第四章 无菌技术课件

第四章发酵工业无菌技术与污染防治第一节概述第二节发酵工业污染的防治策略第五节空气除菌第三节发酵工业的无菌技术第四节发酵培养基及设备管道灭菌新第四章-无菌技术第四章发酵工业无菌技术与污染防治第一节概述1.什么叫发酵工业无菌技术？发酵工业无菌技术是指在发酵工业实际生产实践中，为了防止杂菌污染而经常采用的消毒与灭菌技术2.为什么说无菌技术对现代发酵工业非常重要？因为现代发酵工业绝大多数采用纯种培养，因而要求在发酵的全过程只能有生产菌而不允许有“杂菌”存在，否则将导致严重的后果。新第四章-无菌技术第一节概述3.为了保证纯种培养，在生产中要采取什么措施？在生产菌种接种之前，要对发酵培养基、空气系统、流加料、发酵罐及管道系统等进行灭菌，同时还要对环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。

灭菌与消毒有何不同？它们各适用于哪些情况的无菌处理？第四章发酵工业无菌技术与污染防治新第四章-无菌技术第一节概述4.几个重要概念污染概率：1000批次的发酵灭菌中出现染菌的次数灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程消毒(disinfection)：用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物的过程除菌(degerming)：用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子的过程防腐(antisepsis)：用物理或化学方法杀死或抑制微生物生长和繁殖的过程新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略（1）培养基因杂菌而消耗损失，造成生产能力的下降。（2）杂菌产生新的代谢产物，或杂菌污染改变了培养液的某些理化性质，使发酵产物的提取变得困难，造成得率降低或产品质量下降。（3）杂菌代谢会改变原反应体系的pH值，使发酵发生异常。（4）杂菌分泌某些水解酶使产物分解，导致发酵失败（5）若发生噬菌体污染，会使细菌细胞裂解，导致发酵失败一、污染对发酵会带来什么危害？新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略染菌对发酵所造成的危害及后果与

有关A.发酵生产的产品B.杂菌的种类和性质C.染菌发生的时间D.染菌的途径和程度？二、染菌对发酵产生什么影响？如何应对？新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略1.染菌对不同菌种发酵的影响在发酵过程中，不同菌种所用的培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质不同，染菌的类型和造成的危害程度也各不相同

细菌：发酵周期较短，以防止噬菌体污染为主

霉菌：发酵周期较长，产物类型多样，染菌情况比较复杂

酵母菌：需特别防止生长较快的细菌和野生酵母菌的污染

疫苗产生菌：常用基因工程菌，一旦染菌，必须全部废弃二、染菌对发酵产生什么影响？如何应对？新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略2.不同发酵时期染菌对发酵的影响

种子扩培时期染菌种子染菌对危害极大，必然导致发酵失败，故应严格控制

应对措施：灭菌后弃去

发酵前期染菌染菌后，杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养，严重抑制生产菌的生长，导致发酵产物积累大大减少，甚至造成发酵失败应对措施：迅速重新灭菌，再接种，从头发酵二、染菌对发酵产生什么影响？如何应对？新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略二、染菌对发酵产生什么影响？如何应对？2.不同发酵时期染菌对发酵的影响

发酵中期染菌这时染菌对发酵生产危害极大，不仅影响生产菌的继续生长，而且会严重干扰生产菌的产物合成代谢，使发酵产物积累减少（原因何在？）应对措施：应尽可能做到早发现、快处理。处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。如抗生素发酵与柠檬酸发酵的处理措施不同新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略二、染菌对发酵产生什么影响？如何应对？2.不同发酵时期染菌对发酵的影响

发酵后期染菌这时染菌对发酵生产的影响相对较小应对措施：一般可继续进行发酵，即使污染迅速加重，也可以采取提前放罐来减少染菌造成的损失3.染菌对发酵产物提取和产品质量的影响染菌对发酵后处理有极大影响，主要是增加了发酵产物的提取难度，影响发酵产品的质量（例子）新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治1.染菌的检查与染菌类型的判断在发酵过程中，采用准确、快速的方法及早发现杂菌并及时处理是避免造成严重损失的重要手段。检查杂菌类型及其可能途径的主要方法有：（1）显微镜检查法（2）平板划线培养检查法（3）肉汤培养检查法（4）发酵过程的异常现象观察法新第四章-无菌技术菌体浓度新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治2.污染的原因分析

种子带菌空气带菌设备渗漏灭菌不彻底操作失误技术管理不善（1）造成发酵染菌的普遍原因是什么？（表4-1、4-2）新第四章-无菌技术新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治2.污染的原因分析（2）污染原因分析方法从污染杂菌的种类进行分析

