高致病性禽流感防治技术规范

高致病性禽流感防治技术规范高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza,HPAI），是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。为预防、控制和消灭高致病性禽流感，依据《中华人民共和国动物防疫法》及有关的法律法规，特制定本规范。1适用范围本规范规定了高致病性禽流感的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施、控制和净化标准。本规范适用于中华人民共和国境内的一切从事禽类饲养、经营和禽类产品生产、经营，以及从事动物防疫活动的单位和个人。2诊断2.1有下列情况之一的，可确认为高致病性禽流感：2.1.1有典型的临床症状和病理变化，发病急、死亡率高，且能排除鸡新城疫和中毒性疾病，血清学检测阳性。2.1.2未经免疫鸡场的家禽出现H5、H7亚型禽流感血清学阳性。2.1.3在禽群中分离到H5、H7亚型禽流感病毒株或其它亚型高致病力禽流感毒株。2.2流行特点鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹧鸪、鸵鸟、鸽、孔雀等多种禽类均易感。传染源主要为病禽和带毒禽（包括水禽和飞禽）。病毒可长期在污染的粪便、水等环境中存活。病毒的传播主要通过接触感染禽及其分泌物和排泄物、污染的饲料、水、蛋托（箱）、垫草、种蛋、鸡胚和精液等媒介，经呼吸道、消化道感染，也可通过气源性媒介传播。2.3临床症状潜伏期从几小时到数天，最长可达21天。表现为突然死亡、高死亡率，饲料和饮水消耗量及产蛋量急剧下降，病鸡极度沉郁，头部和脸部水肿，鸡冠发绀、脚鳞出血和神经紊乱；鸭鹅等水禽有明显神经和腹泻症状，可出现角膜炎症，甚至失明。2.4病理变化2.4.1剖检病变:全身组织器官严重出血。腺胃粘液增多，刮开可见腺胃乳头出血、腺胃和肌胃之间交界处粘膜可见带状出血；消化道粘膜，特别是十二指肠广泛出血；呼吸道粘膜可见充血、出血；心冠脂肪及心内膜出血；输卵管的中部可见乳白色分泌物或凝块；卵泡充血、出血、萎缩、破裂,有的可见“卵黄性腹膜炎”。水禽在心内膜还可见灰白色条状坏死。胰脏沿长轴常有淡黄色斑点和暗红色区域。急性死亡病例有时未见明显病变。2.4.2病理组织学变化:主要表现为脑、皮肤及内脏器官（肝、脾、胰、肺、肾）的出血、充血和坏死。脑的病变包括坏死灶、血管周围淋巴细胞管套、神经胶质灶、血管增生和神经元性变化；胰腺和心肌组织局灶性坏死。2.5实验室诊断2.5.1病原鉴定2.5.1.1符合相应生物安全级别的,且经国务院畜牧兽医行政管理部门认定的省级以上动物疫病诊断实验室和研究机构的实验室,可开展病原鉴定工作。2.5.1.2样品采集活禽样品应采集泄殖腔拭子和气管拭子；死禽样品应采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织器官；小珍禽样品应采集新鲜粪便（见附件一）。2.5.1.3病原学诊断主要包括病原分离、鉴定（见附件二）和毒力测定(见附件三)。2.5.2血清学诊断主要包括琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）（不适用于水禽）（见附件四）、血凝抑制试验（HI）（见附件五）。3疫情报告3.1任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的禽类，都应当立即向当地动物防疫监督机构报告。3.2动物防疫监督机构接到疫情报告后，按农业部《动物疫情报告管理办法》和《国家高致病性禽流感防治应急预案》等有关规定执行。4疫情处理实行以紧急扑杀为主的综合性防治措施。4.1发现疑似高致病性禽流感疫情时，畜主应立即将病禽（场）隔离，并限制其移动。动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实，进行流行病学调查、临床症状检查、病理解剖、采集病料、实验室诊断等，根据诊断结果采取相应措施。4.2当发生高致病性禽流感时，按下列要求处理：4.2.1划定疫点、疫区、受威胁区由所在地县级以上畜牧兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。疫点：指患病动物所在的地点。一般是指患病禽类所在的禽场（户）或其它有关屠宰、经营单位；如为农村散养，应将自然村划为疫点。疫区：指以疫点为中心，半径3-5公里范围内区域。疫区划分时，应注意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）。受威胁区：指疫区外延5-30公里范围内的区域。4.2.2封锁由县级以上畜牧兽医行政管理部门报请同级人民政府决定对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后，应在24小时内发布封锁令，并对疫区进行封锁。对疫点、疫区采取不同的处理措施。其中：疫点出入口必须有消毒设施。严禁人、禽、车辆进出和禽类产品及可能受污染的物品运出，在特殊情况下必须出入时，须经所在地动物防疫监督机构批准，经严格消毒后，方可出入。疫区交通要道建立动物防疫监督检查站，派专人监视动物和动物产品的流动，对进出人员、车辆须进行消毒。停止疫区内禽类及其产品的交易、移动。水禽必须圈养，或在指定地点放养。4.2.3扑杀确认为高致病性禽流感时，在动物防疫监督机构的监督指导下对疫点内所有的禽只进行扑杀。4.2.4无害化处理对所有病死禽、被扑杀禽及其禽类产品（包括禽肉、蛋、精液、羽、绒、内脏、骨、血等）按照GB16548《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》执行；对于禽类排泄物和被污染或可能被污染的垫料、饲料等物品均需进行无害化处理。禽类尸体需要运送时，应使用防漏容器，须有明显标志，并在动物防疫监督机构的监督下实施。4.2.5紧急免疫对疫区和受威胁区内的所有易感禽类进行紧急免疫接种，登记免疫接种的禽群及其养禽场(户)，建立免疫档案。4.2.6消毒对疫点内禽舍、场地以及所有运载工具、饮水用具等必须进行严格彻底地消毒（见附件六）。4.2.7紧急监测对疫区、受威胁区内禽类实施紧急疫情监测，掌握疫情动态。4.2.8疫源分析与追踪调查根据流行病学调查结果，分析疫源及其可能扩散、流行的情况。对仍可能存在的传染源，以及在疫情潜伏期和发病期间售出的禽类及其产品、可疑污染物（包括粪便、垫料、饲料等）等应立即开展追踪调查，一经查明立即按照GB16548-1996《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》采取就地销毁等无害化处理措施。4.2.9封锁令的解除疫点内所有禽类及其产品按规定处理后，在动物防疫监督机构的监督指导下，对有关场所和物品进行彻底消毒。最后一只禽只扑杀21天后，经动物防疫监督机构审验合格后，由当地畜牧兽医行政管理部门向原发布封锁令的同级人民政府申请发布解除封锁令。疫区解除封锁后，要继续对该区域进行疫情监测，6个月后如未发现新的病例，即可宣布该次疫情被扑灭。4.2.10处理记录对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录，以备检查。5预防与控制5.1加强饲养管理，提高环境控制水平。饲养、生产、经营场所必须符合动物防疫条件，取得《动物防疫合格证》。饲养场实行全进全出饲养方式，控制人员出入，严格执行清洁和消毒程序。鸡和水禽禁止混养，养鸡场与水禽饲养场应相互间隔3公里以上，且不得共用同一水源。养禽场要有良好的防止禽鸟（包括水禽）进入饲养区的设施，并有健全的灭鼠设施和措施。5.2加强消毒，做好基础防疫工作各饲养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫生（消毒）管理制度。