基因工程实验教学教案

《基因工程》实验教学教案实验一实验室仪器使用及安全教育一、实验目的：学习实验室相关仪器的使用，了解本实验室药品特性及实验药品分区管理。二、实验内容：1、移液器的使用：一个完整的移液循环，包括吸头安装——容量设定——预洗吸头——吸液——放液——卸去吸头等六个步骤。每一步骤都有需要遵循的操作规范。（1）吸头安装：采用旋转安装法，将白色套筒顶端插入吸头，在轻轻用力下压的同时，把手中的移液器按逆时针方向旋转180度。（2）容量设定：选取适当量程的移液器（选0.1-10μL），调节分两步进行，一是粗调，通过排放按钮将容量值迅速调整至接近预想值，二是细调，将移液器横置，水平放置自己眼前，通过调节轮慢慢将容量值调至预想值。（3）预洗吸头：把需要转移的液体吸收排放至2、3次，让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度。（4）吸液：将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面，平稳松开按钮吸液。（5）放液：吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿后，再按至第二停点。（6）卸去吸头：卸掉的吸头不能和新吸头混放，以免交叉污染。2、离心机的使用：（1）离心机放在水平坚固的地板或平台上，力求使仪器处于水平位置。（2）打开电源开关，将预洗平衡好的样品对称放置于转头的样品架上，关闭机盖。（3）旋转定时按钮设定离心时间，缓慢旋转转速调节按钮，使仪器转速达到要求。（4）待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，再次关闭机盖结束离心。（5）离心完毕后，将转速调节旋钮调回零位，关闭电源开关。注意：对于超速冷冻离心机，应先设定离心温度、速度和时间，待机腔温度达到预定要求，再放入样品。取出样品后，待离心机机腔温度与室温相同时再关闭机盖。3、电泳仪的使用：电泳仪一般分为自由界面电泳和区带电泳两类。区带电泳需用各种类型的物质作为支持物，分子生物学实验中常用的是琼脂糖凝胶电泳。所谓电泳，是指带电粒子在电场中的运动，不同物质由于所带电荷及分子量的不同，因此在电场中运动速度不同，根据这一特征，应用电泳法便可以对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分提取制备。电泳仪正是基于上述原理设计制造的。使用方法：（1）按电源开关，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置，屏幕转成参数设置状态。（2）设置工作程序，用键盘输入新的工作程序。（3）设置各参数无误后，按“启动”，启动电泳仪输出程序，在显示屏状态栏中显示start，并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注意安全，之后逐渐加压至设置值，同时在状态栏中显示“run”，并不断闪烁两个高压符号，在状态下方，显示实验的工作时间。（4）电泳结束，仪器显示“end”，并连续蜂鸣提醒，此时可按一键止鸣。4、PCR仪的使用：（1）开机：打开开关，视窗上显示“selftest”，显示10秒后，run-enter菜单，准备执行程序。（2）放入样本管，盖紧盖子。（3）如要执行已经编好的程序，直接按“proceed”，用箭头键选择已储存的程序，按“proceed”，则屏幕显示：按“proceed”选择enable,则开始执行程序。（4）其它：用“pause”可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用“Stop”或“Cancel”可停止运行的程序。如何设置一个PCR体系：一般分为8步：（1）预变性：可用94～95℃，2～10min，一般用5min。（2）变性：一般用94℃，30s~2min，一般45s~1min。（3）退火：温度自定，30s~2min。（4）延伸：70～75℃，一般72℃，对于<2kb,<1min;>2kb,每增加1kb加1min。（5）循环数：一般25～35（6）最终延伸：72℃，5～15min。（7）保存：10℃，时间设为0。（8）END。实验二聚合酶链式反应（PCR）实验目的学习聚合酶链式反应（PCR）的原理与技术，了解聚合酶链式反应（PCR）的具体操作过程。二、实验原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性—退火—延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～三、仪器、材料与试剂1、仪器热循环仪（PCR仪）、2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱、台式离心机、移液器（覆盖1-1000μ消耗品：一次性手套、PCR管等2、试剂1、引物：设计原则见附注。2、酶：PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu。分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率低但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择3、dNTPs4、模板：模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。5、缓冲液（其中需要Mg2+)：缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构。四、实验操作1、标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液2.0μL

dNTPs（10mM）0.4μL引物1（10μm）1.0μL

引物2（10μm）1.0μL

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μL

Mg2+(25mM)1.2μLddH2OXμL总体积20μL将上述试剂在PCR管中仔细混匀，尽量避免产生气泡，置于离心机上迅速离心片刻。2、PCR反应条件：在PCR仪上设定以下程序：95℃变性5min194℃变性1min50℃退火30-60s30个循环72℃延伸2min72℃延伸10min将样品置于PCR仪上进行扩增3、反应完成后，取5-10μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。剩余样品置于-20℃【图例】实验三水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的纯度与分子一、实验目的：

