GBT 28630.3-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第3部分原位杂交检测法

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 本部分为GB/T28630的第3部分。GB/T28630.1—2012白斑综合征(WSD)诊断规程第1部分：核酸探针斑点杂交检测法GB/T28630.4—2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法见GB/T28630.4-2012的2.1。4.2核酸探针按GB/T28630.1—2012中6.2的规定。4.695%乙醇。4.8石蜡(熔点52℃~54℃):切片级。24.142×SSC:见附录A的规定。4.28阴性对照为未受wSSv感来且经原位杂交证明为阴性的对邮组织5.1石蜡切斯机满足4μm厚度的石蜡连续切片要求5.2水浴锅：温至100℃上下波动1c5.3显微镜，高36操作步骤6.1组织切片制备6.1.1样品采集的要求、固定方法和修整取材见GB/T28630.4—2012中附录B的规定。6.1.2样品按GB/T28630.4—2012中5.2～5.5的规定将样品在程控组织脱水机中进行脱水、透明、浸蜡，在石蜡包埋机上进行包埋，用石蜡切片机进行切片，切片厚度5μm。用毛笔将切片移入展片水浴锅内展片，用已预包被500μg/mL多聚赖氨酸的载玻片捞出，置于平板烘片机上65℃烘烤45min。6.2原位杂交6.2.1组织切片(包括阴性对照和阳性对照)在程控切片染色机中依次通过二甲苯(3次，5min/次)、无水乙醇(2次，1min/次)、95%乙醇(2次，10s/次)、80%乙醇(2次，10s/次)、50%乙醇(1次，10s/次),然后用蒸馏水冲洗6次(勿让切片于燥)。6.2.2.组织切片置于TNE中5min,而后平放在切片保湿孵育箱中，吸取500μL100pg/mL蛋白酶6.2.3把组织切片上的蛋白酶K溶液吸干，然后将其放入预冷到4℃的0.4%甲醛溶液中浸5min。6.2.4室温下，用2×SSC浸洗组织切片5min。6.2.5把组织切片平放在切片保湿孵育箱中，吸500pL杂交缓冲液于每张组织切片上，42℃孵育6.2.6按每毫升杂交缓冲液中加入1μL～4μL核酸探针的用量取核酸探针置于一只微量离心管中，在100℃沸水中将含核酸探针溶液的离心管煮沸10min,然后置于碎冰中淬冷。6.2.7将上述核酸探针与相应量(每张切片应500μL)的杂交缓冲液混合，吸取500μL混合液于每张组织切片上，置于90℃~95℃平板烘片机上保温6min～10min,使组织DNA变性。注意补充切片上过度蒸发的杂交缓冲液。6.2.8把组织切片放在平整的冰上淬冷5min。6.2.9在切片保湿孵育箱内42℃下孵育16h～18h。SSC(15min,42℃)、缓冲液I6.2.11用缓冲液Ⅱ封闭组织切片(500μL/片),37℃温浴30min。6.2.12用缓冲液Ⅱ将AP-抗DIG稀释至0.75U/mL(1pL0.75U/μLAP-抗DIG加到1mL缓冲液Ⅱ中),把组织切片平放在湿盒中，每片吸250μL已用缓冲液Ⅱ稀释的AP-抗DIG于组织切片上，37℃温浴30min。6.2.14吸500pL显影液于每张组织切片上，室温下黑暗中放置1h～3h。中间可取出短时间在显微镜下观察显色情况，当阳性对照有明显显色时可中止反应，如果阴性对照的组织细胞开始普遍出现非特异性显色，则应立即终止显色。6.2.15室温下把组织切片置于缓冲液IV中15min终止反应。6.2.16组织切片上滴加双蒸水(1次，10s/次)、0.5%俾斯麦棕Y(1次，1min/次)、95%乙醇(3次，6.2.17滴加2滴中性树胶封片。6.2.18在明视野显微镜下寻找蓝黑色到黑色的细胞内沉淀物并拍照。GB/T28630.3—2012缓冲液的切片在90℃~95℃平板烘片机上保温6min～10min过程中，因缓冲液蒸发而使组织干燥，试剂配方mL混匀6.45pm滤膜过℃贮20×ssc20×SSC6A.6缓冲液I10×缓冲液I水A.710×缓冲液Ⅲ六水氯化镁(MgCl₂·6H₂O)水水A.10BCIP贮存液用盐酸调pH至加水定容至高压蒸气灭菌后，4℃贮存。水蛋白酶K分装于无菌离心管中(0.25mL/管),-20℃下保存。10mg/m蛋白酶K用前临时配制，混匀4水倒掉前可重复使用4次，用前预冷。t牛血清白蛋白(组分5)聚蔗糖400(ficoll400)聚乙烯吡咯烷酮360(PVP360)加水溶解并定容至0.4 A.1725%硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖(dextran加水定容至低热搅拌片刻使之溶解，-20℃保存。8鲑精DNA水将鲑精DNA钠盐加入水中，用玻璃棒搅拌直至完全溶解。用6号针头的注射器反复抽打数次。在100℃水浴中加热10min,立即放于冰浴中淬冷，分装于无菌小试管中，-20℃保存。使用前在100℃水浴中加热5min,然后淬冷。A.19杂交缓冲液100%甲酰胺20×丹哈特氏液10mg/mL鲑精DNA25%硫酸葡聚糖混匀，4℃贮存。A.20缓冲液ⅡblockingreagentⅡ缓冲液I100mL在60℃~80℃水浴中溶解，不断晃动，直至颗粒溶解。4℃可贮存2周。A.2110×缓冲液N加水溶解，并定容至用盐酸调pH至8.0,高压灭菌。4℃贮存。A.22