5.3监测5.3.1由县级以上动物防疫监督机构组织实施。5.3.2监测方法未经免疫区域：以流行病学调查、血清学监测为主（包括琼脂扩散试验、血凝抑制试验等方法），结合病原分离和毒型鉴定、毒力鉴定进行监测。免疫区域：以病原学监测为主，结合血清学监测。5.3.3监测对象：以鸡、火鸡、鸭、鹅等为主，也包括鹌鹑、雉鸡、鹧鸪、鸵鸟、鸽、孔雀和候鸟等易感禽类。5.3.4监测环节与措施5.3.4.1产地监测：对未免疫和免疫的养禽场均可采用病原学监测方法进行监测。对所有原种、曾祖代、祖代和父母代养禽场，有出口任务的养禽场，商品代养禽场每年要进行两次监测；散养禽不定期抽检。采样比例：每群采10只禽的棉拭子，放在同一容器内，混合为一个样品，用于鸡胚接种，进行病毒分离。对于未免疫的养禽场以血清学监测为主。有出口任务养禽场的监测,每批次按照0.5%的比例采样；每批次数量超过10万只的，按0.1%的比例采样；其它所有养禽场每半年至少监测一次。父母代以上种禽场，每批次（群）按照0.5%的比例进行监测；商品代养禽场，每批次（群）按照0.1%的比例进行监测。散养禽不定期抽检。每批次（群）监测数量不得少于20份。5.3.4.2流通环节的监测对交易市场、禽类屠宰厂（场）、异地调入的活禽和禽产品进行不定期的病原学和血清学监测。5.3.5监测结果处理监测结果要及时汇总，由省级动物防疫监督机构定期上报全国畜牧兽医总站。发现病原学和非免疫禽血清学阳性的，要按照《农业部动物疫情报告管理办法》的有关规定立即报告和处理。监测中发现因使用未经农业部批准生产的禽流感疫苗而造成血清学阳性禽群，一律按发生禽流感疫情处理。5.3.6免疫在发生疫情时，对疫区、受威胁区内的所有易感禽只进行紧急免疫；在曾发生过疫情区域的水禽,必要时也可进行免疫。所用疫苗必须是经农业部批准使用的禽流感疫苗。5.3.7引种检疫国内异地引入种禽及精液、种蛋时，应当先到当地动物防疫监督机构办理检疫审批手续且检疫合格。引入的种禽必须隔离饲养21天以上，并由动物防疫监督机构进行检测，合格后方可混群饲养。从国外引入种禽及精液、种蛋时，按国家有关规定执行。6无高致病性禽流感区标准无高致病性禽流感区，必须满足以下条件：6.1达到国家无规定疫病区基本条件。6.2有定期、快速的动物疫情报告记录。6.3在过去3年内没有发生过高致病性禽流感；在过去6个月内，没有接种过禽流感疫苗；停止免疫接种后，没有引进接种过禽流感疫苗的禽类。6.4有有效的监测体系和监测区，过去3年内实施疫病监测，未检出H5、H7病原或H5、H7禽流感HI试验阴性。6.5所有的报告、监测记录等有关材料准确、详实、齐全。6.6若发生高致病性禽流感时，在采取扑杀措施及血清学监测的情况下，最后一只病禽扑杀后6个月；或采取扑杀措施、血清学监测及紧急免疫情况下，最后一只免疫禽屠宰后6个月，经实施有效的疫情监测和血清学检测确认后，方可重新申请无高致病性禽流感区。附件一：样品采集与处理活禽病料应包括气管和泄殖腔拭子，最好是采集气管拭子。小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便。死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品。将每群采集的10份棉拭子，放在同一容器内，混合为一个样品；容器中放有含有抗菌素的pH值为7.0-7.4的PBS液。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素（2000IU/mL）、链霉素（2mg/mL），庆大霉素（50μg/mL），制霉菌素（1000IU/mL），但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后pH值应调至7.0-7.4。若不加抗生素，可用细菌过滤器过滤除菌。粪便、研碎的组织用含抗生素的溶液配成10-20%（W/V）的悬液，冰浴放置1-2小时内样品应尽快处理，如来不及处理，可放在-70℃或以下保存,若放在4℃保存不能超过5天。将混合样品用抗生素制成悬液,接种到9-11日龄鸡胚尿囊腔内，0.1mL／胚;置于35-37℃孵育4-7天,检测死胚和所有到孵化末期鸡胚尿囊液的血凝活性。用浓缩病毒和所有A型流感病毒共有的核衣壳或基质抗原的抗血清作免疫扩散试验,能确诊A型流感病毒。测定毒株对禽的致病力方法:将感染鸡胚尿囊液用生理盐水1：10稀释，以0.1mL／羽的剂量翅静脉接种至少8只4-8周龄的易感鸡。每日观察鸡的死亡情况，连续观察10天。10天内如果死亡率高于75%,则认为该病毒毒株为高致病力。附件二：病原鉴定方法增殖A型流感病毒的较好方法是将其接种于无特定病原体（SPF）鸡胚。粪便和组织悬液经1000rp/m离心10分钟，上清液以0.2mL/胚的剂量经尿囊腔途径接种9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个胚，于37℃孵化箱内孵育4-7天。18小时后每8小时观察鸡胚死亡情况，死亡鸡胚或者濒死鸡胚以及孵育末期所有的鸡胚放在4℃冷却，检测尿囊液的HA活力（见附件4）。阳性反应说明很可能有正粘病毒科的流感病毒，呈阴性反应的尿囊液至少应再接种一批鸡胚。用AGID试验（见附件5）检测流感病毒，可证明A型流感病毒属所有成员共同存在的核衣壳和基质抗原。抗原制备方法：1用浓缩的尿囊液病毒或者用已感染的绒毛尿囊膜的提取物，这些抗原用标准血清进行标定。将含毒尿囊液以超速离心或者在酸性条件下进行沉淀以浓缩病毒。酸性沉淀法是将1.0mol/LHCl加入到含毒尿囊液中，调pH值到4.0，将混合物置于冰浴中作用1小时，经1000rp/m，4℃离心10分钟，弃去上清液。病毒沉淀物悬于甘氨-肌氨酸缓冲液中（含1%十二烷酰肌氨酸缓冲液，用0.5mol/L甘氨酸调pH值至9.0）。沉淀物中含有核衣壳和基质多肽。2用含丰富病毒核衣壳的尿囊膜制备。从尿囊液呈HA阳性的感染鸡胚中提取绒毛尿囊膜，将其匀浆或研碎，然后反复冻融三次，经1000rp/m离心10分钟，弃沉淀，取上清液用0.1%福尔马林处理，制备抗原。附件三：静脉接种致病指数（IVPI）试验操作方法收获接种病毒的SPF鸡胚的感染性尿囊液，测定其血凝价大于1/16（24或lg24），将含毒尿囊液用灭菌生理盐水稀释10倍（切忌使用抗生素），将此稀释病毒液以0.1mL/羽静脉接种10只6周龄SPF鸡,2只同样鸡只接种0.1mL稀释液作对照（对照鸡不应发病，也不计入试验鸡）。每隔24小时检查鸡群一次，共观察10天。根据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录：正常鸡记为0，病鸡记为1，重病鸡记为2，死鸡记为3（病鸡和重病鸡的判断主要依据临床症状表现。一般而言，“病鸡”表现有下述一种症状，而“重病鸡”则表现下述多个症状，如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠和/或肉髯发绀、脸和/或头部肿胀、神经症状。死亡鸡在其死后的每次观察都记为3）。IVPI值＝每只鸡在10天内所有数字之和/（10只鸡×10天），如指数为3.00，说明所有鸡24小时内死亡；指数为0.00，说明10天观察期内没有鸡表现临床症状。当IVPI值大于1.2时，判定分离株为高致病力禽流感病毒（HPAIV）。附件四：琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）因为A型流感病毒都有抗原性相似的核衣壳和基质抗原，可以利用免疫扩散试验检测A型流感病毒的存在与否。制备的浓缩病毒制剂含有基质和核衣壳抗原；基质抗原与核衣壳抗原相比扩散得较快。琼脂免疫扩散试验已作为常规试验方法来检测鸡与火鸡的特异性抗体，并可作为鸡群感染证据。1抗原制备一般常用的核衣壳浓缩制剂是从被感染的10日龄鸡胚绒毛尿囊膜中获得的，将其匀浆冻融三次，以1000rp/m离心10分钟，取上清液加0.1%福尔马林或1%β-丙内酯灭活，再离心即可作为抗原。