农业部2406号公告-9-2016 转基因动物及其产品成分检测 人α-乳清蛋白基因(hLALBA)定性PCR方法

农业部2406号公告一9—2016转基因动物及其产品成分检测定性PCR方法I1定性PCR方法转基因动物及其产品成分检测猪内标准基因定性PCR方法转基因动物及其产品成分检测羊内标准基因定性PCR方法hLALBAHomosapiensLactal2农业部2406号公告—9—20165.51mol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用盐酸(HCl)调pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌205.6TE缓冲液(pH8.0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。5.750×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液，用冰乙酸调pH至8.0,然后加水定容到1000mL。使用时，用水稀释5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上3种溶液，加水定容至100mL,在4℃下保存。5.9DNA分子量标准；可清楚地区分1o0bp～10005.10dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、GTP、hoTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11TaqDNA聚合酶。5.13hLALBA基因引物正向引物hLALBA年5'-TGTCAGrgCTGCTGTdc-反向引物hLALBAR:5'-AGTCTTCAAGAATTcccT预期扩增片段大小为156bp(参见附录A)。5.14内标准基因引物!根据样品来源选择对应的牛内标准基因(见农业部2031号公告—14—2013)、羊内标准基因(见农业部2122号公告—2=2014)猪内标准基因(见农业部2122号公告—1-2014),确定检测引物。5.15引物溶液：用TE缓冲液或水分别将引物稀释到10pmol/L。5.17动物基因组DNA提取试剂盒。5.19PCR产物回收试剂盒。6主要仪器和设备6.2涡旋微型离心机：最大相对离心力2000g6.3微量紫外分光光度计：2ng/μL～15000ng/μL。6.4PCR扩增仪：升降温速度>1.5℃/s,孔间温度差异<1.0℃。6.5电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.6凝胶成像系统。7分析步骤7.1DNA模板制备7.1.1DNA模板制备采用农业部2406号公告—7—2016的方法，测定并记录DNA在260nm和280nm的吸光度。将DNA适当稀释或浓缩，使其OD₂o值在0.1~0.8的区间内。以1个OD₂s值相当于3农业部2406号公告—9—201650ng/μLDNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。DNA溶液OD₂60/OD₂so值应在1.7～2.0之间，或质量能符合检测要求。7.1.2依据测得的浓度，将DNA溶液用TE缓冲液稀释到25ng/μL,-20℃保存。7.2.1.1内标准基因PCR扩增根据样品来源选择合适的牛、羊、猪内标准基因，确定对应的PCR扩增引物、反应体系和反应程序。7.2.1.2基因特异性序列PCR扩增7.2.1.2.1每个试样PCR扩增设置3次平行。7.2.1.2.2在PCR扩增管中按表1依次加人反应试剂，涡旋振荡混匀，再加25μL石蜡油(有热盖功能的PCR仪可不加)。也可采用经验证的、等效的定性Per粒增试剂盒配制反应体系。终浓度水dNTPs混合溶液各2.nmol/12L0.025U/μL总体积7.2.1.2.4进行PQR扩增，反应程序为：95℃预变性5min;95℃变性30.56℃退火30s,72℃延伸15s,共进行35次循环；72℃延伸5min。7.2.1.2.5反应结束质取出PCR管，对PCR扩增产物进行电泳检测在试样PCR扩增的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照以与试样相同种类的非转基因动物基因组DNA作为阴性对照；以含有hLALBA基因的质量分数为0.1%～1.0%的转基因动物基因组DNA作为阳性对照；以水作为空白对照。7.3PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混匀。稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板。室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取4μLPCR产物与2μL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准。接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳15min～20min,再用凝胶成像系统检测。7.4凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如需通过序列分析确认PCR扩4农业部2406号公告—9—20168.1对照检测结果分析增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出内标基因片段，空中检测出含有人α-乳清蛋白基因成分