内蒙古白刺叶总黄酮提取工艺优化

内蒙古白刺叶总黄酮提取工艺优化

摘要:采用乙醇分离纯化白刺叶中的总黄酮醇苷,反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对内蒙古白刺叶提取物中的总黄酮醇苷进行分析。RP-HPLC法测定白刺叶提取物体积分数为70%乙醇洗脱部分,流动相:V(甲醇)∶V(0.4%H3PO4溶液)=60∶40;检测波长508nm;结果表明,乙醇纯化白刺叶中的总黄酮醇苷效果良好,纯度可达到18.28%。关键词:白刺叶；乙醇；总黄酮醇苷内蒙古白刺叶（nitrariatangutorumBobr)为漠黎科（zy-gophyllaoeae)白刺属植物白刺（nitraiiatangutorumBo-br)的叶，据《本草纲目》中记述，白刺“气味辛、寒、无毒，主治心绞痛、痛肿溃脓、止痛”[1]。要分布于我国的内蒙古沙漠地区、西北沙漠地区及华北、东北沿海地区，张家口坝上、天津、沧州、寿光、东营等地都有野生白刺，资源丰富并且具有一定的药理作用，是一种理想的天然抗氧化或防腐剂的提取来源，并且可以作为一种营养的保健成分或者是一种天然的抗氧化剂添加于其他食品中。总黄醇苷为白刺叶中的主要活性成分，本课题将对其叶片采用乙醇提取法,优选白刺叶总黄酮类的提取工艺，为白刺的进一步开发利用提供理论根据。。本方法简便，准确，易于操作。1实验部分1.1仪器与试剂WaterS515高效液相泵，WaterS2996DAD检测器，WatersEmpower色谱工作站，Waters色谱柱恒温箱，电子分析天平(梅特勒公司)，DZ^CW-C型电子恒温水浴锅(北京化玻医疗器械公司)，JDG-0.2真空冷冻干燥机（兰州科近真空冻干技术有限公司)，RE52—98真空旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，不锈钢电热蒸馏水器（上海申安医疗器械厂)。大孔树脂（中国沧州远威化工有限公司)，pH广泛试纸。甲醇为色谱纯，自制蒸馏水，NaOH，HCl,乙醇H3PO4，石油醚均为分析纯。槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号110081-201205)山奈素(中国药品生物制品检定所，批号110861-2⑴606)，异鼠李素（中国药品生物制品检定所，批号110861-201407)，白刺叶于2018年12月采于内蒙古西乌珠穆沁旗。1.2实验方法1.1标准曲线的制备精密量取标准品溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL,分别置25mL容量瓶中,各加蒸馏水至6.0mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,混匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀,放置6min,加40.00g/L氢氧化钠溶液10mL,再加蒸馏水至刻度,摇匀,放置15min,以相应试剂为空白对照,用紫外可见分光光度法在508nm处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。1.2内蒙古白刺叶黄酮类化合物的提取工艺白刺叶→恒温干燥箱40℃烘48h干燥→粉碎→脱脂→醇回流提取→抽滤→滤液(黄酮类化合物溶液)→浓缩→定容→分析测定总黄酮类的含量。1.3黄酮类化合物样品测定方法精确称量白刺叶提取液1mL。加入蒸馏水5mL;加入5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀并放置6min;加入5%硝酸铝溶液1mL,摇匀并放置6min;再加入1mol/L氢氧化钠溶液10mL;最后用蒸馏水定容至25mL,溶液摇匀放置15min。用可见分光光度计在508nm波长处测定吸光度。按上述试验方法和步骤测其吸光度并按下式计算白刺叶黄酮类化合物的提取率:提取率(%)=提取液中黄酮类化合物质量(g)/白刺叶质量(g)[2-3]。1.4白刺叶黄酮类化合物提取的单因素试验方法以白刺叶总黄酮类含量为考察指标,选择乙醇浓度、料液比、浸提时间、浸提温度作为考察的四个影响因素,每个因素设定5个梯度,每个因素的设定梯度分别为乙醇浓度55%,65%,75%,85%,95%,其他试验条件为料液比为1∶25,浸提温度为60℃,浸提时间为2.0h;料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,其他试验条件为乙醇浓度为85%,浸提温度为60℃,浸提时间为2.0h。