流感病毒感染后不是所有的禽种都能产生沉淀抗体。2琼脂板制备该试验常用1克优质琼脂粉或0.8-1克琼脂糖加入100mL0.01mol/L、pH值7.2的8%氯化钠-磷酸缓冲液中，水浴加热融化，稍凉（60℃-65℃），倒入琼脂板内（厚度为3mm），待琼脂凝固后，4℃冰箱保存备用。用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3mm3加样用移液器滴加抗原于中间孔，周围1、4孔加阳性血清，其余孔加被检血清，每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头,并设阴性对照血清。4感作将琼脂板加盖保湿，置于37℃温箱。24-48小时后，判定结果。5结果判定5.1阳性。[CX]阳性血清与抗原孔之间有明显沉淀线时，被检血清与抗原孔之间也形成沉淀线，并与阳性血清的沉淀线末端吻合，则被检血清判为阳性。5.2弱阳性。被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯，此被检血清判为弱阳性（需重复试验）。5.3阴性。被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，且阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。附件五：血凝抑制（HI）试验1操作程序1.1抗原血凝效价测定1.1.110%和0.5%鸡红细胞液的制备1.1.1.1采鸡血：用注射器吸取阿氏液约1mL，取3日龄-10日龄SPF鸡（最少2只），心脏采血约2mL-4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。1.1.1.2洗涤鸡红细胞：将离心管中的血液经1500rp/m-1800rp/m离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500rp/m-1800rp/m离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再多次重复以上过程后，加入阿氏液20mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃1.1.1.310%鸡红细胞悬液：取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥行刻度离心管中离心1500rp/m-1800rp/m8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。1.1.1.40.5%鸡红细胞液：取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1mL，加入19mL生理盐水，混合均匀即可。1.1.2抗原血凝效价测定1.1.2.1于微量血凝板的A-G排各孔分别加入生理盐水50μL。1.1.2.2A-G排每排的第1孔加入抗原50μL，每一种抗原的血凝效价测定应作两排检验，如A1孔与B1孔各加入新城疫病毒抗原50μL；C1孔与D1孔各加入禽流感病毒（A型）抗原501.1.2.3用微量移液器从第1孔至第12孔对抗原作系列倍比稀释，即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次，吸出50μL移至第2孔，用生理盐水清洗吸头3次后，再用于下一个孔的混合，以此类推，直至第12孔，从第12孔吸出50μL弃去，此孔抗原的最终稀释度为1:4096。1.1.2.4每孔中加入0.5%鸡红细胞悬液50μL，包括H11孔与H12孔。1.1.2.5将血凝板置振荡器上中速振荡1-2分钟。1.1.2.6置室温（18℃1.1.2.7抗原血凝价判定：感作完毕，观察血凝板，判读结果（见下表）。表1：血凝试验结果判读标准类别孔底所见结果12345红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集++++++++++-能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位。注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。1.2血凝抑制试验1.2.1被检血清样品准备1.2.1.1血清灭活：被检血清，包括阳性、阴性血清，56℃1.2.2抗原准备禽流感病毒（A型）作血凝抑制试验时各种抗原所用血凝单位是8个与4个血凝单位。8个血凝单位抗原的配置：如果某抗原的血凝效价为1：1024，8个血凝单位为1024/8=128（即1：128），取生理盐水11.8mL，加入1：10稀释的抗原1.0mL，混合均匀即为1：128稀释液。1.2.3抗原血凝效价的重测定1.2.3.1为了确保血凝抑制试验时使用抗原的活性，有必要对已配置的8个血凝单位抗原进行血凝效价的重测定，此项试验常与血凝抑制试验同时进行。1.2.3.2A至H各排第1孔分别加入1001.2.3.3A-H各排第2-8孔分别加入生理盐水501.2.3.4将抗原分别作系列倍比稀释至第8孔，从第8孔吸出50μL弃去。1.2.3.5每孔加0.5%鸡红细胞悬液50μL。1.2.3.6将血凝板置微量振荡器振荡1-2分钟。1.2.3.7室温（18℃1.2.3.8观察结果，若血凝单位偏离两个以上稀释度，则血凝抑制试验无效。若血凝单位偏离1个稀释度，属可校正范围，按常规对被检血清的血凝抑制效价进行校正。1.2.4血凝抑制试验1.2.4.1血凝板每排检测一份被检血清。第1孔分别加入被检血清20μL，再加入生理盐水80μL，被检血清稀释度为1：5。1.2.4.2设阳性血清和阴性血清对照。1.2.4.3每排第2孔分别加入50μL8个单位抗原，第3-11孔分别加入50μL4个单位抗原。1.2.4.4用移液器自第1孔吹吸3次后，取出50μL移至第2孔，以此倍比稀释至第11孔，从11孔吸出50μL弃去。1.2.4.5第1孔为血清对照，第2孔被检血清为1：10稀释，第3孔为1：20，第4孔为1：40，以此类推，第11孔为1：5120。1.2.4.6每孔加入0.5%鸡红细胞悬液50μL。1.2.4.7将血凝板置微量振荡器上振荡1-2分钟。1.2.4.8置室温（18℃1.2.4.9感作完毕，将血凝板倾斜70°，凡沉淀于孔底的红细胞沿倾斜面向下呈线状流动，呈现与红细胞对照孔一样者为完全不凝集孔。出现完全不凝集的血清最高稀释度为该被检血清血凝抑制效价。2结果判定禽流感（A型）的血凝抑制效价≥1:10为阳性。该试验中，鸡血清极少出现非特异性阳性反应，被检血清不必进行预处理。其它禽类血清可能对鸡红细胞有非特异性凝集反应，可用鸡红细胞对被检血清进行吸附，以除去这种非特异性凝集特性。方法是在每0.5mL的被检血清中加入0.025mL的鸡红细胞，轻摇后静置30分钟以上，1500rp/m离心2～5分钟。也可用不具有特异性抗体的被检禽红细胞代替鸡红细胞。附件六：消毒1药品种类烧碱、醛类、氧化剂类、氯制剂类、双季胺盐类等。2消毒范围禽舍地面及内外墙壁，舍外环境，饲养、饮水等用具，运输等设施设备以及其它一切可能被污染的场所和设施设备。3消毒前的准备3.1消毒前必须清除有机物、污物、粪便、饲料、垫料等；3.2消毒药品必须选用对禽流感病毒有效的；3.3备有喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒防护器械（如口罩、手套、防护靴等）、消毒容器等。