甾体激素类药物的分析

第十五章甾体激素类药物的分析

第一节基本结构与分类1第二节理化性质与鉴别试验2第三节特殊杂质与检查

3第四节含量测定4第五节体内甾体激素类药物分析54616ABCD1235789101112131415171819基本结构环戊烷骈多氢菲甾体激素性激素肾上腺皮质激素

雄性激素孕激素雌激素

分类蛋白同化激素

肾上腺皮质激素△4–3–酮基C17–醇酮基氢化可的松肾上腺皮质激素醋酸地塞米松肾上腺皮质激素曲安奈德肾上腺皮质激素地塞米松磷酸钠雄性激素甲睾酮雄性激素丙酸睾酮蛋白同化激素苯丙酸诺龙孕激素C17-甲酮基黄体酮孕激素醋酸甲地孕酮雌性激素炔雌醇雌性激素雌二醇此外炔诺酮炔诺孕酮一、基本结构与分类

1.肾上腺皮质激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应

C17–α–醇酮基还原性2.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应

C17–β–羟基可成酯3.孕激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应C17–甲酮基与亚硝基铁氰化钠反应4.雌性激素主要活性基团性质A环为3–OH苯环UV、与重氮苯磺酸盐反应C17–乙炔基与AgNO3反应C17–羟基可成酯二、理化性质与鉴别试验（一）理化性质

（二）鉴别实验比旋度：不对称物质具有旋光性，当偏振光透过1dm，样品浓度为1g/ml的溶液，在一定波长和温度下测得的旋光度称为比旋度。（一）理化性质吸收系数：在给定的波长、溶剂和温度等条件下，吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度。反映了药物的紫外吸收特征（一）理化性质（二）鉴别试验薄层色谱法

制备衍生物测定熔点

高效液相色谱法

紫外分光光度法

红外分光光度法

化学鉴别法鉴别试验

（一）化学鉴别法1.与强酸的呈色反应甾体激素类药物呈色H2SO4

H3PO4HClO4HCl母核的一般鉴别试验药物显色荧光加水稀释醋酸可的松黄或微带橙X颜色消失溶液澄清炔雌醇橙红黄绿玫瑰红色絮状沉淀炔雌醚橙红黄绿红色沉淀泼尼松橙X黄至蓝绿泼尼松龙深红X红色消失，有灰色絮状沉淀

与硫酸显色反应2.官能团的反应肾上腺皮质激素药物呈色四氮唑盐OHˉ（1）C17

–

α–醇酮基还原性呈色反应此外还有斐林试液、多伦试液四氮唑比色法甾酮类激素药物腙（黄色）羰基试剂（2）C3–酮基和C20–酮基常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物蓝紫色亚硝基铁氰化钠间二硝基酚芳香醛（3）甲酮基黄体酮蓝紫色亚硝基铁氰化钠其他甾体淡橙色或不显色雌激素类药物红色偶氮染料重氮苯磺酸（4）酚羟基含炔基的甾体激素银盐沉淀硝酸银（5）炔烃的沉淀反应↓有机氟Fˉ有机破坏有机氯Clˉ（6）有机卤素茜素氟蓝

硝酸亚铈硝酸—硝酸银AgCl↓呈蓝紫色

一般先进行水解，生成相应的羧酸，再根据羧酸的性质来进行鉴别。（7）酯的反应△４-3-酮、苯环、其他共轭结构（二）UV法1.结构依据240nm左右280nm左右2.示例曲安息龙丙酸倍氯米松溶剂甲醇乙醇20μg/ml浓度20μg/ml结果判断在238nm处有最大吸收在239nm处有最大吸收，A为0.57～0.60，在239nm与263nm处的吸收度比值为2.25～2.45结构特征：酚羟基、C17–OHC17–乙炔基炔雌醇（三）IR法1505cm-1ν3505cm-13300cm-1ν1590cm-13610cm-1酚羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨架振动ν结构特征：△４-3-酮、C17-甲酮基黄体酮1700cm-1

C=O20位酮基1665cm-13位酮基1615cm-1870cm-1

C-H双键（四）TLC法

主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别

方法：对照品法要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。（五）HPLC法

主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）

方法：对照品法要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。硒的检查有关物质的检查

残留溶剂的检查

游离磷酸盐的检查

三、特殊杂质检查（一）有关物质的检查

检查意义：其他甾体与甾体激素药物结构相似，也有一定的药理作用而又互不相同.

检查方法（具有一定分离能力）

TLC法（高低浓度对比法）

HPLC法（类似高低浓度对比法）（1）TLC法（高低浓度对比法）

判定方法：

规定杂质斑点数目

规定杂质斑点颜色例：炔孕酮中有关物质的检查供试液：本品+氯仿-甲醇(3:1)

浓度：10mg/ml对照液：供试液（10mg/ml）+氯仿-甲醇(3:1)

浓度：50μg/ml层析：供试液点样、展开、斑点检出。

对照液判断：供试液如显杂质斑点，其荧光强度与对照溶液主斑点比较，不得更深。（2）HPLC法（主成分自身对照法）

判定方法：

规定杂质峰数目规定杂质峰面积药物二氨基萘比色法测定氧瓶燃烧(二）硒的检查有毒来源合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢（三）有机溶剂残留量的检查甲醇≤

