临床微生物检验1

。DNA、放线菌、螺旋体、支真核细胞型微生物(细胞核分化程度高，有核膜、核仁，细胞器完整，包括真菌和原虫)非细胞型微生物(仅有一种核酸类型，包括病毒、亚病毒、朊粒)拮抗外来病原微生物和提供某些营养物的作用。位改变或寄居微生物丛平衡失调，能引起内源性感染。)5.重视和加强与临床的联系践。要是由于处理感染性物质时的操作不当造成的。8.消毒(disinfection)：通过物理或化学方法去除或杀灭大多数微生物的过程。灭菌(sterilization)：通过物理或化学方法杀灭或去除所有微生物的过程。消毒灭菌技术包括：热力(湿热灭菌和干热灭菌)、化学(液体或气体)、辐射(γ辐射和紫外线)、过滤技术。皮肤和软组织感染，眼和结膜感染、子宫内膜炎、产后生殖道感染，胃肠炎、肝炎等。2.临床常见采血指征：1发热(>38。C)或低温(36。C)2寒战3白细胞增多(计数大于12，000109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核的白细胞)4粒细胞减少(成熟的多核白细胞<1000109/L)5血小板减少6皮肤粘膜出血7昏迷，休克8多器官衰竭9CRP告流程1.压滴法(湿片法)→不可有气泡和外溢观察于观察厌氧菌的动力荧光染色、特殊染色(鞭毛染色和荚膜染色)个原理，操作步骤与临床意义复合物不易渗出。革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层薄，含脂质多，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增加，胞内结晶○3等电点学说：革兰阳性菌的等电点(pH2~3)比格兰阴性菌(pH4~5)低，在相同pH的条件下，革兰阳性菌比革兰阴性菌所带的负电荷(高层、斜面、高层斜面、平板)○1需氧培养法(37℃，18~24h)二氧化碳培养法：二氧化碳培养箱和烛缸法厌氧培养法(一)碳水化合物的代谢试验1.糖(醇、苷)类发酵试验(1)原理：不同细菌分解糖(醇、苷)的酶各异，代谢能力产物各不同，有的不分解，有的仅产酸，有的既产酸又产气，利用此特点鉴(2)培养基：0.5~1.0%糖类等，内有指示剂。细菌接种糖发酵管，37℃、24h孵育后观察结果结果判断：有的细菌能分解某些糖产酸产气(AG/+)，有的只能产酸而不产气(A/+)，有的则不能分解糖类(N/-)★2.葡萄糖代谢类型鉴别试验(O/F试验)在无氧环境下不能分解葡萄糖，称为氧化型;在分解葡萄糖的过程中，可以萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。HL培养基(O/F氧化-发酵培养基)h结果O加液体石蜡变色；F有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，两管均变色N氧或无氧的环境中都不能分解葡萄糖，两管均不变色K—开放管变蓝，封闭管不变色3.β-半乳糖苷酶试验(ONPG)(1)原理：具有β-半乳糖苷酶的细菌，可分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)，生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下亦可检出。(2)试剂：0.75MONPG溶液(4)应用：迅速或迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定aβ-半乳糖苷酶，可将乳糖分解糖快速运到细胞内所以需几天乳糖才能被分解。苷水解试验(1)原理：有的细菌可将七叶苷水解成七叶素和葡萄糖，前者与二价铁离子反应，生成黑色化合物(2)培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基(3)方法及应用：肠球菌阳性，其他链球菌阴性★5.甲基红试验(MR)一步分解成甲酸、乙酸、乳酸等PH4.5以下，加入甲基红试剂显红色(阳性)。如果酸进一步转化为其它物质(醇、酮、醛、气体和水)，或丙酮酸按PH在6.2以上，加入甲基红试剂呈黄色(阴性)。★6.V-P试验VP的代谢试验(1)原理：细菌分泌的明胶酶(胞外蛋白水解酶)能分解明胶使明胶失去凝固能力而液化(3)应用：a肠杆菌科细菌鉴别b厌氧菌鉴定c非发酵菌鉴定常用★2.