4消毒方法4.1金属设施设备的消毒，可采取火焰、薰蒸等方式消毒；4.2禽舍、场地、车辆等，可采用消毒液清洗、喷洒等方式消毒；4.3养禽场的饲料、垫料等，可采取堆积发酵或焚烧等方式处理；4.4粪便等可采取堆积密封发酵或焚烧等方式处理；4.5饲养、管理等人员可采取淋浴消毒；4.6衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高压灭菌等方式消毒；4.7疫区范围内办公、饲养人员的宿舍、公共食堂等场所，可采用喷洒的方式消毒；4.8屠宰加工、贮藏等场所以及区域内池塘等水域的消毒可采取相应的方式进行，避免造成污染。马传染性贫血防治技术规范马传染性贫血（EquineInfectiousAnemia,EIA,简称马传贫）,是由反转录病毒科慢病毒属马传贫病毒引起的马属动物传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。为预防、控制和消灭马传贫，依据《中华人民共和国动物防疫法》及有关的法律法规，特制定本规范。1适用范围本规范规定了马传贫的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施、控制和消灭标准。本规范适用于中华人民共和国境内一切从事马属动物饲养、经营，马属动物产品的生产、经营，及从事动物防疫活动的单位和个人。2诊断本病依据流行特点、临床症状、病理变化可做出初步诊断，确诊需进一步做琼脂扩散试验（AGID）或酶联免疫吸附试验（ELISA）或病原分离鉴定。2.1流行特点本病只感染马属动物，其中，马最易感，驴、骡次之，且无品种、性别、年龄的差异。病马和带毒马是主要的传染源。主要通过虻、蚊、刺蝇及蠓等吸血昆虫的叮咬而传染，也可通过病毒污染的器械等传播。多呈地方性流行或散发，以7～9月份发生较多。在流行初期多呈急性型经过，致死率较高，以后呈亚急性或慢性经过。2.2临床症状本病潜伏期长短不一，一般为20～40天，最长可达90天。根据临床症状，常分为急性、亚急性、慢性和隐性四种类型。急性型高热稽留。发热初期，可视粘膜潮红，轻度黄染；随病程发展逐渐变为黄白至苍白；在舌底、口腔、鼻腔、阴道粘膜及眼结膜等处，常见鲜红色至暗红色出血点（斑）等。亚急性型呈间歇热。一般发热39℃以上，持续3～5天退热至常温，经3～15天间歇期又复发。有的患病马属动物出现温差倒转现象。慢性型不规则发热，但发热时间短。病程可达数月或数年。隐性型无可见临床症状，体内长期带毒。2.3病理变化2.3.1剖检变化急性型主要表现败血性变化，可视粘膜、浆膜出现出血点（斑），尤其以舌下、齿龈、鼻腔、阴道粘膜、眼结膜、回肠、盲肠和大结肠的浆膜、粘膜以及心内外膜尤为明显。肝、脾肿大，肝切面呈现特征性槟榔状花纹。肾显著增大，实质浊肿，呈灰黄色，皮质有出血点。心肌脆弱，呈灰白色煮肉样，并有出血点。全身淋巴结肿大，切面多汁，并常有出血。亚急性和慢性型主要表现贫血、黄染和细胞增生性反应。脾中（轻）度肿大，坚实，表面粗糙不平，呈淡红色；有的脾萎缩，切面小梁及滤泡明显；淋巴小结增生，切面有灰白色粟粒状突起。不同程度的肝肿大，呈土黄或棕红色，质地较硬，切面呈豆蔻状花纹（豆蔻肝）；管状骨有明显的红髓增生灶。2.3.2病理组织学病变主要表现为肝、脾、淋巴结和骨髓等组织器官内的网状内皮细胞明显肿胀和增生。急性病例主要为组织细胞增生，亚急性及慢性病例则为淋巴细胞增生，在增生的组织细胞内，常有吞噬的铁血黄素。2.4实验室诊断2.4.1马传贫琼脂扩散试验(AGID)（见附件一）。2.4.2马传贫酶联免疫吸附试验(ELISA)(见附件二)。2.4.3马传贫病原分离鉴定（见附件三）。2.4.4结果判定AGID试验阴性反应马属动物，还应在1～2周后再次采血检查，方可确诊。ELISA可检测早期和较低浓度的抗体。基于ELISA试验易产生假阳性，有必要时，阳性反应血清需再次用AGID试验确诊。幼驹检测为阳性的，必须检查母体的抗体情况。如果母体存在马传贫抗体,须隔6个月后再次检查幼驹方可确诊。3疫情报告3.1任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的动物，都应当及时向当地动物防疫监督机构报告。3.2动物防疫监督机构接到疫情报告后，按《动物疫情报告管理办法》及有关规定执行。已经通过农业部验收达到消灭标准的地区，一旦再次发现疫情，视同新发动物疫病的疫情报告规定处理和上报。4疫情处理4.1发现疑似马传贫病马属动物后，畜主应立即隔离疑似患病马属动物，限制其移动,并立即向当地动物防疫监督机构报告。动物防疫监督机构接到报告后,应及时派员到现场诊断，包括流行病学调查、临床症状检查、病理解剖检查、采集病料、实验室诊断等，并根据诊断结果采取相应防治措施。4.2在马属动物饲养地，确诊为马传贫病畜后，当地县级以上人民政府畜牧兽医行政管理部门应当划定疫点、疫区、受威胁区;县级以上地方人民政府根据需要组织有关部门和单位采取隔离、扑杀、销毁、消毒、限制易感动物和动物产品及有关物品出入等控制、扑灭措施。若呈暴发流行时，由当地畜牧兽医行政管理部门，及时报请同级人民政府决定对疫区实行封锁，逐级上报国务院畜牧兽医行政管理部门。县级以上人民政府根据需要组织有关部门和单位采取隔离、扑杀等强制性控制和扑灭措施，并迅速通报毗邻地区。4.2.1划定疫点、疫区、受威胁区疫点指患病马属动物所在的地点，一般是指患病马属动物所在的养殖场（户）或其它有关屠宰、经营单位。疫区是指患病马属动物所在的自然村（屯）、马属动物饲养单位以及发病前3个月经常活动，可能污染的地区或以疫点为中心，半径3～5公里范围内的区域。疫区划分时注意考虑疫区的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）。受威胁区是指疫区邻近的自然村（屯）、单位，或疫区外顺延5～30公里范围内的区域。4.2.2封锁疫点（区）封锁期间，禁止染疫和疑似染疫的马属动物及其产品出售、转让和调群；繁殖马属动物要用人工授精方法进行配种；种用马属动物不得对疫区外马属动物配种；对可疑马属动物要严格隔离检疫；关闭马属动物交易市场。禁止非疫区的马属动物进入疫区，并根据扑灭疫情的需要对出入封锁区的人员、运输工具及有关物品采取消毒和其它限制性措施。4.2.3隔离当发生马传贫时，要及时应用临床检查、血清学试验等方法进行检测，根据检测结果，将马属动物群分为患病群、疑似感染群和假定健康群三类。立即扑杀患病群，隔离疑似感染群、假定健康群，经过3个月观察，不再发病后，方可解除隔离。4.2.4监测疫区内应对同群马属动物隔离饲养，所有马属动物每隔1个月进行一次血清学监测；受威胁地区每3个月进行一次血清学监测。4.2.5扑杀患病马属动物、阳性马属动物在不放血条件下进行扑杀。4.2.6无害化处理病畜和阳性畜及其胎儿、胎衣、排泄物等按照GB16548《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》进行。4.2.7消毒对患病和疑似患病的马属动物污染的场所、用具、物品严格进行消毒；受污染的粪便、垫料等必须采用堆积密封发酵1个月等方法处理。4.2.8封锁的解除封锁的疫区内最后一匹阳性马属动物扑杀处理后，并经彻底消毒等处理后，对疫区监测90天，未见新病例；且经血清学检查3次（每次间隔30天），未检出阳性马属动物的，对所污染场所、设施设备和受污染的其它物品彻底消毒，经当地动物防疫监督机构检查合格后，方可由原发布封锁令机关解除封锁。5预防与控制5.1加强饲养管理，提高马匹抗病能力。5.2认真做好卫生消毒、消灭蚊虻等工作，防止疫病传播。5.3控制区、稳定控制区和无疫区,禁止接种疫苗。5.4异地调入的马属动物，必须来自无疫区。调出马属动物的单位和个人，应按规定报检，经当地动物防疫监督机构进行检疫(应包括血清学检查),合格后方可调出。调入后必须隔离观察30天以上，并经当地动物防疫监督机构两次临床综合诊断和血清学检查，确认健康无病，方可混群饲养。5.5运出县境的马属动物，运输部门要凭当地动物防疫监督机构出具的检疫证明运输。运输途中发现疑似马传贫病畜时，货主及运输部门应及时向就近的动物防疫监督机构报告，确诊后，由动物防疫监督机构就地监督畜主实施扑杀等处理措施。5.6监测马传贫控制区、稳定控制区采取“监测、扑杀、消毒、净化”的综合防治措施。