污染的杂菌

可能的原因耐热芽孢杆菌培养基或设备灭菌不彻底不耐热杂菌种子带菌、空气除菌不彻（球菌、无芽孢杆菌）底、设备渗漏或操作问题浅绿色菌落冷却盘管渗漏霉菌无菌室灭菌不彻底或无菌操作问题酵母菌糖液灭菌不彻底，糖液放置时间过长新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治2.污染的原因分析

从污染时间进行分析

发酵前期污染：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、接种操作不当或无菌空气带菌

发酵后期污染：中间补料污染、设备渗漏或操作问题

从染菌的程度进行分析各个或多个发酵罐染同一种杂菌空气系统存在问题个别罐连续染菌某个设备存在问题新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治3.杂菌污染的途径及其预防（1）种子带菌及其防治

培养基及器具彻底灭菌避免菌种在移接过程中受污染避免菌种在培养过程或保藏过程中受杂菌污染新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治3.杂菌污染的途径及其预防（2）过滤空气带菌及其防治完善空气净化系统：空气除菌净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理生产上经常采用的措施有（P62、72）提高空压机进口空气的洁净度设计合理的空气预处理流程设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治3.杂菌污染的途径及其预防（3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治设备渗漏染菌主要是指发酵设备、管道、阀门等在长期使用过程中，由于化学腐蚀、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏而染菌设备的“死角”是指由于操作、设备结构或人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能到达预定的灭菌部位或该部位的冷空气不易在加热过程中排净，从而不能达到彻底灭菌要求的部位。“死角”往往是发酵罐和设备的盲端新第四章-无菌技术新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治3.杂菌污染的途径及其预防（3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治设备渗漏造成染菌的防治：选用优质的制造材料，定期进行检查“死角”的种类及其消除：

发酵罐的“死角”

①加强清洗并定期铲除污垢；②安装边阀，消除管道盲端；③加强罐体清洗，减少罐底积垢

管道安装不当或配置不合理形成的“死角”

①采用单独的排气、排水和排污管；②配置单独的灭菌系统；③法兰的加工、焊接和安装要符合灭菌要求新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治3.杂菌污染的途径及其预防（4）培养基灭菌不彻底导致染菌及其防治

原料性状的影响灭菌时温度与压力不对应造成染菌灭菌过程中产生的泡沫造成染菌连续灭菌维持时间不够或压力波动大而造成染菌灭菌后期罐压聚变造成染菌新第四章-无菌技术第二节发酵工业污染的防治策略三、杂菌污染的防治3.杂菌污染的途径及其预防（5）操作不当引起染菌

在放大移种时或发酵过程中，罐内压力跌到零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖造成染菌；管道阀门操作不当造成发酵液倒流（6）噬菌体污染及其防治环境污染是噬菌体染菌的主要根源。最有效的防治方法是以净化环境为中心的综合防治法（具体内容见P64）新第四章-无菌技术第三节发酵工业的无菌技术发酵工业常用的无菌技术和方法有：1.干热灭菌法灭菌条件：160~170℃下保温1~2h。适用范围：空的玻璃器皿、金属用具和其他耐高温的物品禁用：带有胶皮、塑料的物品、培养基优点：灭菌器皿保持干燥新第四章-无菌技术发酵工业常用的无菌技术和方法有：2.湿热灭菌法灭菌条件：121℃15~20min，115℃30min适用范围：培养基、玻璃器皿、无菌水、缓冲液、金属用具优点：灭菌效果好，适用范围广——利用饱和蒸汽进行灭菌的方法第三节发酵工业的无菌技术新第四章-无菌技术发酵工业常用的无菌技术和方法有：3.射线灭菌法最常用的是紫外线，但只能用于物体表面、超净工作台、无菌室和培养室等环境灭菌——利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法第三节发酵工业的无菌技术新第四章-无菌技术发酵工业常用的无菌技术和方法有：常用的化学药剂是甲醛、漂白粉（次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）等。适用范围：发酵工厂环境的消毒禁用：培养基4.化学药剂灭菌法——使用某些化学试剂与微生物发生反应而将之杀灭的方法第三节发酵工业的无菌技术新第四章-无菌技术发酵工业常用的无菌技术和方法有：5.过滤除菌法——利用过滤方法阻留微生物以达到除菌的目的适用范围：不耐高温的液体培养基组分和空气的过滤除菌（大量制备无菌空气）6.火焰灭菌法——利用火焰直接杀死微生物的灭菌方法适用范围：金属小用具（接种针、接种环、接种铲、小刀、镊子）以及玻璃试管和三角瓶口等器具的灭菌优点：方法简单、灭菌彻底局限性：适用范围有限第三节发酵工业的无菌技术新第四章-无菌技术第四节发酵培养基及设备管道灭菌

