DB37T4204-2020水貂阿留申病诊断与净化技术

ICS FORMTEXT65.020.30FORMTEXTB41FORMTEXT     DBFORMTEXT37DBFORMTEXT37/T4204—2020FORMTEXT     FORMTEXT水貂阿留申病诊断与净化技术FORMTEXTAleutiandiseasediagnoseandcleaning-uptechnologyforminkfarm2020-11-10发布2020-12-10实施FORMTEXT山东省市场监督管理局   发布DB37/T4204—2020I前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、中华人民共和国北京海关检科院、齐鲁动物保健品有限公司、青岛农业大学、河北科技师范学院、威海市畜牧业发展中心、山东省农业科学院家禽研究所、山东省动物卫生技术中心。本标准主要起草人：王贵升、张鹤晓、马泽芳、史秋梅、张洪学、赵国清、黄兵、徐启杰、王蕾、李玉杰、刘长浩、徐鸿、李金波、马慧玲、蔺晓月、崔凯、陈静、李富金、王士荣。水貂阿留申病诊断与净化技术范围本标准规定了水貂阿留申病临床诊断技术、病毒抗体检测技术、荧光PCR检测、病兽淘汰技术、兽群饲养环境控制技术和无害化处理的技术要求。本标准适用于水貂阿留申病感染动物的筛选、感染控制与净化。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB7959粪便无害化卫生标准GB8978污水综合排放标准SN/T2847水貂阿留申病检疫技术规范DB37/T2381规模化水貂养殖场生物安全体系DB37/T2660规模化毛皮动物养殖场消毒技术临床诊断流行病学各个年龄、性别和品种的水貂对本病毒都有易感性。潜伏期为60天～90天，有的长达7个月～9个月，个别可达1年以上，病程1周左右，最快2天～3天可死亡。感染率高，高达80%，死亡率低。传染源主要为病貂和隐性感染貂。病毒的群间传播主要是来自感染貂的唾液、粪便和尿，及其污染的环境、饲料、饮水和用具。经消化道、呼吸道及交配传染，也可通过母貂胎盘直接传递给子代。蚊虫叮咬、注射器针头等传播途径亦应引起重视。有明显的季节性，秋冬季节的发病率与病死率明显地比其他季节高。本病为终生毒血症。雪貂、狐狸、貉也可感染发病。临床症状渐进性消瘦：病貂食欲时好时坏，貂体逐渐消瘦，严重病貂体重急剧下降。出血和贫血：口腔、齿龈、软腭、硬腭和舌根有大量出血点和出血斑，内脏器官尤其是消化道出血，排出煤焦油样粪便。贫血症状口腔黏膜、眼结膜和阴道黏膜及脚趾苍白渴欲增强。如侵害神经系统，表现抽搐、痉挛、共济失调、后躯麻痹等症状，2天～3天死亡。本病预后不良，对症治疗可缓解症状。常复发，最后衰竭死亡。病理变化尸体营养不良，消瘦、贫血，内脏出血。肾肿大2倍～3倍，橘黄色，黄白色斑点。表面凸凹不平，有斑点状出血，间有灰白色坏死灶，呈麻雀卵样；慢性病例肾略肿，呈灰黄色，包膜难于剥离，隆起部为土黄色颗粒、无光；凹陷部分为乳白色、圆形小点，皮质切面为乳白色小点。肝、脾、淋巴结肿胀，肝呈土黄色，或见有灰白色斑点、质脆；胸腺体积缩小。怀孕期发病可见死胎、胎儿液化、吸收或者出现木乃伊胎儿、子宫出血。瘫痪病例可见脑膜出血。抗体检测样品的采集与保存准备工作：将准备采血的水貂全部单笼放置，一一对应清晰编号。1.5 mL离心管或者1mL～2mL注射器、离心管架、剪刀或指甲剪、酒精棉、干脱脂棉、记号笔，有条件的使用采血板和毛细管。采血方法：将水貂保定，剪刀酒精棉消毒，中趾趾间毛细管采血或直接剪掉中趾趾尖挤出0.3 mL～0.5 mL血，滴入离心管或注射器，脱脂棉压迫止血，注明编号。样品保存及运输：2 ℃～8 ℃，不超过24 h。样品处理将装有血液的离心管静置，待血清析出，经4 000 r/min离心3 min～5 min，取血清置于1.5 mL离心管中。对流免疫检测按照SN/T2847的要求进行检测。荧光PCR检测仪器设备荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。小型台式低温高速离心机（离心速度13 000 r/min以上）。混匀器。冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种）。微量移液器（0.5 μL～10 μL；2 μL～20 μL；20 μL～200 μL；100 μL～1000 μL）及配套吸头。1.5 mL离心管（无核酸酶）。DNA核酸提取试剂试剂或材料阴性质控。阳性质控。蛋白酶K。SDS。或商品化实时荧光定量PCR试剂盒。样品的采集与保存拭子样品有咽喉拭子样品和肛拭子样品：咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。然后将拭子插入到装有1.0 mLPBS无菌离心管管中，编号备用；肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门来回刮3次～5次，取排泄物。然后将拭子插入到装有1.0 mLPBS无菌管中，编号备用。内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0 g于研钵中充分研磨，再加5.0 mLPBS混匀，然后将组织悬液转入无菌管中，编号备用。血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌管中，编号备用。存放采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存，不超过24 h。实验步骤样本病毒核酸DNA提取普通提取方法，或者采用经验证的病毒DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取。扩增试剂准备引物，根据衣壳蛋白VP2基因设计引物探针，扩增片段大小为168bp。引物序列参见附录A。根据需要配制荧光PCR反应液或购买商品化试剂盒。荧光PCR反应液，在室温下融化后，2 000 r/min离心5 sec。准备n个洁净、经无核酸酶处理的PCR反应管，设所需PCR管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照）。每个测试反应体系需要15 μLPCR反应液和0.5 μLTaq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15 μL，转移至样本处理区。加样在样品处理区进行。分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤5.4.1中制备的DNA溶液10 μL，盖紧管盖，500 r/min离心30 sec。荧光PCR反应在检测区进行。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录PCR管摆放顺序。反应参数设置：第一阶段，94 ℃/3 min；第二阶段，94 ℃/15 sec，60 ℃/60 sec共40个循环，最后40 ℃/2 min。荧光收集在第二阶段每次循环的60 ℃延伸时进行。结果判定结果分析条件的设定阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。选定FAM检测通道读取检测结果；ABI仪器，选择FAM作为报告荧光基团，无淬灭荧光基团。质控标准阴性对照无Ct/Cp值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct/Cp值应小于等于28，并出现典型的扩增曲线。如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。结果判定阴性：无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。阳性：Ct/Cp值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性。复验：Ct/Cp值大于30.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。实验室规范荧光PCR检测方法的实验室规范详见附录B。病兽淘汰检测方法的选择：抗体检测技术适用于群体检测，PCR检测技术适应小规模检测和抗体阳性样品的进一步确诊。不同实验室可以根据样品量、样品种类以及检测目的选择使用。分群：定期开展检测工作，检测出阳性样品后，结合临床症状，初步确定阳性水貂和阴性水貂，立即分群，并对阳性貂进行隔离。一次性净化：把检测出的阳性水貂直接淘汰，或作为皮兽饲养，不再留作种用。逐步净化：实行阿留申病毒阴阳性貂分场（群）饲养，逐步淘汰阳性貂。分（场）群后，应建立隔离饲养管理制度，避免水平传播。种貂，配种时阳性貂群独立统一配种，阴性貂群独立统一配种，切勿混合。兽群环境控制阿留申病阴性群：做好生物安全控制，日常管理遵照DB37/T2381的规定执行。阿留申病阳性群：在做好生物安全控制的同时做好环境消毒控制，遵照DB37/T2660的规定执行。无害化处理废弃物处理对污染的饲料、垫料等废弃物以及粪便、污水应按照GB7959和GB8978进行无害化处理。病死水貂处理病死水貂按照农业农村部《病死及病害动物无害化处理技术规范》的规定进行无害化处理。记录与档案应按照《畜禽标识和养殖档案管理办法》建立并保存养殖档案。主要包括水貂的品种、来源、数量、标识情况和进出场日期；检测、免疫、消毒情况；畜禽发病、死亡、淘汰和无害化处理情况等。养殖档案的保存时间不得少于2年。