每年对全县6～12月龄的幼驹，用血清学方法监测一次。如果检出阳性马属动物，除按规定扑杀处理外，应对疫区内的所有马属动物进行临床检查和血清学检查，每隔3个月检查一次，直至连续2次血清学检查全部阴性为止。马传贫消灭区采取“以疫情监测为主”的综合性防治措施,每县每年抽查存栏马属动物的1%（存栏不足10000匹的，抽检数不少于100匹，存栏不足100匹的全检）,做血清学检查,进行疫情监测,及时掌握疫情动态。6控制和消灭标准6.1稳定控制标准6.1.1县级稳定控制标准必须满足以下两个条件:A、全县（市、区或旗）范围内连续5年没有马传贫临床病例；B、全县（市、区或旗）停止注苗一年后，连续两年每年抽检300匹份马属动物血清（不满300匹全检），经血清学检查，全部阴性。6.1.2市级稳定控制标准全市（地、盟、州）所有县（市、区、旗）均达到稳定控制标准。6.1.3省级稳定控制标准全省所有市（地、盟、州）均达到稳定控制标准。6.1.4全国稳定控制标准全国所有省（市、自治区）均达到稳定控制标准。6.2消灭标准6.2.1县级达到消灭标准，在达到稳定控制标准的基础上，还应符合以下两个条件:A、全县（市、区或旗）范围内临床综合诊断无病畜。B、全县（市、区或旗）范围内在达到稳定控制标准后，连续两年每年抽检200匹份马属动物血清（不满200匹者全检），血清学检查全部为阴性。6.2.2市级消灭标准全市（地、盟、州）所有县（市、区、旗）均达到消灭标准。6.2.3省消灭标准全省所有市（地、盟、州）均达到消灭标准。6.2.4全国消灭标准全国所有省（市、自治区）均达到消灭标准。附件一:马传染性贫血琼脂扩散反应试行操作方法1检验用琼脂板的制备1.1取高级琼脂糖1克或普通琼脂1.2克直接放入加有500mL蒸馏水的三角瓶中，配成2%的琼脂溶液，在沸水浴中煮沸，全融化后再冷凝，切成1～1.5cm3小块，装入干净砂布袋中，用10倍量自来水冲漂两天，每天换水两次，然后改用无离子水冲漂1～2天，每天换水两次。将冲漂完毕的琼脂小块装入1000mL三角烧瓶中，同时加入500mL无离子水再加入相当于配制1000mL磷酸缓冲液（PBS液）或硼酸缓冲液（BBS液）的各种盐类用量，再加入1%硫柳汞溶液10mL，在沸水浴中使之全融化并混匀。若是取优质琼脂1克时，可直接放入含有1/万硫柳汞的100mL的PBS或BBS液中，用热水浴融化混匀。1.2融化后以两层纱布夹薄层脱脂棉过滤，除去不溶性杂质。1.3将直径90mm的平皿放在水平台上，每平皿倒入热融化琼脂液15～18mL，厚度约2.5mm左右，注意不要产生气泡，冷凝后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发，放在普通冰箱中可保存两周左右。根据受检血清样品多少亦可采用大、中、小三种不同规格的玻璃板。10×16cm的玻璃板加注热琼脂液40mL；6×7cm的加注11mL；32×7.6cm的加注6mL。琼脂经处理后配成的琼脂液，可装瓶中用胶塞盖好，以防水分蒸发，待使用琼脂板时，现融化现倒。1.4打孔反应孔现用现打。打孔器为外径4及6mm直径的薄壁型金属打孔器。在坐标纸上画好七孔型图案。把坐标纸放在带有琼脂板的平皿或玻璃板下面，照图案在固定位置上用金属管打孔，将切下的琼脂板取出，勿使琼脂膜与玻璃面离动。外周孔径为6mm，中央孔径为4mm，孔间距3mm，如图1所示。图17孔型(1)(2)(3)G(4)(5)(6)当受检血清数量多时，可用如图2所示的检测40份血清的图案。图240孔型010203040506+G+G+G+0708091011121314151617181920+G+G+G+G+2122232425262729293031323334+G+G+G+353637383940注解：图1、图2中的“G”字周围应有圆圈。2抗原检验用抗原按马传贫琼扩抗原生产制造及检验规程进行生产。3血清3.1检验用标准阳性血清：能与合格抗原在12小时内产生明显致密的沉淀线的马传贫血清，做8倍以上的稀释仍保持阳性反应者为宜，小量分装，冻结保存，使用时要注意防止散毒。3.2受检血清：来自受检马的不腐败的血清，勿加防腐剂和抗凝剂。4抗原及血清的添加打孔完毕，在琼脂板上端写上日期及编号等。在图1(7孔型)的中央孔加抗原，2、5孔加检验用标准阳性血清，其余1、3、4、6孔加入受检血清。在图2(40份血清)的孔型所有①②③……数字号孔分别加入受检马血清，G为加抗原孔，+为加检验用包被阳性血清孔，加至孔满为止。平皿加盖，待孔中液体吸干后，将平皿倒置，以防水分蒸发；琼脂板则放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘中。置15～30℃条件下进行反应，逐日观察3天并记录结果。5判定阳性：当检验用标准阳性血清孔与抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线时，受检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线；或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清的抗原侧偏弯者，此种受检血清判定为阳性。阴性：受检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者，此种受检血清为阴性。疑似：标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端，似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯，但不易判断时，可将抗原稀释2倍、4倍、6倍、8倍进行复试，最后判定结果。观察时间可延至5天。判定结果时，应从不同折光角度仔细观察平皿上抗原孔与受检血清孔之间有无沉淀线。判断时要注意非特异性沉淀线。例如当受检马匹近期注射过组织培养疫苗，如乙型脑炎疫苗等，可见与检验用标准阳性血清的沉淀线末端不是融合而为交叉状，两个血清间产生的自家免疫沉淀线等。6溶液的配制6.1pH7.4的0.01mol/L磷酸缓冲生理盐水（PBS液）6.212水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.9克磷酸二氢钾0.3克氯化钠8.0克无离子水或蒸馏水加至1000mL6.3pH8.6硼酸缓冲液（BBS液）四硼酸钠8.8克硼酸4.65克无离子水或蒸馏水加至1000mL6.4硫柳汞溶液硫柳汞1.0克无离子水或蒸馏水1000mL附件二:马传染性贫血酶联免疫吸附试验（间接法）1总则本规程所规定的酶联免疫吸附试验（ELISA）适用于马传染性贫血（以下简称马传贫）的检疫，也可以用于马传贫弱毒苗免疫马的抗体监测。2材料准备2.1器材2.1.1聚苯乙烯微量反应板2.1.2酶标仪2.2抗原、酶标记抗体和阴、阳性标准血清2.3试验溶液（配置方法见附录）2.3.1抗原稀释掖2.3.2冲洗液2.3.3酶标记抗体及血清稀释液2.3.4底物溶液2.3.5反应终止液3操作方法3.1包被抗原用抗原稀释液将马传贫ELISA抗原作20倍稀释，用微量移液器将稀释抗原加到各孔内，每孔100μ1。盖好盖，置4℃冰箱放置24小时。3.2冲洗甩掉孔内的包被液，注入冲洗液浸泡3分钟，甩干，再重新注入冲洗液，按此方法洗3次。3.3被检血清每份被检血清及阳性对照血清、阴性对照血清均以血清稀释液作20倍稀释，每份被检血清依次加两孔，每孔加100μ1。每块反应板均需设阳性及阴性对照血清各两孔，盖好盖，置37℃3.4冲洗方法同“3.2”3.5加酶标记抗体将酶标记抗体用稀释液作1000倍稀释。每孔加100μ1，盖好盖，置37℃3.6冲洗方法同“3.2”3.7加底物溶液每孔加新配制的底物溶液100μ1，于25℃～303.8终止反应每孔滴加终止剂25μ1。3.9比色用酶标测试仪在波长492nm下，测各孔降解产物的吸收值。