发酵工业中，培养基灭菌工作的要求及关键是什么？灭菌的要求是：既要达到灭菌的目的，又要使培养基组成成分的破坏减少至最低灭菌工作的关键是：恰当掌握加热温度和受热时间

一般衡量灭菌彻底与否的标准是什么？是以能否杀灭芽孢细菌为标准新第四章-无菌技术一、湿热灭菌原理加热灭菌的原理是当温度超过微生物生长温度的上限时，微生物细胞中的蛋白质等大分子物质会发生不可逆变性，而使微生物在很短的时间内死亡。湿热灭菌的原理是利用饱和蒸汽所具有的强穿透力以及蒸汽在冷凝时所释放出的大量热能，使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，造成微生物死亡。第四节发酵培养基及设备管道灭菌新第四章-无菌技术几个重要概念

致死温度：杀死微生物的极限温度

致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间

热死时间：在规定温度下杀死一定比例微生物所需要的时间

热阻：微生物对热的抵抗力，即微生物在某一特定条件下（主要是温度）的致死时间

相对热阻：某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比一、湿热灭菌原理第四节发酵培养基及设备管道灭菌新第四章-无菌技术1.灭菌时间计算灭菌时间的基本公式t=2.303/（klg—）N0Nt

灭菌时间取决于污染程度（N0）、灭菌程度（残留菌数Nt）和k值。比死亡速率常数k是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据工程上在进行灭菌设计时，一般采用Nt=0.001，即在1000次灭菌中允许有一次染菌的机会（染菌概率）第四节发酵培养基及设备管道灭菌二、影响灭菌效果的因素新第四章-无菌技术对数残留定律——对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比。新第四章-无菌技术对数残留定律N——培养基中的微生物个数τ——时间（S）K——比死亡速率（S-1）dN/dτ——死亡速率新第四章-无菌技术对数残留定律积分并整理：新第四章-无菌技术对数残留定律反应速度常数是判断微生物耐热的基本依据。在相同的温度下，不同微生物的k值不同。K值愈小，则此微生物愈耐热。有时习惯上也采用“1/10衰减时间D”表示。即活菌在受热过程中减少到原来数目1/10所需的时间。即：新第四章-无菌技术对数残留定律（1）灭菌时间取决于污染程度N0

、灭菌程度Nτ、和K值；（2）Nτ=0，τ为无穷大，无意义，事实上也不可能。新第四章-无菌技术对数残留定律（3）一般采用Nτ=0.001，即1000次灭菌中有1次失败。新第四章-无菌技术2.灭菌温度随着温度的变化，比死亡速率K的值变化很大。温度对K值的影响，遵循阿累尼乌斯方程：新第四章-无菌技术二、影响灭菌效果的因素