吲哚试验(靛基质试验)成吲哚(靛基质)，吲哚与加入试剂对位二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲酶试验②方法：将待检菌接种于尿素培养基中，培养后出现红色为阳性，不变色(橙色)为阴性 脱氨酶试验羧酶试验★方法及结果：将待检菌分别接种于氨基酸脱羧酶培养基(含葡萄糖、精氨酸或鸟氨酸或赖氨酸，指示剂为溴甲酚紫)和氨基对照管 对照管为黄色，若培养基由黄色变为紫色为氨基酸脱羧酶试验阳性，若仅发酵葡萄糖显黄色者为阴性。测定管由淡桔黄变紫(溴甲酚紫) (三)碳源利用试验枸橼酸盐(丙二酸盐)利用试验 (1)原理：某些细菌能枸橼酸盐(丙二酸盐)为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，将其分解生成碳酸钠，使培养基变为碱性，指 为深蓝色。 用于肠杆菌科细菌属间的鉴定 (四)各种酶类试验★1.氧化酶试验使对苯二胺氧化，生成有色琨类化合物(二甲基为红，四甲基为蓝)。★方法与结果：1)滤纸片法2)菌落法3)试剂纸片法：制成干纸片，便于保存。为保证实验结果的准确性，应设阴、阳性对照菌株。★应用：1)奈瑟菌属阳性、莫拉菌属阳性的鉴定2)肠杆菌科阴性、弧菌科、假单胞菌阳性及其它非发酵菌的鉴别化酶活性★2.过氧化氢酶试验(触酶试验)★注意事项①不宜用血平板上的菌落作试验，以免出现假阳性。②不宜用陈旧的培养物，以免出现假阴性③需设阴(链)、阳(葡)鲜配制验(1)原理：某些细菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，后者在与乙酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成重氮苯磺酸，在与(3)结果：a加入试剂后显红色→阳性b加入试剂后不显红色→加入锌粉，显红色为阴性,不显红色为阳性4.DNA酶试验★原理：细菌产生的DNA酶，可使长链脱氧核糖核酸(DNA)水解成寡核苷酸。因为长链DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸则溶于酸，所用玻片法检测；另一种是分泌到菌体外的游离凝固酶，可用试管法检测菌液呈均匀混浊状态，为阳性；菌液聚集呈团块或颗粒状，为阴性mlml不凝固，则为阴性(24h后不凝固才报告阴性)。注意事项1)玻片法为筛选试验，阴、阳性结果均需进行试管法。2)血浆必需新鲜。3)应使用EDTA抗凝血而非枸橼酸盐抗凝。有些凝固酶阴性的葡萄球菌和肠球菌可利用枸橼酸盐，使抗凝血再次凝固而出现假阳性结果。4)最好不用人血。存在潜在的感染因子和凝固障碍6.CAMP试验(1)原理：B族链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的β溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌(B族链球菌和葡萄球菌)的交(2)培养基：血琼脂平板(3)应用：B族链球菌阳性，特异性鉴定(4)注意事项ATCCATCC它金葡结果不典型，甚至出现假阴性结果。(1)原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是胆汁降低了细菌细胞膜表面的张力使菌体裂解，也可能是胆汁加速了肺炎链球菌的自(2)培养基：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁(3)方法：平板法35℃30min(4)应用：肺链+与甲链-的鉴别(五)抑菌试验★1.O/129敏感(抑菌)试验(1)原理：O/129对弧菌属和邻单胞菌属有抑菌作用，而对气单胞菌无此作用。(2)培养基：碱性琼脂平板(3)方法：10ug/片、150ug/片(4)结果与应用：属间鉴定(1)原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。(2)培养基：血琼脂平板(1)原理：肺炎链球菌对奥普拖欣敏感，而其他链球菌对其耐药。(2)培养基：血琼脂平板(3)结果及应用：用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别(六)其它试验A。※方法与结果：4%的KOH溶液保存期限不超过一周取一滴4%的氢氧化钾水溶液(应新鲜制)于洁净的玻片上再取新鲜菌落少许，与氧化钾溶液搅拌均匀，每隔几秒上提接种环，观察能否拉出丝来。能拉出粘丝为阳性结果(革兰阴性菌)，仍为菌悬液者阴性(革兰s出现阳性反应，革兰阳性菌60s以后仍为阴性反应。★2.克氏双糖铁试验(复合生化反应)原理：克氏双糖铁(KIA)琼脂用于观察细菌对糖(葡萄糖和乳糖)的利用能力,以及是否产生硫化氢,可对细菌的种属进行初步鉴定。