浸提温度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃,其他试验条件为乙醇浓度为85%,料液比为1∶25,浸提时间为2.0h;浸提时间0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h,其他试验条件为乙醇浓度为85%,料液比为1∶25,浸提温度为60℃[4-5]。1.5白刺叶黄酮类化合物提取的正交试验方法参照单因素试验结果,采用四因素三水平正交试验设计,优选白刺叶黄酮类化合物提取的最佳工艺条件。2含量测定2.1槲皮素，山奈素，异鼠李素混标含量测定的色谱条件KromasilC18色谱柱（4.6mmX250mm,5Mm);流速1.0mL/min;柱温30°C;流动相：F(甲醇）：V(0.4%H3PO4水溶液）=60:40。检测波长360nm;见图1。图1白刺叶总黄酮醇苷HPLC2.1.1对照品溶液的制备精密称取槲皮素，山奈素，异鼠李素对照品适量，加甲醇制成槲皮素浓度为0.06mg/mL，山奈素浓度为0.008mgImL和异鼠李素的浓度为0.0027mgliL的混标溶液。2.1.2供试品溶液的制备[6-7]将白刺叶总黄酮醇苷提取物准确称取89.80mg加入V(甲醇）：V（25%的HCl溶液）=4:1混合液25mL70°C回流30min放冷。转移至50mL容量瓶中，加甲醇到刻度，用微孔滤膜（0.45μm)滤过待用。2.1.3线性关系考察用微量进样器分别准确吸取槲皮素，山奈素和异鼠李素混标溶液5.0，10.0，15.0，20.0，25.0μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以槲皮素，山奈素，异鼠李素混标溶液进样体积（L)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线[8-9]。结果表明，槲皮素在0.3~1.5作线性关系良好，其回归方程为：y=2992226.38m—1934989.5，r=0.9997。山奈素在0.04~0.2%线性关系良好。其回归方程为：y=245431m+38000，r=0.99996。异鼠李素0.0135~0.0675%线性关系良好。其回归方程为：y=52834.6m—3834.4，r=0.9995。2.2稳定性试验准确吸取同一供试品溶液5μL，0，2，4，8，12h测定，槲皮素，山奈素，异鼠李素峰面积积分值RSD分别为0.65%,0.75%,0.98%2.3精密度试验准确吸取槲皮素，山奈素，异鼠李素混标溶10%，分别重复进样5次。峰面积积分值RSD分别为0.53%，0.53%，0.52%。2.4重复性试验取同一样品5份，分别按含量测定项下方法测定，记录槲皮素，山奈素峰面积积分值，RSD分别为0.96%，0.85%和1.98%。2.5加样回收率分别取5份的白刺叶总黄酮醇苷提取物称取适量约0.10g，分别精密加入槲皮素，山奈素，异鼠李素对照品，照含量测定项下方法测定，平均回收率分别为97.32%，95.24%，98.10%。RSD分别为0.87%，0.69%，0.85%。2.6计算方法总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量十山奈素含量+异鼠李素含量)X251=18.28%。3讨论洗脱过程中，采用体积分数55%,65%,75%,85%,95%的乙醇洗脱，结果表明，70%洗脱效果较好，方法简便，且容易回收。目前用大孔树脂AB-8纯化白刺总黄酮醇苷研究尚未见报道，对于白刺总黄酮醇苷的药理活性部位，作用机理的研究都还处于初步研究阶段。鉴于白刺丰富的自然资源，对白刺叶进一步有效合理地开发利用是十分必要的。参考文献[1]李岩,刘晶,李田叶,王向红.白刺叶提取物的抗氧化及抑菌性研究[J].食品工业,2015,36(03):94-98.[2]高喆,王佳,特布沁,王迎春.唐古特白刺叶和茎黄酮含量分析[J].中国草地学报,2014,36(03):116-120.[3]刘利平.内蒙古白刺属四种植物营养成分分析及其评价[D].内蒙古农业大学,2009.[4]萨茹丽.沙葱黄酮提取工艺优化、结构鉴定及其相关生物活性研究[D].内蒙古农业大学,2014.[5]孙京沙.大叶藻总黄酮的提取、纯化及抗衰老活性的研究[D].中国海洋大学,2014.[6]林志钦.莲子心总黄酮的提取纯化及其功能性研究[D].福建农林大学,2012.[7]王宇希.丁香叶总黄酮的提取工艺及抑菌效果评价[D].东北农业大学,2013.[8]吴金梅.甘草总黄酮抗金黄色葡萄球菌作用及其治疗奶牛乳房炎的应用研究[D