2.灭菌温度灭菌温度与灭菌速率常数的关系（阿累尼乌斯方程（式4-8）

K——

菌死亡的速度常数（s-1

）A——

阿累尼乌斯常数（s-1）R——

气体常数（8.314J／mol.K）T——

绝对温度（K）E——

微生物死亡活化能（J/mol）Exp——2.71新第四章-无菌技术2.灭菌温度——相同温度下，不同微生物K值不一样，K值愈小，微生物愈耐热；——同一微生物，在不同灭菌温度下，K值不同，灭菌温度愈低，K值小；温度愈高，K值愈大。新第四章-无菌技术灭菌温度的选择1在培养基灭菌过程中，除了杂菌死亡外，还拌随着培养基成分的破坏，因此必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏降低至最低的工艺条件。2培养基的破坏属于分解反应C——对热不稳定物质的浓度（mol/L）K’——分解速率常数（S-1）τ——分解反应时间（S）新第四章-无菌技术灭菌温度的选择3分解速率常数K’和温度的关系，也可用阿仑尼乌斯方程式表示新第四章-无菌技术灭菌温度的选择A’——阿仑尼乌斯常数R——气体常数[8.314J/(mol.K)]T——热力学温度（K）ΔE’——杀死细菌芽孢的活化能（J/mol）Exp——2.71新第四章-无菌技术灭菌温度的选择4温度从T1上升至T2时，K和K’的变化情况（1）温度T1时（2）温度T2时新第四章-无菌技术灭菌温度的选择（3）两式相除（4）同样，在培养基成分破坏上也可得一类似关系式：（5）两式相除新第四章-无菌技术灭菌温度的选择杀灭某些细菌芽孢和B族维生素分解的ΔE名称 ΔE（J/mol)叶酸 70.3泛酸 87.9维生素B12 96.7维生素B1盐酸盐 92.1嗜热脂肪芽孢杆菌 283枯草杆菌 318肉毒梭菌 343腐败厌气菌 303新第四章-无菌技术灭菌温度的选择灭菌温度和灭菌时间对维生素B1破坏的比较灭菌温度ºC 灭菌时间min 维生素B1破坏量%100 400 99.3110 36 67115 15 50120 4 27130 0.5 8145 0.08 2150 0.01 <1新第四章-无菌技术培养基灭菌一般选择高温快速灭菌法。其理论依据是：当灭菌温度升高时，微生物死亡速率大于培养基成分破坏的速率。为了达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长而遭到的损失（表4-5、4-6）2.灭菌温度第四节发酵培养基及设备管道灭菌二、影响灭菌效果的因素新第四章-无菌技术3.培养基成分油脂、糖类、一定浓度的蛋白质、低浓度（1%~2%）的NaCl溶液能会提高微生物的耐热性，所以灭菌温度要高些。4.培养基pHpH6.0~8.0时微生物耐热能力最强，pH小于6.0时，能促进微生物死亡。培养基pH越低，灭菌所需时间越短。（表4-7）pH对微生物的耐热性影响很大第四节发酵培养基及设备管道灭菌二、影响灭菌效果的因素新第四章-无菌技术5.培养基的物理状态培养基的物理状态对灭菌具有极大的影响。固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长。原因何在？6.泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，对灭菌极为不利7.培养基中的微生物数量和种类培养基中的微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越长；含芽孢杆菌多的培养基，要适当提高灭菌温度并延长灭菌时间第四节发酵培养基及设备管道灭菌二、影响灭菌效果的因素新第四章-无菌技术分批灭菌（实罐灭菌）是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程优点：不需要专门的灭菌设备，设备简单投资少灭菌效果可靠对蒸汽压力要求较低（3~4MPa）适用性：中小型发酵罐第四节发酵培养基及设备管道灭菌三、分批灭菌新第四章-无菌技术1.灭菌工艺过程

排放夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，夹套通入蒸汽；发酵罐温度升到70℃时，开始由空气过滤器、取样管和放料管通入蒸汽，当发酵罐内温度达到120℃，灭菌进入保温阶段；在保温阶段，向液面以下的各管道通入蒸汽，从液面以上的其余各管道排出蒸汽，不留死角，维持压力和温度到保温结束；依次关闭各排气、进气阀门，并通过空气过滤器迅速向罐内通入无菌空气，维持发酵罐降压过程中的正压，并用冷却水降温第四节发酵培养基及设备管道灭菌三、分批灭菌新第四章-无菌技术2.灭菌时间的计算分批灭菌过程包括升温、保温和冷却三个阶段。灭菌主要是在保温阶段实现的，但在升温的后期和冷却的初期，也有一定的灭菌效果，所以分批灭菌时间的计算应包括这两个阶段。第四节发酵培养基及设备管道灭菌三、分批灭菌新第四章-无菌技术由于在升温和冷却阶段温度是不断变化的，而比死亡速率k值也随温度不断变化，计算灭菌效果十分复杂。一般先计算出升温阶段平均的菌死亡速率常数km和加热时间tp，再计算升温阶段结束时培养基中残留菌数Np，最后由式（4-19）计算保温阶段所需保温时间t考虑到灭菌的可靠性主要取决于保温阶段，故可以简单地利用式（4-3）来粗略估算灭菌所需要的时间2.灭菌时间的计算第四节发酵培养基及设备管道灭菌三、分批灭菌新第四章-无菌技术连续灭菌是将配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作的过程优点：可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小可根据物料的具体情况，进行分开灭菌，减少物料破坏程度或避免有害物质产生第四节发酵培养基及设备管道灭菌三、连续灭菌新第四章-无菌技术1.连续灭菌的工艺流程先行工作（准备工作）：发酵罐空罐灭菌，加热器、维持罐和冷却器先行灭菌。①喷淋冷却连续灭菌流程（图4-8）第四节发酵培养基及设备管道灭菌三、连续灭菌②喷射加热连续灭菌流程（图4-9）③薄板式换热器连续灭菌流程（图4-10）新第四章-无菌技术