4结果判定被检血清两孔的平均吸收值与同块板阴性对照血清两个孔的平均吸收值之比≥2，且被检血清吸收值≥0.2者，为马传贫阳性。5附录5.1聚苯乙烯微量板的处理5.1.1将聚苯乙烯微量板用温水反复冲洗，彻底冲掉灰尘。5.1.2用无离子水冲洗3～4遍，室温或37℃5.2试液的配制5.2.1抗原稀释液：0.1mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液。甲液：0.1mol/LpH9.5碳酸钠溶液，称取无水Na2CO310.6克，以无离子水溶液溶解至1000mL。乙液：0.1mol/LpH9.5碳酸氢钠溶液，称取NaHCO38.4克，以无离子水溶液溶解至1000mL。取甲液200mL、乙液700mL混合即成。5.3冲洗液：0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐温-20。5.3.10.02mol/LpH7.2PBS液甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液称取Na2HPO4.12H2O71.64克，以无离子水溶液溶解至1000mL。乙液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液称取NaH2PO4.2H2O31.21克，以无离子水溶液溶解至1000mL。取甲液360mL，乙液140mL，NaCL38克，无离子水溶解至5000mL。5.3.20.02mol/LpH7.2PBS液1000mL，加吐温-20液0.5mL混匀即成。5.3.3酶标记抗体和血清稀释液：0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐温-20，加0.1%明胶，加10%健康牛血清。5.3.4底物溶液：pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，内含0.04%邻苯二胺和0.045%过氧化氢。5.3.4.1pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液：甲液0.1mol/L柠檬酸溶液，称取柠檬酸（C6H8O7·H2O）21.01克以无离子水溶液溶解至1000mL。乙液0.2mol/L磷酸氢二钠溶液。取甲液243mL，乙液257mL混合即成。5.3.4.2称取邻苯二胺40mg溶于pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液100mL中。临用前加30%过氧化氢150μL即成。根据试验需要可按此比例增减。5.3.5反应终止剂：2mol/L硫酸；取浓H2SO4（纯度95～98%）4mL加入32mL无离子水中混匀即成。附件三:马传染性贫血病毒分离鉴定通常是将病料接种于健康马驹或接种于马白细胞培养物，其中以接种马驹法更为敏感。1马匹接种试验1.1试验驹：选自非马传染性贫血（以下简称马传贫）疫区，1～2岁，经3周以上系统检查，确认健康者。1.2接种材料：无菌采取可疑马传贫马（最好是可疑性较大或高热期病马）的血液。如怀疑混合感染时，须用细菌滤器过滤血清，接种材料应尽可能低温保存，保存期不宜过长。接种前进行无菌和安全检查。1.3接种方法：常用2～3匹马的材料等量混合，接种2匹以上的试验驹，皮下接种0.2～0.3mL左右。1.4观察期3个月。每日早、晚定期测温两次，定期进行临床、血液学及抗体检查。当马驹发生典型马传贫的症状和病理变化，或血清中出现马传贫特异性抗体时，即证明被检材料中含有马传贫病毒。2用白细胞培养物分离病毒培养驴白细胞1～2天后，细胞已贴壁并伸出突起，换入新鲜营养液，并在营养液中加入被检材料，接入被检材料的量应不大于营养液量的10%，否则可能使培养物发生非特异性病变。也可在倾弃旧营养液后，直接接种被检材料，37℃吸附1～2小时后吸弃接种物，换入新鲜营养液。初代分离培养通常难以出现细胞病变，一般需盲传2～3代，甚至更多的代次（每代7～8天）。如果被检材料中有马传贫病毒存在，培养物将最终出现以细胞变圆、破碎、脱落为特征的细胞病变。为了证明细胞病变是由马传贫病毒而不是由其它原因引起的，应该以马传染性贫血酶联免疫吸附试验（间接法）（附件二）等检查培养物的抗原性。如果引起白细胞出现细胞病变并具有明显的马传贫抗原性，则说明被检材料中含有马传贫病毒。马鼻疽防治技术规范马鼻疽(Glanders)是由假单胞菌科假单胞菌属的鼻疽假单胞菌感染引起的一种人兽共患传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。为预防、控制和消灭马鼻疽，依据《中华人民共和国动物防疫法》及有关的法律法规，特制定本规范。1适用范围本规范规定了马鼻疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施、控制和消灭标准。本规范适用于中华人民共和国境内一切从事马属动物的饲养、经营和马属动物产品的生产、经营，以及从事动物防疫活动的单位和个人。2诊断无临床症状慢性马鼻疽的诊断以鼻疽菌素点眼为主，血清学检查为辅；开放性鼻疽的诊断以临床检查为主，病变不典型的，则须进行鼻疽菌素点眼试验或血清学试验。2.1流行特点以马属动物最易感，人和其它动物如骆驼、犬、猫等也可感染。鼻疽病马以及患鼻疽的其它动物均为本病的传染源。自然感染主要通过与病畜接触，经消化道或损伤的皮肤、粘膜及呼吸道传染。本病无季节性,多呈散发或地方性流行。在初发地区，多呈急性、暴发性流行；在常发地区多呈慢性经过。2.2临床症状本病的潜伏期为6个月。临床上常分为急性型和慢性型。急性型病初表现体温升高，呈不规则热（39～41℃）和颌下淋巴结肿大等全身性变化。肺鼻疽主要表现为干咳，肺部可出现半浊音、浊音和不同程度的呼吸困难等症状；鼻腔鼻疽可见一侧或两侧鼻孔流出浆液、粘液性脓性鼻汁，鼻腔粘膜上有小米粒至高粱米粒大的灰白色圆形结节突出粘膜表面，周围绕以红晕，结节坏死后形成溃疡，边缘不整，隆起如堤状，底面凹陷呈灰白色或黄色；皮肤鼻疽常于四肢、胸侧和腹下等处发生局限性有热有痛的炎性肿胀并形成硬固的结节。结节破溃排出脓汁，形成边缘不整、喷火口状的溃疡，底部呈油脂样，难以愈合。结节常沿淋巴管径路向附近组织蔓延，形成念珠状的索肿。后肢皮肤发生鼻疽时可见明显肿胀变粗。慢性型临床症状不明显，有的可见一侧或两侧鼻孔流出灰黄色脓性鼻汁，在鼻腔粘膜常见有糜烂性溃疡，有的在鼻中膈形成放射状斑痕。2.3病理变化主要为急性渗出性和增生性变化。渗出性为主的鼻疽病变见于急性鼻疽或慢性鼻疽的恶化过程中；增生性为主的鼻疽病变见于慢性鼻疽。肺鼻疽鼻疽结节大小如粟粒，高粱米及黄豆大，常发生在肺膜面下层，呈半球状隆起于表面，有的散布在肺深部组织，也有的密布于全肺，呈暗红色、灰白色或干酪样。鼻腔鼻疽鼻中膈多呈典型的溃疡变化。溃疡数量不一，散在或成群，边缘不整，中央象喷火口，底面不平呈颗粒状。鼻疽结节呈黄白色，粟粒呈小豆大小，周围有晕环绕。鼻疽斑痕的特征是呈星芒状。皮肤鼻疽初期表现为沿皮肤淋巴管形成硬固的念珠状结节。多见于前驱及四肢，结节软化破溃后流出脓汁，形成溃疡，溃疡有堤状边缘和油脂样底面，底面覆有坏死性物质或呈颗粒状肉芽组织。2.4实验室诊断2.4.1变态反应诊断变态反应诊断方法有鼻疽菌素点眼法、鼻疽菌素皮下注射法、鼻疽菌素眼睑皮内注射法，常用鼻疽菌素点眼法（见附件）。2.4.2鼻疽补体结合反应试验（见附件）。该方法为较常用的辅助诊断方法，用于区分鼻疽阳性马属动物的类型，可检出大多数活动性患畜。2.5病畜的判定2.5.1具有明显鼻疽临床症状的马属动物为开放性鼻疽病畜。2.5.2鼻疽菌素点眼阳性者为鼻疽阳性畜。3疫情报告3.1任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的动物，都应当及时向当地动物防疫监督机构报告。3.2动物防疫监督机构接到疫情报告后，按《动物疫情报告管理办法》及有关规定执行。