学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、构型、含量和分子量大小。二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。带电荷的物质在电场中的定向运动称为电泳，核酸分子是两性解离分子，在pH8.0时，DNA分子带负电荷在电场中向正极移动。采用琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。

三、仪器、材料、试剂

1、仪器（1）电泳装置：电泳仪、水平电泳槽、梳子、制胶槽（2）紫外观察：凝胶成像系统（3）小型离心机2、材料琼脂糖（Agarose）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、溴酚蓝、蔗糖、DNAMarker、溴化乙锭（EB▲有剧毒）称量纸、容量瓶、瓷盘、一次性手套、取液器、三角瓶、量筒（100mL）、灭菌枪头（10uL）、胶带

3、试剂配制（1）50×TAE（pH8.0）（电泳缓冲液）1000ml242gTRIS57.1ml冰醋酸100ml

0.5mol/LEDTA加水至1000ml，贮存备用（2）凝胶上样缓冲液（6×Loadingbuffer）（指示剂）100ml

0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF40%（w/v）蔗糖水溶液（3）10mg/mlEB1.0g溴乙锭100ml三蒸水

四、实验步骤1、准备胶床将合适大小的胶床用医用胶带封严两端，或将胶床放置于制胶器中，卡紧。在胶槽一端放置好合适大小及厚度的梳子，放置于一平整的平面上，待用。2、制胶（0.8%琼脂糖凝胶）（1）称取0.16g琼脂糖置于三角瓶中，加入20ml1×TAE缓冲液。（2）微波炉加热，煮沸、振摇，反复加热、振摇2-3次，使琼脂糖充分融化（注意观察不要把凝胶煮干）。（3）待胶冷却至60℃左右时，将融化的琼脂糖凝胶小心地倒入制备好的胶床中（注意不要产生气泡），让凝胶自然冷却至完全凝固（约需要20-30分钟）。（4）小心向上方拔出梳子，避免前后左右摇晃，以防破坏胶面及加样孔去掉制胶槽两边的胶带，小心将胶和胶床放入电泳槽中，样品孔在阴极端。（5）向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，液面高于胶面约1-2mm。3、上样电泳（1）取2μl上样缓冲液（Loadingbuffer）于Parafilm上，加2μl电泳缓冲液与2μl样品DNA反复吹吸，混匀。（2）枪头垂直伸入液面下胶孔中，小心上样于孔中（注意不要捅破胶孔）。（3）打开电泳仪电源，调整电压、电流，开始电泳；电泳开始以正、负极铂金丝有气泡出现为准。（4）根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，取出凝胶。（5）凝胶取出后于含EB的溶液中染色20分钟（注：可在制胶步骤的第4步中倒胶前少量滴入一滴EB溶液，那么本步骤可省略）。

4、凝胶紫外观察：

染色后的凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。▲附注影响DNA片段琼脂糖电泳的几个因素：1、DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。2、琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶浓度（%）1.51.752.0可分辨的线性DNA片段大小（kb）5-600.8-100.4-60.2-40.2-30.1-33、DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。4、电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。考核与评分（一）实验预习(20分)1.能正确地了解实验目的、要求、实验原理/4分2.对仪器操作要领、使用注意事项熟悉/5分3.合理地拟定实验方案及步骤/5分4.记录表格正确/3分5.正确地回答考查题/3分（二）实验操作（40分）1.驾驭实验的能力，思路清晰，有条理/5分2.正确使用仪器及排除故障/4分3.恰当的时机进行测量/3分4.独立操作能力/8分5.用所学知识解决实验中出现的实际问题/4分6.观察现象的能力，尤其是异常现象的发现/3分7.创新意识：与教师积极探讨实验，能对实验提出新见解、改进建议/4分8.协作能力：能分工合作，在需要的时候能与同学进行相互讨论、密切配合/3分9.实验素养：尊重师长，遵守实验规则，按照实验仪器规定条件整理仪器/3分1