培养基在配料罐中通过蒸汽预加热；用连消泵将培养基送入连消塔，用蒸汽加热到灭菌温度；培养基进入维持罐，维持8~25min；培养基经喷淋冷却器冷却到发酵温度后送入发酵罐①喷淋冷却连续灭菌流程（图4-8）新第四章-无菌技术②喷射加热连续灭菌流程（图4-9）蒸汽直接喷入生培养基经喷射头进入维持管保温经膨胀阀进入真空冷却器冷却无菌培养基进入发酵罐优点：受热时间短保证培养基先进先出，避免过热或灭菌不彻底的现象新第四章-无菌技术③薄板式换热器连续灭菌流程（图4-10）培养基进入一级冷却板预热到100℃进入加热板快速加热到120℃进入维持管保温后进行二级冷却无菌培养基进入发酵罐优点：灭菌周期短能耗低新第四章-无菌技术新第四章-无菌技术新第四章-无菌技术四、发酵培养基及设备管道灭菌技术与参数（P71~72）（1）种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌（2）空气总过滤器和分过滤器灭菌（3）种子培养基实罐灭菌（4）发酵培养基实罐灭菌（5）发酵培养基连续灭菌（6）补料实罐灭菌注意：防止出现死角保证蒸汽压力和维持时间达到预定值液面以下阀门通蒸汽液面以上阀门排蒸汽第四节发酵培养基及设备管道灭菌新第四章-无菌技术空罐灭菌

空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。四、发酵培养基及设备管道灭菌技术与参数第四节发酵培养基及设备管道灭菌新第四章-无菌技术实罐灭菌

将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。操作要点：三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进汽”。

四、发酵培养基及设备管道灭菌技术与参数第四节发酵培养基及设备管道灭菌新第四章-无菌技术第五节空气除菌一、空气除菌的必要性和重要性

在好氧培养过程中需要供应大量的空气，而空气含有大量的微生物，故必须进行空气除菌以获得大量的无菌空气，否则造成严重后果；空气带菌是发酵染菌的主要原因之一，因此空气除菌是好氧培养过程的一个重要环节新第四章-无菌技术工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同而异。半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格，一般无需复杂的空气净化处理；密闭的深层通气发酵需严格的纯培养，进入发酵罐前空气必须进行冷却、脱水、脱油和过滤除菌等处理。发酵对无菌空气的要求是：无菌、无灰尘、无杂质、无油，温度和相对湿度合适，具有一定的压力发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3第五节空气除菌二、发酵对无菌空气的要求

新第四章-无菌技术空气过滤除菌

是采用定期灭菌的过滤介质来阻截流过的空气中所含微生物而制得无菌压缩空气的过程从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑，目前以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂广泛采用的方法。辐射杀菌、加热杀菌、静电除菌、过滤除菌

最常用最经济过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体第五节空气除菌三、空气除菌的方法新第四章-无菌技术种类：棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机或无机烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷）形状：纤维状物、颗粒状物第五节空气除菌四、空气过滤介质新第四章-无菌技术第五节空气除菌五、空气过滤除菌的一般流程及相应的设备新第四章-无菌技术前置空气过滤器进行粗滤空压机升压一级冷凝器对压缩空气降温二级甚至多级冷凝器降温除水、除油空气加热器加热、降低湿度空气储罐稳压空气过滤器除菌无菌空气进入发酵罐第五节空气除菌五、空气过滤除菌的一般流程及相应的设备新第四章-无菌技术发酵生产中制备无菌空气的大致过程第五节空气除菌五、空气过滤除菌的一般流程及相应的设备新第四章-无菌技术①要制备较高无菌程度，具有一定压力的无菌空气，它的流程设备有空气压缩机；②附属设备要求尽量采用新技术，提高效率，减少设备，降低设备投资、运转费用和动力消耗，简便操作；③在压缩机油耗严重的设备流程中，要尽可能消除油的影响，可采用无油润滑的往复式压缩机来克服；④高温的压缩空气冷却时会析出大量的冷凝水，必须除去；⑤冷却和除水除油的措施，可根据各地的环境气候条件而定。第五节空气除菌六、对空气过滤除菌流程的要求新第四章-无菌技术⑥流程的制定应根据发酵特点、所在地的地理环境、气候条件综合考虑：在环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件，以降低过滤器的负荷，提高空气的无菌程度；在温暖潮湿的南方，要加强除水设施，以确保过滤器干燥以发挥最大除菌效率。第五节空气除菌六、对空气过滤除菌流程的要求新第四章-无菌技术发酵工厂所使用的空气除菌流程随各地的气候条件不同而有很大的差别！总目标：保持过滤器有较高的过滤效率措施：要有一系列冷却、分离、加热设备来保证空气在相对湿度为50%-60%的条件下通过过滤器，保持不受受油、水的干扰，并维持一定的气流速度第五节空气除菌七、空气过滤除菌流程的分析新第四章-无菌技术（1）两级冷却、加热过滤除菌流程（图4-11）第五节空气除菌七、空气过滤除菌流程的分析新第四章-无菌技术（1）两级冷却、加热过滤除菌流程（图4-11）从高位吸风塔1将吸入的空气经粗过滤器