已经通过农业部验收达到消灭标准的地区，一旦再次发现疫情，视同新发动物疫病的疫情报告规定处理和上报。4疫情处理4.1发现疑似患病马属动物后，畜主应立即隔离患病马属动物，限制其移动，并立即向当地动物防疫监督机构报告。动物防疫监督机构接到报告后，应及时派员到现场进行诊断，包括流行病学调查、临床症状检查、病理解剖、采集病料、实验室诊断等，并根据诊断结果采取相应防治措施。4.2确诊为马鼻疽病畜后，当地县级以上人民政府畜牧兽医行政管理部门应当立即派人到现场，划定疫点、疫区、受威胁区;采集病料、调查疫源，及时报请同级人民政府对疫区实行封锁，并将疫情逐级上报国务院畜牧兽医行政管理部门。县级以上人民政府根据需要组织有关部门和单位采取隔离、扑杀、销毁、消毒等强制性控制、扑灭措施，并通报毗邻地区。4.2.1划定疫点、疫区、受威胁区疫点指患病马属动物所在的地点，一般是指患病马属动物的同群畜所在的养殖场（户）或其它有关屠宰、经营单位。疫区是指患病马属动物所在的自然村（屯）、饲养马属动物单位以及发病前三个月经常活动的地区或以疫点为中心，半径3～5公里范围内的区域。疫区划分时注意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）。受威胁区是指疫区邻近的自然村（屯）、单位，或疫区外顺延5～30公里范围内的区域。4.2.2封锁疫点（区）封锁期间，染疫和疑似染疫的马属动物及其产品不得出售、转让和调群,禁止移出疫区；繁殖马属动物要用人工授精方法进行配种；种用马属动物不得对疫区外马属动物配种；对可疑马属动物要严格隔离检疫；关闭马属动物交易市场。禁止非疫区的马属动物进入疫区，并根据扑灭疫情的需要对出入封锁区的人员、运输工具及有关物品采取消毒和其它限制性措施。4.2.3隔离当发生马鼻疽时，要及时应用变态反应等方法在疫点对马属动物进行检测，根据检测结果，将马属动物群分为患病群、疑似感染群和假定健康群三类。立即扑杀患病群，隔离观察疑似感染群、假定健康群。经6个月观察，不再发病方可解除隔离。4.2.4监测疫区内须对疑似感染马属动物和周围的马属动物隔离饲养，每隔6个月监测一次，受威胁区每年进行两次血清学（鼻疽菌素试验）监测，直至全部阴性为止;无疫区每年进行一次血清学监测。4.2.5扑杀对临床病畜和鼻疽菌素试验阳性畜，均须在不放血条件下进行扑杀。4.2.6销毁处理病畜和阳性畜及其胎儿、胎衣、排泄物等按照GB16548《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》进行无害化处理。焚烧和掩埋的地点应选择距村镇、学校、水源、牧场、养殖场等1公里以外的地方，挖深坑将尸体焚烧后掩埋，掩埋土层不得低于1.5米。4.2.7消毒对患病或疑似感染马属动物污染的场所、用具、物品等严格进行消毒；污染的垫料及粪便等采取堆积泥封发酵、高温等方法处理后方可使用。4.2.8封锁的解除疫区从最后一匹患病马属动物扑杀处理后，并经彻底消毒等处理后，对疫区内监测90天，未见新病例；且经过半年时间采用鼻疽菌素试验逐匹检查，未检出鼻疽菌素试验阳性马属动物的，并对所污染场所、设施设备和受污染的其它物品彻底消毒后，经当地动物防疫监督机构检查合格，由原发布封锁令机关解除封锁。5预防与控制5.1加强饲养管理，做好消毒等基础性防疫工作，提高马匹抗病能力。5.2异地调运马属动物，必须来自非疫区；出售马属动物的单位和个人，应在出售前按规定报检，经当地动物防疫监督机构检疫，证明马属动物装运之日无马鼻疽症状，装运前6个月内原产地无马鼻疽病例，装运前15天经鼻疽菌素试验或鼻疽补体结合反应试验，结果为阴性，并签发产地检疫证后，方可启运。调入的马属动物必须在当地隔离观察30天以上，经当地动物防疫监督机构连续两次（间隔5～6天）鼻疽菌素试验检查，确认健康无病，方可混群饲养。5.3运出县境的马属动物，运输部门要凭当地动物防疫监督机构出具的运输检疫证明承运，证明随货同行。运输途中发生疑似马鼻疽时，货主及承运者应及时向就近的动物防疫监督机构报告，经确诊后，动物防疫监督机构就地监督畜主实施扑杀等处理措施。5.4监测稳定控制区每年每县抽查200匹（不足200匹的全检），进行鼻疽菌素试验检查，如检出阳性反应的，则按控制区标准采取相应措施。消灭区每县每年鼻疽菌素试验抽查马属动物100匹（不足100匹的全检）。6控制和消灭标准6.1控制标准6.1.1县级控制标准控制县（市、区、旗）应达到以下三项标准：A、全县（市、区、旗）范围内,连续两年无马鼻疽临床病例。B、全县（市、区、旗）范围内连续两年检查，每年抽检200匹（不足200匹全检），经鼻疽菌素试验阳性率不高于0.5%。C、鼻疽菌素试验阳性马属动物全部扑杀，并做无害化处理。6.1.2市级控制标准全市（地、盟、州）所有县（市、区、旗）均达到控制标准。6.1.3省级控制标准全省所有市（地、盟、州）均达到控制标准。6.1.4全国控制标准全国所有省（市、自治区）均达到控制标准。6.2消灭标准6.2.1县级消灭标准必须具备以下两项条件：A、达到控制标准后，全县（市、区、旗）范围内连续两年无马鼻疽疫情。B、达到控制标准后，全县（市、区、旗）范围内连续两年鼻疽菌素试验检查，每年抽检100匹（不足100匹者全检），全部阴性。6.2.2市级消灭标准全市（地、盟、州）所有县（市、区、旗）均达到消灭标准。6.2.3省消灭标准全省所有市（地、盟、州）均达到消灭标准。6.2.4全国消灭标准全国所有省（市、自治区）均达到消灭标准。附件:马鼻疽诊断技术及判定标准1总则1.1为统一马鼻疽（以下简称鼻疽）检疫诊断技术及判定标准，并提高鼻疽诊断技术及判定标准的准确性，特制定鼻疽诊断技术及判定标准（以下简称本标准）。1.2对马、驴、骡进行鼻疽检疫时，统一按本标准规定办理。1.3本标准以鼻疽菌素点眼反应为主。必要时进行补体结合反应、鼻疽菌素皮下注射反应或眼睑皮内注射反应。1.4凡鼻疽临床症状显著的马、骡、驴，确认为开放性鼻疽的，可以不进行检疫。1.5各种检疫记录表（见7附件），须保存2年以上。2鼻疽菌素点眼操作方法2.1器材药品：2.1.1鼻疽菌素、硼酸、来苏尔、脱脂棉、纱布、酒精、碘酒、记录表。2.1.2点眼器、唇（耳）夹子、煮沸消毒器、镊子、消毒盘、工作服、口罩、线手套。注意：在所盛鼻疽菌素用完或在点眼过程中被污染（接触结膜异物）的点眼器，必须消毒后再使用。2.2点眼前必须两眼对照，详细检查眼结膜和单、双瞎等情况，并记录。眼结膜正常者可进行点眼，点眼后检查颌下淋巴结，体表状况及有无鼻漏等。2.3规定间隔5～6日做两回点眼为一次检疫，每回点眼用鼻疽菌素原液3～4滴（0.2～0.3mL），两回点眼必须点于同一眼中，一般应点于左眼，左眼生病可点于右眼，并在记录中说明。2.4点眼应在早晨进行，最后第9小时的判定须在白天进行。2.5点眼前助手固定马匹，术者左手用食指插入上眼睑窝内使瞬膜露出，用拇指拨开下眼睑构成凹兜，右手持点眼器保持水平方向，手掌下缘支撑额骨眶部，点眼器尖端距凹兜约1cm，拇指按胶皮乳头滴入鼻疽菌素3～4滴。2.6点眼后注意系栓。防止风沙侵入、阳光直射眼睛及动物自行磨擦眼部。2.7判定反应。在点眼后3、6、9小时，检查3次，尽可能于注射24小时处再检查一次。判定时先由马头正面两眼对照观察，在第6小时要翻眼检查，其余观察必要时须翻眼。细查结膜状况，有无眼眦，并按判定符号记录结果。2.8每次检查点眼反应时均应记录判定结果。最后判定以连续两回点眼之中最高一回反应为准。2.9鼻疽菌素点眼反应判定标准：2.9.1阴性反应：点眼后无反应或结膜轻微充血及流泪，为阴性。记录为“－”。2.9.2疑似反应：结膜潮红，轻微肿胀，有灰白色浆液性及粘液性（非脓性）分泌物（眼眦）的，为疑似阳性。记录为“±”。2.9.3阳性反应：结膜发炎，肿胀明显，有数量不等脓性分泌物（眼眦）的为阳性。记录为“＋”。3鼻疽菌素皮下注射（热反应操作方法）3.1药品器材：3.1.1鼻疽菌素原液、来苏尔、酒精、碘酒、脱脂棉、纱布、记录表。3.1.2工作服、口罩、线手套、毛刷、毛剪、耳夹子、注射器、针头、体温计、煮沸消毒器、消毒盘、镊子。