实验二-食品中大肠菌群的检验

实验二食品中大肠菌群的检验

一、实验目的1.了解大肠菌群在食品检验中的意义。2.掌握检验的程序和步骤。3.通过MPN检索表的检索得出实验结果。二、基本原理大肠菌群系指一群在32～37℃下24hr内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。食品中大肠杆菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群最近似数（MPN）来表示，据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值，为报告标准。1、牛天贵主编《食品微生物学实验技术》实验十二大肠菌群检验2、GB4789.3-2010《大肠菌群计数》3、大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法4、美国FDA标准方法（行业标准采用两步法）：用于对出口食品中大肠菌群进行检验三、检测方法一、牛天贵主编《食品微生物学实验技术》实验十二大肠菌群检验初发酵分离培养复发酵（证实试验）实验操作步骤：乳糖发酵试验分离培养证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。

根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

实验所需培养基及作用乳糖胆盐发酵管（初发酵）伊红美蓝琼脂培养基（鉴别培养基分离培养）乳糖发酵管（复发酵）1、乳糖胆盐发酵管成分：蛋白胨20g、猪胆盐5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000mL，pH值7.4制法：略实验现象：如图2、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）成分：蛋白胨10g、乳糖10g、K2HPO42g、琼脂17g，2%伊红Y溶液20mL、0.65%美蓝溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH值7.1制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH值，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用；临用时加入乳糖（115℃20min）并加热融化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液），摇匀后倾注平板。现象及原理大肠杆菌：菌落深紫色，且有绿色金属光泽；产酸能力较弱的几种肠道菌：也有相应的棕色；不发酵乳糖的肠道菌：菌落是无色透明的，比如变形菌属，沙门氏菌属2、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）3、乳糖发酵管成分：蛋白胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000mL，pH值7.4制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH值，加入指示剂，分装3mL试管，并放入一个小倒管，115℃灭菌15min。实验操作步骤：1）检样稀释（无菌操作）①将25mL（或g）检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用8000－10000r/min的速度处理1min）制成1：10的均匀稀释液。②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成1：100的稀释液。③另取1mL灭菌吸管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管。2）乳糖发酵实验

接种1mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置（36土1)℃温箱内培养（24士2)h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。3）分离培养将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（36士1)℃恒温箱内培养18～24h。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。4）证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36士1)℃恒温箱内培养（24士2)h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。取产酸产气的发酵管中培养液在伊红美兰平板上进行划线取有核心和带金属光泽的深紫色菌落进行革兰氏染色乳糖蛋白胨培养液镜检（革兰氏阴性菌）37℃培养48h证实产气（阳性）结果与否37℃培养24h37℃培养24h

实验报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（或g）大肠菌群的MPN。结果表示方法：120MPN/100mL（g）附表：大肠菌群最大可能数（MPN）检索表注：①本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和0.01mL(g)。每稀释度3管。②表内所列检样量如改用10mL(g)，1mL(g）和0.1mL(g）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.1ML(g),0.01ML(g）和0.001mL(g）时，则表内数字应相应增加10倍，其余可类推。表10毫升、1毫升、0.1毫升检样各接种3管的大肠杆菌最近似数检索表

阳性管MPN阳性管MPN阳性管MPN10ml1ml0.1ml10ml1ml0.1ml10ml1ml0.1ml00131201123353002612115300230039122203013901031232430264011613016303950129131203104301312132243117502061332931212002192009313160022122011432093023162022032115003092032632221003113210153232900321621120330240033192122733146010042133433211001017220213331100+1021122128

1031522235

110722342

1111123029

1121523136

1131923244

50ml管阳性数10ml管阳性数1ml管阳性数每100ml的MPN000000110022010101120123020202130224030303150326100110131024103611031115112711391205121712210123121308表2-350毫升检样接种1管、10毫升、1毫升检样各接种3管的大肠杆菌最近似数检索表相关视频/special/show_2572599/NxNdU7DdVMbScZ8e.html二、GB4789.3-2010《大肠菌群计数》第一法：大肠菌群MPN计数法第二法：大肠菌群平板计数法第一法：大肠菌群MPN计数法

需要用到的培养基（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL5.0g，乳糖5.0g，K2HPO42.75g，KH2PO42.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水800mL，pH7.2±0.1。制法：略抑菌剂的选择大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。实验步骤及操作要点：1）无菌取样并制作梯度稀释液；2）样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。4）初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。LST结果判断大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。5）复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告按5）确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。表B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表第二法：大肠菌群平板计数法

需要用到的培养基（1）VRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g，氯化钠5.0g，胆盐或3号胆盐1.5g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g～18g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.11）样品的稀释：如第一法2）平板计数选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。3）及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。实验步骤及操作要点：4）平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU～150CFU

之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。5）证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。