2过滤后进入空压机3

被压缩进入贮罐4

，压缩空气经第一级冷却器5冷却到30~35℃，大部分水结成较大的雾粒，被旋风分离器6分离；再经第二级冷却器7冷却到20~25℃，析出一部分较小雾粒，被网丝分离器8分离；除水后的压缩空气进入加热器9加热，使相对湿度从100%降到50%~60%，以保证过滤介质的干燥及过滤器10的正常运行。第五节空气除菌七、空气过滤除菌流程的分析新第四章-无菌技术（1）两级冷却、加热过滤除菌流程（图4-11）工艺评价：这是一个比较完善的空气过滤除菌流程，能充分地冷却并进行空气和冷凝水的分离，使空气达到合理的温度和低的相对湿度后进入过滤器，以提高过滤效率。作为压缩空气的标准处理流程，该工艺尤其适用于南方潮湿地区。特点：两次冷却、两次分离、适当加热两次冷却、两次分离的好处是能有效地控制压缩空气的温度和相对湿度，几乎适用于各种气候条件的不同地区第五节空气除菌七、空气过滤除菌流程的分析新第四章-无菌技术（2）一级冷却析水、加热过滤除菌流程适用于中等湿含量的地区第五节空气除菌七、空气过滤除菌流程的分析新第四章-无菌技术（3）一级冷却过滤除菌流程适用于北方和内陆气候干燥地区。只保留一级冷却设备，将压缩空气冷却到露点以上，就直接进入过滤器第五节空气除菌七、空气过滤除菌流程的分析新第四章-无菌技术（4）一级冷却、冷热空气直接混合式的空气过滤除菌流程适用于中等湿含量的地区。热能利用比较合理第五节空气除菌七、空气过滤除菌流程的分析新第四章-无菌技术（5）一级冷却、空气热交换器加热式的空气过滤除菌流程适用于中等湿含量的地区。热能利用比较合理第五节空气除菌七、空气过滤除菌流程的分析新第四章-无菌技术空气进入过滤器前的处理操作统称为空气的预处理，包括前置过滤、压缩、压缩空气的冷却、除水和除油、再加热。空气预处理是过滤器效率正常发挥的重要保证！（1）外源空气的前过滤提高空气压缩前的洁净度的主要措施有：提高空气吸气口的位置和加强吸入空气的前过滤。第五节空气除菌八、空气预处理前置过滤器的作用及要求是什么？（P73）新第四章-无菌技术（1）外源空气的前过滤前过滤：空气通过设置在吸入口处的粗过滤器（前置过滤器）的过滤，其作用是减小压缩机的磨损和主过滤器的负荷，提高除菌空气的效率和质量对前置过滤器的要求是：过滤效率高、阻力小常用布袋过滤器、填料过滤器第五节空气除菌八、空气预处理新第四章-无菌技术（2）空气压缩和压缩空气的冷却空气压缩的目的：克服输送过程中过滤介质等的阻力常用的空压机有：涡轮式和往复式。通常采用无油的空压机，以减小后续空气预处理的难度压缩空气冷却的目的：避免引起过滤介质炭化或燃烧，减小发酵罐的降温负荷第五节空气除菌八、空气预处理新第四章-无菌技术压缩空气的冷却：

空气的压缩过程可以近似地看作绝热压缩过程，压缩的空气温度与被压缩的温度有关：新第四章-无菌技术压缩空气的冷却T1、T2—压缩前后，空气的热力学温度（K）；P1、P2—压缩前后，空气的绝对压强（Pa）；K—绝热指数，空气为1.4。若压缩为多变过程，则可用多变指数m（对于空气可取1.2-1.3）.代替绝热指数K。新第四章-无菌技术压缩空气的冷却例：200C的空气由1x105Pa被压缩到4x105Pa（绝压），求压缩空气的温度。T=403-273=130(0C)。新第四章-无菌技术压缩空气的冷却如果压缩比更大，压缩空气的温度就更高。如此高温度的压缩空气若直接进入空气过滤器，极有可能引起过滤介质的炭化或燃烧，而且增大了发酵罐的降温负荷，给培养温度的控制带来困难。另外，高温度空气还会增加发酵液水分的蒸发，影响菌体生长。因此压缩空气进入介质过滤器前必须降温。新第四章-无菌技术（3）压缩空气冷却后的除水、除油除水、除油的目的：避免过滤介质受潮失效几个与湿空气相关的重要概念：