3.2皮下注射前一日做一般临床检查，早午晚分别测量并记录体温，体温正常的方可做皮下注射。3.3皮下注射前所测3次体温，其中如有一次超过39℃，或3次体温平均数超过38.53.4注射部位通常在左颈侧或胸部肩胛前，术部剪毛消毒后注射鼻疽菌素原液1mL。3.5牲畜在注射后24小时内不得使役，不得饮冷水。3.6注射通常在零点进行。注射后6小时起测温，每隔2小时测一次（即注射后6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时），连续测温10次后，再于36小时测温一次，详细记录并划出体温曲线，同时记录局部肿胀程度，以备判定。局部肿胀以手掌大（横径10cm）为明显反应。3.7皮下注射鼻疽菌素的马、驴、骡可发生体温反应及局部或全身反应。3.7.1体温反应：鼻疽病畜一般在皮下注射鼻疽菌素后6～8小时体温开始上升，12～16小时体温上升到最高，此后逐渐降低，有的在注射30～36小时后，体温再度轻微上升。3.7.2局部反应：注射部位发热，肿胀疼痛，以注射后24～36小时最为显著，直径可达10～20cm，并逐渐消散，有时肿胀可存在2～3天。3.7.3全身反应：注射后精神不振，食欲减少，呼吸短促，脉搏加快，步态踉跄、战栗，大小便次数增加，颌下淋巴结肿大。3.8鼻疽菌素皮下注射（热反应）判定标准如下：3.8.1阴性反应：体温升至摄氏39℃3.8.2疑似反应：体温升至39℃（不超过39.6℃），有轻微全身反应及局部反应者，或体温升至3.8.3阳性反应：体温升至40℃以上稽留及有轻微局部反应，或体温在39℃以上稽留并有显著的局部反应（肿胀横径4鼻疽菌素眼睑皮内注射操作方法4.1药品及器材：4.1.1鼻疽菌素（用前随时稀释，鼻疽菌素1份用0.5%石炭酸生理盐水3份充分混匀）。4.1.21～2mL注射器、针头（用前煮沸消毒）、消毒盘、煮沸消毒器、镊子、耳夹子、工作服、口罩、线手套。4.1.3酒精、碘酒、硼酸、来苏尔、纱布、脱脂棉、记录表。4.2注射前检查结膜及眼睛是否单、双瞎等情况。注射后检查颌下淋巴结及有无鼻漏，并详细记录检查情况。4.3注射部位通常在左下眼睑边缘1～2cm内侧眼角三分之一处皮肤实质内，注射前用硼酸棉消毒注射部位。4.4注射前助手保定马匹，术者用食指、拇指捏住下眼睑，右手持注射器，手掌（小指外缘）支撑头部对左手捏起的眼睑皱襞术部斜向刺入下眼睑皮内，注入0.1mL鼻疽菌素，食指感觉注射液推进迟滞，局部呈现小包，即为药液已进入皮内。4.5注射一般在早晨。注射后第24、36、48小时分别进行检查。详细记录结果。4.6鼻疽菌素眼睑皮内注射反应判定标准：4.6.1阴性反应：无反应或下眼睑有极轻微肿胀、流泪的，为阴性反应。记录为“－”。4.6.2疑似反应：下眼睑稍肿胀，有轻微疼痛及发热，结膜潮红，无分泌物或仅有浆粘液性分泌物的，为疑似阳性，记录为“±”。4.6.3阳性反应：下眼睑肿胀明显，有显著的疼痛及灼热，结膜发炎畏光，有脓性分泌物的，为阳性。记录为“＋”。5开放性鼻疽临床诊断鉴别要领5.1将病畜保定，术者和助手穿工作服（避免白色），带胶皮手套、口罩、风镜及保护面具，先用3%来苏尔水，洗净病畜鼻孔内外后，在病畜前侧面适当位置，术者用手打开鼻孔，助手用反射镜或手电筒照射鼻腔深部，仔细检查粘膜上有无鼻疽特有结节溃疡及星芒状瘢痕及其它异状。检查完毕将服装、器材分别进行消毒（用3%来苏尔水浸1小时或煮沸10分钟），避免交叉传染。5.2鼻腔鼻疽临床症状如下：5.2.1鼻汁：初在鼻孔一侧（有时两侧）流出浆液性或粘液性鼻汁，逐渐变为不洁灰黄色脓性鼻汁，内混有凝固蛋白样物质，有时混有血丝并带有臭味，呼吸带哮鸣音。5.2.2鼻粘膜发生结节及溃疡：在流鼻汁同时或稍迟，鼻腔粘膜尤其是鼻中膈粘膜上出现新旧大小不同灰白色或黄白色的鼻疽结节，结节破溃构成大小不等、深浅不一、边缘隆起的溃疡（结节与溃疡多发生于鼻腔深部粘膜上），已愈者呈扁平如星芒状、冰花状的瘢痕。5.2.3颌下淋巴结肿大：急性或慢性鼻疽的经过期颌下淋巴结肿胀，初有痛觉，时间长久，则变硬、触摸无痛感，附着于下颌骨内面不动，有时也呈活动性。5.3皮肤鼻疽临床症状如下：皮肤鼻疽多发于四肢、胸侧及下腹部，在皮肤或皮下组织发生黄豆大小或胡桃、鸡蛋大结节，不久破裂流出粘稠灰黄或红色脓汁（有时带血）形成浅圆形溃疡或向外穿孔呈喷火状溃疡。结节和溃疡附近淋巴结肿大，附近淋巴管粗硬呈念珠状索肿，肿胀周围呈水肿浸润，皮肤肥厚，有时呈蜂窝织炎，橡皮腿，公畜并发睾丸炎。5.4开放性鼻疽判定标准：5.4.1凡有5.2.1、5.2.2、5.2.3病变的，均为开放性鼻疽。5.4.2凡有第5.2.1病状而无5.2.2、5.2.3病状的或有5.2.1、5.2.3项病状而无5.2.2病状的，可用鼻疽菌素点眼，呈阳性反应的为开放性鼻疽。5.4.3凡有5.3症状的，即为开放性鼻疽。5.5不具备5.4项症状，并有可疑鼻疽临床症状的，判定为可疑开放性鼻疽。6鼻疽补体结合反应试验操作办法6.1采取被检血清6.1.1药品器材：6.1.1.1来苏尔、石炭酸、酒精、碘酒、纱布、脱脂棉。6.1.1.2灭菌试管、试管架、试管签、送血箱、煮沸消毒器、消毒盘、镊子、毛刷、毛剪、采血针（带胶管、每针采一次后必须清洗煮沸消毒后，再行使用）。6.1.2在被检牲畜颈前三分之一处静脉沟部位剪毛消毒，将灭菌采血针刺入颈静脉，使血液沿管壁流入试管内，防止血液滴入产生泡沫，引起溶血现象。6.1.3采出的血液，冬季应放置室内防止血清冻结，夏季应放置阴凉之处并迅速送往实验室。如在3昼夜内不能送到，应先将血清倒入另一灭菌试管内，按比例每1mL血清加入1～2滴5%石炭酸生理盐水溶液，以防腐败。运送时使试管保持直立状态，避免振动。6.2预备试验（溶血素、补体、抗原等效价测定）6.2.1准备下列材料6.2.1.1标准血清：鼻疽阴、阳性马血清。6.2.1.2鼻疽抗原。6.2.1.3溶血素。6.2.1.4补体：采取健康豚鼠血清。采血前饥饿7～8小时，于使用前一日晚由心脏采血，如检查材料甚多，需大量补体时，亦可由颈动脉放血，放于培养皿或试管中，待血液凝固后再轻轻划破或剥离血块后移于冰箱，次日清晨分离血清。如当日采血，可直接盛于离心管中，置恒温箱20分钟，将血块搅拌后，在离心器中分出血清亦可。每次补体应由3～4个以上豚鼠血清混合。6.2.1.5绵羊红细胞：绵羊颈静脉采血，脱纤防止血液凝固，并离心3次，以清洗红细胞；第一次1500～2000rp/m离心15分钟，吸出上清液加入细胞量3～4倍的生理盐水轻轻混合后做第二次离心，方法同前。使用前将洗涤后的细胞做成2.5%细胞液（即1：40倍溶液）。稀释后的红细胞最多保存一天，但离心后的红细胞在冰箱中可保存3～4日。6.2.1.6生理盐水：1000mL蒸馏水中加入8.5g氯化钠，灭菌后使用。6.2.2溶血素效价测定，每一月左右测价一次，按下列方法进行（参照表一）。6.2.2.1将稀释成1：100～1：5000不同倍数的溶血素血清各0.5mL分别置于试管中。6.2.2.2将1：20倍补体及1:40绵羊红细胞各0.5mL分别加入上述试管中。6.2.2.3另外制作缺少补体、缺少溶血素的对照管，并补充等量生理盐水。6.2.2.4每管分别添加生理盐水1mL，置于摄氏37～38℃6.2.2.5观察结果：能完全溶血的最少量溶血素，即为溶血素的效价，也称为1单位（对照管均不应溶血），当补体滴定和正式试验时，则应用2单位（或称为工作量）即减少1倍稀释。表一溶血素稀释1：1001：5001：10001：15001：20001：25001：30001：35001：40001：5000对照溶血素1：20补体2.5%红细胞生理盐水0.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.0-0.50.51.50.5-0.51.5--0.52.06.2.3补体效价测定每次进行补体结合反应试验，应于当日测定补体效价。先用生理盐水，将补体做1：20稀释，然后按表二进行操作。表二补