T-CVMA 164-2024 口蹄疫A型病毒磁微粒化学发光抗体检测方法

T/CVMA164—2024口蹄疫A型病毒磁微粒化学发光抗体检测Magneticparticlechemiluminescencemethodfordetectionofantibodyagainstfoot-and-mouthdiseasevirustypeA2024-5-23发布2024-5-23实施中国兽医协会发布I1本文件适用于动物血清中的口蹄疫A型病毒抗体检测，适用于A型口蹄疫的血清学监测、流行病学2规范性引用文件NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范激发液excitationflu4符号和缩略语MES溶液：4-吗啉乙磺酸溶液（4-Morpholineethanesulfonicacidsolution）2MEST溶液：4-吗啉乙磺酸吐温溶液（4-MorpholineEthylsulfonicAcidTweenPBST：磷酸盐吐温溶液（PhosphatebuffersalineinTween）NHS溶液：N-羟基丁二酰亚胺溶液（N-hydroxysuccinimidesolution）采用竞争法的磁微粒直接化学发光检测技术检测口蹄疫病毒A型抗体。将待测样品、口蹄疫A型病混合；孵育一段时间洗涤后，加入激发液A和激发液B；发光强度和抗体含量成反比，通过测量的发光7.32℃~8℃冰箱，-20℃冰箱。38.1.1进行静脉无菌采血，不少于8.1.2将血液室温（15℃~25℃)静置于斜面2h～4h，待血液自然凝固后，置离心机4,000r/min离8.1.3吸出上层血清保存备用。血清应清亮，8.2.1血清样品若在一周内检测，可置2℃~8℃条件下保存。若超过一周检测，应置于-20℃以下冷4A.1.1从超低温冰箱取出大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，于冰上融化，加入5μg合成质粒pet28a-FMDV-A-VP1，轻轻混匀后，立16h。mL含卡那霉素（50µg/mL）LB液体培养基A.1.48,000r/min离A.2磁性微球溶液的制备A.2.1取0.2mg口蹄疫病毒VP1重组蛋白，装入透析袋中，置0.15moL/LpH值7.4的PBS溶液中室温（15℃~25℃)透析4h。），5min）移除上清。重复用MES溶液磁分离洗涤2次，用0.5mLMES溶液重悬。溶液，摇匀后固定在混匀器上室温（15℃~25℃)反应30min。反应结束后，磁分离，移除上清，用总体积1mL，摇匀后固定在混匀器上室温（15℃~25℃)反应4h。反应结束后，磁分离，移除上清，56取500μL口蹄疫A型病毒单克隆抗体（浓度2mg/mL装入透（15℃~25℃)透析4h。取出透析后的抗体溶液，加入洁净玻璃瓶中，再将吖啶酯溶液（浓度5.0mmoL溶液中，避光，室温反应2h。反应后入10%（m/V）赖氨酸封闭，室温反应1h。B.1.5保存加入0.02%Proclin-300混匀后经0.22μm滤器过滤，无菌分装，于2℃~8℃保存。7C.1.1采血室温（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃静置2h，然后2℃~8℃静置1h，将析出的血清转移到离心瓶中，以2,000r/min离心5将制备的血清混合均匀后，0.22μm滤膜过滤除菌，将血清与冻干保护剂按8量分装，1mL/瓶，冷冻真空干燥，置-70℃以下保存，标记为“口蹄疫A型病毒抗体阴性免疫间隔1个月，最后免疫一次后，无菌采血，用商品化口蹄疫A型ELISA抗体阻断检测试剂盒检测蹄室温（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃静置2h，然后2℃~8℃静置1h，将析出的血清转移到离心瓶中，以2,000r/min离心5将制备的血清混匀后，经0.22μm滤膜过滤除菌，将血清与冻干保护剂按8.5:分装，1mL/瓶，冷冻真空干燥，置-70℃下保存，标记为“口蹄疫A型病毒抗体阳8量取200mL纯化水，加入37%浓盐酸溶液8.33mL，加入3化水定容至1,000mL。定量分装，2℃~8℃保存。2.5mL，搅拌均匀加纯化水定容至1,000mL。定量分装，2℃~8℃保存。称取十二水合磷酸氢二钠72.5g、磷酸二氢钾5g、氯化钠200g、氯化钾5g，加入700mL双蒸水加热搅拌溶解，再加入12.5mL的吐温-20，而后加双蒸水定容至1,00纯化水搅拌溶解，再加纯化水定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。过滤，置2℃~8℃保存。称取10mg的NHS，溶于1mLMES溶液中，临用配制10min内使用。称取10mg的EDC溶于1mLMES溶液中，临用配制10min内使用。），），搅拌均匀，PBS定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。），PBS定容至1,000mL。9扫描配套的试剂盒、对照品、激发液A和激发液B的二维码，将批号和检测方法疫分析仪(H