空气的绝对湿度：1m3湿空气中含有水蒸汽的绝对量（kg）

空气的相对湿度：空气的绝对湿度与同温度下饱和绝对湿度的比值或者空气中水蒸气分压与同温度时的饱和水蒸气压的比值

空气的湿含量：1kg干空气中含有的水汽量（kg/kg干空气）

露点Td：当空气相对湿度为100%，水蒸气达到饱和时的温度第五节空气除菌八、空气预处理新第四章-无菌技术压缩空气冷却后的除水、除油

大气中总有一定量的水分，并以气态存在，当空气中的水蒸气过多，超出饱和度（即相对湿度100%）时，或在空气冷却至露点以下时，空气中的水蒸气才会形成水滴柝出。新第四章-无菌技术压缩空气冷却后的除水、除油空气的湿含量（或绝对湿含量）X:1kg干空气中所含水蒸气的质量（kg）即：Mw、Mg—水和空气的相对分子量；Pg—干空气的分压；P—湿空气的总压强（Pa）。新第四章-无菌技术压缩空气冷却后的除水、除油在空气湿含量不变，即压缩前后湿含量不变即X1=X2。根据以上公式进行整理得：新第四章-无菌技术（4）压缩空气的再加热和稳压压缩空气再加热的目的：降低压缩空气的相对湿度，防止过滤介质受潮而丧失过滤效能。注意：压缩空气加热温度的选择对保证过滤器的除菌效率很重要！一般来说，冷凝后的温度与再升温后的温度相差在10~15℃，即能保证空气的相对湿度降至50%~60%，能满足进入过滤器的要求。空气储罐的作用是：稳压并使空气中的剩余液滴在罐内沉降除去第五节空气除菌八、空气预处理新第四章-无菌技术棉花：纤维细长，16-20um，填充150-200kg/立方米玻璃纤维：直径8-19um，直径越小越好，但小易断，缺点：更换时碎末飞扬，是过敏源活性炭：大表面，物理吸附，空气阻力小，常夹带在二层棉花中降低阻力，为整个过滤器的1/3-1/2超细玻璃纤维纸:以拦截为主，直径1-1.5um，有较高过滤效率。缺点为强度差，受温后纤维松散。只用于分过滤器。可加入木浆纤维或其他纤维或采用树脂并加疏松剂。石棉滤板：蓝石棉20％加80％纸将混合打浆。温强度大，过滤效率低，耐蒸气反复杀菌。烧结材料过滤介质：聚乙烯醇过滤板。新型过滤介质：微孔滤膜九、空气过滤介质新第四章-无菌技术鉴于目前所采用的过滤介质均需要在干燥条件下才能进行除菌，因此需要围绕介质来提高除菌效率。影响介质过滤效率的因素介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高。对于相同介质，过滤效率与介质滤层厚度、介质填充密度和空气流量有关。第五节空气除菌十、提高过滤除菌效率的措施新第四章-无菌技术（1）针对不同地区，设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。（2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。（3）保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫生管理，正确选择进风口及其高度，加强空气压缩前的预处理。（4）降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去油、去水，适当提高进入过滤器的空气温度。第五节空气除菌十、提高过滤除菌效率的措施新第四章-无菌技术第四章发酵工业无菌技术与污染防治第一节概述第二节发酵工业污染的防治策略第五节空气除菌第三节发酵工业的无菌技术第四节发酵培养基及设备管道灭菌新第四章-无菌技术本章小结染菌对发酵生产影响很大，是否纯种培养直接关系到现代发酵工业生产过程的成败。发酵过程的不同阶段，染菌所带来的影响不同，处理措施也不一样。如何及早发现杂菌并及时处理事避免染菌造成严重损失的重要手段。种子带菌、空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善等是造成各个发酵厂污染杂菌的普遍原因。发酵工业的无菌技术各有优缺点，必须注意选择使用。新第四章-无菌技术6.湿热灭菌法是发酵工业中大量培养基和发酵设备灭菌最有效最常用的方法。7.培养基灭菌的要求是既要达到灭菌目的，又要使培养基组成成分的破坏减少至最低。8.恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。9.影响培养基灭菌效果的因素很多，包括杂菌的种类、数量、灭菌温度、时间，培养基成分、pH、物理状态、泡沫等。10.培养基分批灭菌也称实罐灭菌，其过程包括升温、保温和冷却三个阶段。灭菌的可靠性主要在保温阶段进行。11.培养基采用连续灭菌时，必须先对发酵罐、加热器、维持罐、和冷却器进行灭菌新第四章-无菌技术12.