（资料性附录）

引物和探针FCAACCCTCCAGGTCAACTCTRCTCTTAACAGGATTCCAGCATGTP FAM-AAGCTTGCCTCTCCAAGTAAAGTAACCA-BHQ1

（资料性附录）

水貂阿留申病毒荧光PCR检测方法的实验室规范实验室设置要求实验室设置要求如下：实验室分为三个相对独立的区域：样本制备区、反应混合物配置区和检测区；工作区域须有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用；每一区域须有专用的仪器设备整个实验过程中均须使用无RNA酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须250℃干烤4h以上，以彻底去除RNA酶；各区域的一起设备须有明确标记，以避免设备物品从各自的区域移出，造成不同的工作区域间设备物品发生混淆；进入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配置区至检测区；在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别；离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出；实验室清洁时应该样本制备区、扩增反应混合物配置区至检测区的顺序进行；不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。工作区域仪器设备配置样本制备区样本制备区需配置如下仪器设备：2 ℃～8 ℃冰箱；-20 ℃冰箱；高速台式冷冻离心机（4 ℃，12 000 r/min）；混匀器；微量加样器（0.1 μL～10 μL，5 μL～20 μL，20 μL～200 μL，200 μL～1 000 μL）；可移动紫外灯（近工作台面）。检测区检测区需配置如下仪器设备：荧光PCR仪（配计算机）；移动紫外灯；打印机。各工作区域功能及注意事项样本制备区样本制备区的功能及注意事项如下：样本的保存，核酸提取、贮存及其加入至扩增反应管在样本制备区进行；避免在本区域内不必要的走动。可在本区域内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区造成污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须立即盖严含反应混合物的反应管；用过的加样器吸头必须放入专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液）容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始样本、提取过程中样本与试剂的混合液等）如出现外溅，必须作清洁处理并作出记录；对实验台适当的紫外照射（254nm波长，与工作台面近距离）适合于灭活去污染。工作后通过移动紫外线灯管来确保实验台面的充分照射。反应混合物配置区反应混合物配置区功能及注意事项如下：试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行；用于标本制备的试剂应直接运送至反应混合物配置区，不能经过检测区，在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒；在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本