克氏双糖铁培养基制成高层(下层)和短的斜面(上层)其中乳糖浓度为葡萄糖浓度的10倍，。如果细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，葡萄糖分解产生少量的酸，在最初培养的8~12h内也足以使高层和斜面变黄(酚红指示剂6.8~8.4，黄~红)，但随着培养时间的延长，培养基斜面部分所产的酸因接触空气被氧化，并因细菌利用含氮物质生成碱性化合物，经18~24h后整个斜面又恢复成红色，深层在相，所产生的酸暂时不被氧化而仍呈黄色；如果细菌既分解葡糖糖，又分解乳糖，因培养基中含乳糖的浓度较高，产生大个培养基变黄；如果细菌分解培养基中的蛋白质产生硫化氢，与培养基中的亚铁离子生成硫化亚铁黑色沉淀，使培养基7.抗原检测：凝集反应、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)平或患者恢复期抗体效价比急性期升高≥4倍才有意义。9.细菌毒素检测：内毒素(革兰阴性)→鲎试验；外毒素：体内试验→动物试验、体外试验→抗原抗体反应菌的抗菌效果：一代头孢菌素>二代>三代；对革兰阴性球菌的抗菌效果：一代头孢菌素<二代<三代2.抗菌药物敏感试验(AST)的意义3.敏感(S):血药浓度达到MIC4~8倍或以上。是指分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时，在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑耐药(R)：MIC高于药物在血液或组织中的浓度。是指分离菌株不能被测试药物使用推荐剂量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度物对分离菌株的临床疗效不可靠。4.中介(I):血药浓度相当于或略高于MIC。是指抗菌药物MIC接近血液和组织中通常可达到的浓度，疗效低于敏感菌株，在药物生理浓效力，或者可用高于正常剂量的药物进行治疗；另外中介还作为缓冲区，以避免微小的不能控制的技术因素造成重大5.非敏感(NS):由于没有耐药菌株或耐药菌罕见，此分类特指仅有敏感解释标准的分离菌株。对于这些菌株应当确证鉴定结果和药敏结验方法:1.纸片扩散法(K-B法)2.稀释法:(1)宏量肉汤稀释法(2)微量肉汤稀释法(3)琼脂稀释法Etest4.自动化仪器法生长的透明圈即抑菌圈，直径解释标准折点，判定为敏感(S)、中介(I)或耐药(R)2)细菌接种：涂抹法(15分钟内接种完毕),放置3~5分钟。结果判读,：量取抑菌圈直径(结果判读)1)菌悬液中严防菌块存在。2)粘液型菌株、干燥型菌株可配成高浓度菌悬液，经沉淀后取上清液稀释至0.5麦氏浊度单位。3)细菌接种后静置3~5分钟后再贴药敏纸片。4)菌悬液调配好后15分钟内接种完毕。5)注意药敏纸片之间的距离及纸片与培养基边缘之间的距离6)药敏纸片一旦贴上不得再移动。7)常规工作中应按要求进行质量控制。细菌获得性耐药可通过以下几种机制来实现。改变：数量减少和/或构型变化变，细菌突变造成孔蛋白丢失或降低其表达主动外排机制S10.多重耐药细菌(MDR)：细菌对常用抗菌药物主要大类中的3类或以上耐药。G药。物。PBPa。选方法。判读头孢西丁对临床分离的金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌环直径≤21mm应报告对苯唑西林耐药，≥22mm应报告对苯唑西mm苯唑西林耐药，≥25mm报告对苯酯类药物的耐药机制1、泵出机制(主动外排)→MS型由msrA基因编码红霉素(R)克林霉素(S)B型链阳霉素(R)m红霉素(R)克林霉素(R)B型链阳霉素(R)红霉素(R)克林霉素(S)B型链阳霉素(R)rmSrRNAMLSb结果：克林霉素抑菌环不出现“截平”现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧克林霉素抑菌环出现“截平”现象(称为“D”在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对其耐药，在报告中应注明“通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林素对某些病人可能仍有效”。1.质量保证(QA)：是指有计划地、系统的评估和检测患者诊疗质量的整个过程，以便及时的发现问题，采取有效措施，提高服务质量。位。3.临床分类化脓性链球菌(A群)、马链