7H2O27800母液4甘氨酸2.05010050010维生素B10.45020维生素B60.55025烟酸0.55025肌醇100505000附 录 B（规范性）不同植物品种常用培养基配法不同植物品种常用培养基配法见表B.1。表1.2不同植物品种常用培养基配法名称愈伤组织诱导分化培养基继代增值培养基生根培养基泡桐+6-B10L+T.mLS+-B2./+NA02L康乃馨S+-B05/+2·-DgLS+-B2./+NA05L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA0.5mg/L苹果+6-B05L+T.mL+6-A05L+A3/L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA1.0mg/L满天星+6-B05L+T.mL+6-A20L+T.gL1/2MS+NAA0.5mg/L猕猴桃+6-B30L+T.mLMS+IBA0.5mg/L+ZT2.0mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+0.4~0.5%活性炭水仙MS+ZT2.0+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/LMS+NAA2.0mg/L+IAA0.5mg/L1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L人参+6-B01L+T.mL+6-A01L+BA.mL1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L甜橙+6-A20L+AA.mL+6-A10L+BA.mL1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.4mg/L菠萝+6-A20L+AA.mLS+-B0./+IA1LNAA.mL1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L蝴蝶兰1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L+0.5%活性炭附 录 C（规范性）生物调节物质母液的配制生物调节物质母液的配制见表C.1。表1.3生物调节物质母液的配制名称溶质浓度(mg/ml)称取量(单位:mg)母液体积(ml)IAA95%酒精少量0.110100NAA95%酒精少量0.110100IBA95%酒精少量0.110100KT1NHCL少量0.110100-BA1NHCL少量0.110100ZT95%酒精少量0.110100植物不同器官消毒顺序见表D.1。

附 录 D（规范性）植物不同器官消毒顺序表1.4植物不同器官消毒顺序器官消毒顺序消毒前消毒消毒后备注种子纯酒精浸泡15分钟,用无菌水冲洗1%溴水浸泡5min。无菌水冲洗3次，放在无菌环境中发芽。用幼芽与幼根产生愈伤组织。果实纯酒精迅速清洗2%的次氯酸钠浸泡15min织和种子。获得无菌组织。茎切段洗涤液清洗2%的次氯酸钠浸泡15min无菌水清洗3~5次直接接种在培养基上或切取组织进行培养贮藏器官自来水冲洗2%次氯酸钠浸泡20~30min无菌水清洗3~5次取出消毒材料内部组织进行培养叶片用自来水清洗吸干用洗涤液清洗70%的酒精漂洗;2%次氯酸钠浸泡20~30min无菌水冲洗3次,无菌滤纸吸干。嫩叶﹑叶片平放或扦插在培养基中。附 录 E（规范性）仪器和培养基的最少灭菌时间仪器和培养基的最少灭菌时间见表E.1。表1.5仪器和培养基的最少灭菌时间容器的体积(ml)在121℃下最少灭菌时间(min)20~50157520250~50025100030150035200040附 录 F（规范性）仪器﹑培养基的消毒压力和温度与排气的关系仪器﹑培养基的压力和温度与排气的关系见表F.1。表1.6仪器﹑培养基的压力和温度与排气的关系排气温度(℃)压力(磅)空气的排除量完全排除2/3排除1/2排除1/3排除未排除51091009490721011510910510090151211151121091002012612111811510925130126124121115附 录 G（规范性）植物外植体常用消毒剂效果植物外植体常用消毒剂效果见表G.1。表1.7植物外植体常用消毒剂效果消毒剂使用浓度(%)去除的难易消毒时间(min)效果次氯酸钙9~10易5~30很好次氯酸钠2易5~30很好过氧化氢10~12最易5~15好溴 水1~2易2~10很好硝酸银1较难5~30好抗菌剂4~50中30~60很好附 录 H（规范性）ABT生根粉种类及使用浓度ABT生根粉种类及使用浓度见表H.1。表1.8ABT生根粉种类及使用浓度类别使用浓度.-¹)浸泡时间(h)用处ABT11003~8用于难生根及珍贵植物ABT250~1002~3用于较容易生根的植物ABT30-00