0.3％丙酮≤5.0%

内标法+校正因子以地塞米松磷酸钠为例GC法供试液钼酸铵1-氨基-2-萘酚-4-磺酸.钼蓝：740nm对照液：同法要求：供试品溶液吸光度不得大于对照溶液吸光度（四）游离磷酸盐的检查（对照液0.0035%KH2PO4）比色法

紫外分光光度法含量测定高效液相色谱法

四、含量测定（一）HPLC法USP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多内标法）（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂示例：地塞米松磷酸钠的含量测定

色谱条件：固定相ODS，流动相三乙胺溶液-甲醇-乙腈（55:40:5）检测波长242nm系统适用性试验：n>7000，地塞米松磷酸钠峰和地塞米松峰分离度应大于4.4离子对液相色谱流动相真空脱气机四元泵自动进样器紫外检测器荧光检测器蒸发光散射检测器液质联用仪质谱检测器流动相：对于以C18为固定相的反相色谱系统，常用甲醇-水，间或加以乙腈、缓冲液等为流动相，有机溶剂比例通常不低于5％四元泵自动进样器填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶检测器（二）UV法△４-3-酮

240nm（±）肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯环

280nm（±）雌激素1.四氮唑比色法

2.异烟肼比色法

3.

Kober反应比色法

（三）比色法

肾上腺皮质激素类C17-α－醇酮基强还原性（1）原理1.四氮唑比色法有色甲瓒四氮唑盐醇酮基-a-17COH-[还原]三苯甲瓒↓深红氯化三苯四氮唑（TTC）红四氮唑（RT）[H]蓝四氮唑（BT）525nm（2）方法对照品法25℃氢氧化四甲基铵对照液供试液ATTC40～45′暗（3）讨论A.基团对反应速度的影响C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯B.溶剂、水分的影响

以无醛乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5％对结果没有影响C.O2与光线的影响避光隔绝空气、快速、充N2D.碱的种类及加入顺序以氢氧化四甲基铵的结果最佳加入顺序：皮质激素碱试液四氮唑盐E.温度与时间室温（25℃）反应40～45min肾上腺皮质激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素C3－酮基（1）原理异烟腙（黄）酮基异烟肼-3CHCl（缩合）2.异烟肼比色法420nm异烟腙（黄色）（2）方法对照品法60℃异烟肼无水甲醇对照液供试液A暗60′（3）讨论反应速度（反应专属性）A.C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反应反应专属性C3－酮基B.溶剂的选择异烟肼盐酸盐→受溶解度的影响无水甲醇无水乙醇对试剂的稳定性好、呈色强度较无水乙醇中高、但对植物油的溶解度小C.水分、温度、O2与光线的影响

含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓O2与光线对反应的影响不大t℃↑→ν↑酸:异烟肼=2:1最大吸收度盐酸浓度0.0074mol/L异烟肼浓度0.00365mol/LD.酸的种类和浓度及异烟肼的浓度(1)原理H2SO4-乙醇加热H2Oλmax=465加热雌激素黄色桃红λmax=5153.Kober反应比色法雌二醇-3-甲醚λmax=465nmλmax=515nm铁－酚试剂[(NH4)2Fe(SO4)2+H2SO4+H2O2+苯酚]*铁盐的作用

加快黄色产物的形成、转化加强红色产物的稳定性*酚的作用

加快红色产物的形成消除反应产生的荧光第五节体内甾体激素类药物分析1药物代谢研究

2生物利用度研究

3违禁药物监测

1方法的专属性强

此类分析的特点：给药剂量很小

2药物浓度低3分析方法的灵敏度较高4竞技运动员体内违禁甾体激素药物的分析LC-MS测定法[3]

在线固相微萃取(solid-phasemicroextraction,SPME)技术[3]HPLC-UV测定法[4]方法[3]SaitoK,YagiK,IshizakiA,KataokaH.Determinationofanabolicsteroidsinhumanurinebyautomatedin-tubesolid-phasemicroextractioncoupledwithliquidchromatography–massspectrometry.JofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2010,52:727–733[4]KoniecznaL,PlenisA,OledzkaI,KowalskiP,B˛AczekT.OptimizationofLCmethodforthedeterminationoftestosteroneandpitestosteroneinurinesamplesinviewofiomedicalstudiesandanti-dopingesearchstudies.Talanta,2011,83:804-814对受试对象给药，一定时间后采集尿样加内标物，调节PH，加酶进行水解一段时间，离心，取上清液。用上述制的的样品，进行SPME处理，分离纯化后经LC-MS分析示例1：尿中违禁同化激素的SPME/LC–MS检查图：志愿受试者尿样中睾酮等七种违禁甾体激素药物的LC-MS测定

左炔诺孕酮

血浆药代动力学和生物等效性研究左炔诺孕酮是一种高效的孕激素，作为速效避孕药，广泛应用于临床和计划生育。有文献报道，建立LC-MS/MS法检测血浆中左炔诺孕酮的方法，研究左炔诺孕酮分散片在健康自愿受试者体内的药动学和相对生物利用度，并评价生物等效性，为临床用药提供依据[5,6]。

5.Li-ZiZh,Guo-PingZh,Hui-ChangB,LiangD,YingD,SuG,Xiao