空气除菌是好氧培养过程中的一个重要环节。对无菌空气的要求是：空气无菌、温度和相对湿度合适、具有一定压力。13.空气预处理是保证过滤器效率能否正常发挥的重要部分。空气预处理包括：前置过滤、压缩、冷却、除水、除油、稳压、再加热。14.制定空气过滤除菌流程的依据是：发酵特点、所在的地理环境、气候条件。新第四章-无菌技术本章思考题现代发酵工业为什么一般都要进行灭菌和消毒？柠檬酸发酵中期染菌如何处理？举例说明杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响。试述谷氨酸发酵中感染噬菌体、污染好气性杂菌或非好气性杂菌时，溶解氧的变化情况。在实际生产中利用尾气分析仪检测尾气中的二氧化碳的含量变化可以判断污染情况，其依据是什么？6.在发酵工业中造成染菌的普遍原因是什么？7.噬菌体污染的主要根源是什么？防治的策略和措施有哪些？8.试述不同发酵时期染菌对发酵的影响及处理措施。新第四章-无菌技术9.为什么说恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键？10.试简述湿热灭菌的原理。11.试述培养基灭菌时一般选择高温快速灭菌法的理论依据。12.试述影响培养基灭菌的因素。13.简述空气除菌的必要性和重要性。14.写出空气过滤除菌的一般流程和相应的设备。15.举例说明在制定空气过滤除菌流程时应考虑的问题。16.在海南要提高空气除菌效率可采用哪些措施？为了保证空气过滤器有较高的过滤效率，需要有什么样的设备支撑？为什么说空气预处理是保证过滤器效率能否正常发挥的重要部分？新第四章-无菌技术新第四章-无菌技术二、过滤除菌设备原理

概述：

目前发酵工厂采用的空气过滤设备大多数是传统的深层过滤设备，滤层厚度一般为1～2米，所用的过滤介质一般是棉花、活性炭，也有采用玻璃纤维、焦炭等。对不同的材料，材料的不同规格，材料的填充情况不同，都会得到不同的过滤效果。为了制取适合要求的无菌空气，就得深入研究深层过滤的各种关系。新第四章-无菌技术（一）深层过滤原理深层过滤所用的过滤介质—棉花的纤维直径一般为16~20微米。充填系数为8%时，棉花纤维所形成网格的孔隙为20～50微米，微粒大小为(0.5-2微米)。微粒随气流通过滤层时，滤层纤维所形成的网格阻碍气流前进，使气流出现无数次改变运动速度和运动方向，绕过纤维前进；这些改变引起微粒以对滤层纤维产生惯性冲击、阻拦、重力沉降、布朗扩散、静电吸引等作用而把微粒滞留在纤维表面上。新第四章-无菌技术纤维介质阻留微粒的机制1．阻拦截留：微粒随空气气流向前运动，当气流为层流时，随气流运动的粒子在接近纤维表面的部分由于与过滤介质接触而被纤维吸附捕集，这种作用称之为阻拦截留。空气流速愈小，纤维直径愈细，阻拦截留作用愈大。但是在介质过滤的除尘除菌中，阻拦截留并不起主要作用。2．惯性碰撞截留：空气气流流速大时，气流中的微粒具有较大的惯性力。当微粒随气流以一定速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时，由于微粒具有的惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面，产生摩擦粘附而使微粒被截留在纤维表面，这种作用称惯性碰撞截留。新第四章-无菌技术

截留区域的大小决定于微粒运动的惯性力，所以，气流速度愈大，惯性力大，截留效果也愈好。此外，惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关，纤维愈细，捕集效果愈好。惯性碰撞截面在介质除尘中起主要作用。3．布朗扩散运动：直径小于1μ的微粒在运动中往往产生—种不规则的布朗运动，使微粒间相互凝集成较大的粒子，从而发生重力沉降或被介质敲留。但是这种作用只有在气流速度较低时才较显著。纤维介质阻留微粒的机制新第四章-无菌技术４.重力沉降作用机理重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易沉降。就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才起作用。一般