农业部2406号公告-8-2016 转基因动物及其产品成分检测 人乳铁蛋白基因（hLTF）定性PCR方法

农业部2406号公告一8-2016中华人民共和国农业部发布I11范围农业部2031号公告—14—2013转基因动物及其产品成分检测普通牛(Bostaurus)内标准基因定性PCR方法转基因动物及其产品成分检测猪内标准基因定性PCR方法转基因动物及其产品成分检测羊内标准基因定性PCR方法农业部2406号公告—7—20164原理2农业部2406号公告—8—20165.51mol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用盐酸(HCl)调pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌205.6TE缓冲液(pH8.0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷—盐酸溶液和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。5.750×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液，用冰乙酸调pH至8.0,然后加水定容到1000mL。使用时，用水稀释5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上3种溶液，加水定容至100mL,在4℃下保存。5.9DNA分子量标准：可清楚地区分100bp~1000bp的DNA片段5.10dNTPs混合溶液：将浓度为)mmolL的dAIP、dTTP、GTP、lcrP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11TagDNA聚合酶正向引物hLTF-F:5/-GGCTGTGGTGAAGAAGGG/预期扩增片段大小154bp(参见附录A)5.14内标准基因引物，根据样品来源选择对应的牛内标准基因(见农业部2031号公告—14—2013)、羊内标准基因(见农业部2122号公告=2—2014),猪内标准基因(见农业部2122号公告—1-2014),确定检测引物。5.15引物溶液：用TE缓冲液或水分别将引物稀释到10jmol/L。5.16石蜡油。5.19PCR产物回收试剂盒6主要仪器和设备6.2涡旋微型离心机：最大相对离心力2000g6.4PCR扩增仪：升降温速度>1.5℃/s,孔间温度差异<1.0℃。6.6凝胶成像系统。7.1.1DNA模板制备采用农业部2406号公告—7—2016的方法，测定并记录DNA在260nm和280nm的吸光度。将DNA适当稀释或浓缩，使其OD₂s值在0.1～0.8的区间内。以1个OD₂₆o值相当于3农业部2406号公告—8—201650ng/pμLDNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。DNA溶液7.2.1.1内标准基因PCR扩增7.2.1.2基因特异性序列PCR扩增7.2.1.2.1每个试样PCR扩增设置3次平行。能的PCR仪可不加)。也可采用经验证的终浓度水0.5L聚合酶g41NA模板0.1%～1.0%的转基因动物基因组DNA作为阳性对照；以水作为空白对照。加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准。接通电源在2V/cm~5V/cm条件下电泳15min～20min,再用凝胶成像系统检测。4