沉淀反应课件

沉淀反应（precipitationreaction)邓念华临床免疫学教研室沉淀反应6可溶性抗原+相应抗体→肉眼可见的沉淀一、定义：凝集反应沉淀反应抗原性质颗粒性抗原/可溶性抗原致敏颗粒可溶性抗原反应时间几分钟至十几分钟数小时至数天反应产物凝集块沉淀物稀释物稀释抗体稀释抗原沉淀反应6形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线(环)的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物

第一阶段第二阶段二、沉淀反应分两个阶段抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率。沉淀反应61897年Kraus就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血清混合出现沉淀1905年Bechhold把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年Oudin报告了试管免疫扩散技术1965年Mancini提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展1959年Schultze建立透射比浊法1967年Ritchie建立散射比浊法1977年Sternberg建立速率散射比浊法

发展趋势：快速、微量、自动化。三、发展史：沉淀反应6液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验凝胶免疫电泳技术沉淀反应可分三类免疫浊度测定絮状沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫固定电泳沉淀反应6

第一节液相内沉淀试验一、絮状沉淀试验:(flocculationtest)二、环状沉淀试验:(ringprecipitationtest)三、免疫浊度试验:(immunoturbidimetry)沉淀反应6

原理

一、絮状沉淀试验(flocculationtest)方法评价：

敏感度较低、简便、易受抗原抗体比例影响最适比临床意义：

测定抗原抗体反应的最适比。37℃抗原抗体康氏试验：梅毒抗体沉淀反应6康氏试验康氏试验是又称非特异类脂质抗原试验,可用于梅毒筛查。原理:使用酒精浸泡牛心粉，提取磷脂部分做为抗原，加入胆固醇以增加灵敏度，与待测血清中抗体(反应素)，在电解质作用下，抗原抗体形成可见的沉淀反应。请问目前常用的梅毒筛查有哪些方法?梅毒感染的确证实验有哪些?沉淀反应6抗原稀示意图释1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管。轻摇

絮状沉淀试验AgAbAg沉淀反应6抗体稀释度抗原稀释度1／101／201／401／801／1601／3201／640对照1／5+++++++++++++／--1／10+++++++++++++-1／20+++++++++++++-1／40-+／-+++++++++-1／80----+++-方阵滴定法沉淀反应6

原理

二、环状沉淀试验(ringprecipitationtest)方法评价：

敏感度较低、简便、快速、实用、只能定性不能定量、缺乏多对分辨力。临床意义：

鉴定血迹、诊断炭疽AbAg沉淀管内径1.5～2mm阳性：1～5min出现沉淀环阴性：30min不出现沉淀环沉淀反应6

三、免疫浊度试验1.透射比浊法（transmissionturbidimetry)2.免疫胶乳比浊法(immunolatexturbidimetry)3.散射比浊法（nephelometry)

①速率散射比浊法(ratenephelometry)

②终点散射比浊法(endpointnephelometry)返回沉淀反应6海德堡进行的沉淀分析

1、在抗体浓度过量时，随着抗原浓度不断上升免疫沉淀逐渐增多（如右图）原理：抗原抗原抗体复合物沉淀反应6检测器检测器透射测定散射比浊

2.抗原抗体复合物，在一定光线照射下，可产生散射光及透射光，并用仪器检测这些光的强度，可反应抗原抗体复合物的量。原理：沉淀反应6I0入射光

透射光I吸光度A=lgI0/I＝k1bC复合物Ag-Ab复合物1.原理：一）透射比浊法C复合物＝k2C抗原（Ab过量）吸光度A

＝k3C抗原足够大（35-100nm），要形成一定浊度沉淀反应6稀释待检样品和标准品（5ul)ApoB抗血清1m(过量)（1∶32～1∶64）孵育一定时间测定吸光度(A340nm)值A吸光度抗原浓度标准曲线2.技术要点（载脂蛋白B的检测）按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线沉淀反应64.方法评价：

操作简单、快速、易于自动化；敏感度比单扩高10倍，但比散射比浊低（数量多而大的抗原抗体复合物才适用本方法）；反应时间长(测定的是第二反应阶段)；抗体用量较大。3.影响因素：注意抗原的稀释；标本应避免混浊。沉淀反应6代表性仪器：全自动系列化分析仪：olympusAU560,日立7600全自动生化分析仪。特定蛋白分析仪检测前白蛋白、载脂蛋白A、B等。沉淀反应61.原理入射光I0透射光I吸光度A=lgI0/I＝k1bC复合物C复合物＝k2C抗原(抗体过量)二)免疫胶乳比浊法吸光度A

＝k3C抗原沉淀反应62.技术要点稀释待检样品和标准品加抗体致敏胶乳溶液

孵育一定时间测定吸光度(A340nm)值制备剂量-反应曲线A吸光度抗原浓度标准曲线沉淀反应63.方法评价：敏感度高（达ng/L）；稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备；

血清中的RF可与IgGFc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干扰。

沉淀反应6代表性仪器：普通分光光度计自动生化分析仪：olympusAU560沉淀反应6三)散射比浊法I0入射光

散射光Iα（5°—96°）I＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosα)］

Nγ2λ4散射光强度颗粒含量正相关颗粒大小正相关入射光波长负相关测量散射光的角度正相关沉淀反应6颗粒直径＜＜入射光波长颗粒直径＞或＝入射光波长散射角度尽可能大：提高灵敏度；排除大颗粒的干扰沉淀反应6第一阶段第二阶段速率散射比浊终点散射比浊沉淀反应6I0入射光

I＝K1C复合物散射光Iα（5°—96°）C复合物＝K2C抗原（Ab浓度恒定）I＝K3C抗原1.原理：抗原与过量抗体反应达到平衡时，形成复合物不再增加，并在形成絮状沉淀前，测定此时的溶液浊度。抗原抗体作用30-120min内比浊，形成较小复合物（一）终点散射比浊法沉淀反应62.技术要点稀释待检样品和标准品加最适工作浓度的抗体

孵育测定散射光强度I（450nm）绘标准曲线浊度抗原浓度标准曲线沉淀反应64secI2I2-I1抗原浓度I1>阀值7.5s-120sI1I1＜阀值稀释标本全量标本1/10标本量沉淀反应6定时散射比浊法测定原理示意图沉淀反应64.方法评价：可自动化；敏感度达ug/L水平，高于透射比浊法；但反应时间较长(第二阶段)。3.抗原过量检测：抗体过量：阈值限：。沉淀反应6代表性仪器：DadeBehing公司：

BN-100

BN-Prospec

BN-Ⅱ特定蛋白系统。沉淀反应6BNProSpec全自动特定蛋白分析仪沉淀反应6（二）速率散射比浊法1.原理：

是抗原抗体结合反应的动力学测定法；速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量；连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1～2min即可完成。沉淀反应6抗原抗体复合物形成的速率

累计时间（s）形成IC总量速率累计时间（s）形成IC总量速率5

8－10

13

515

25

1220

60

3525

150

9030

230

8035

300

7040

360

6045

415

5550

450

4555

480

3060

500

20沉淀反应6抗原抗体反应速率的动态变化沉淀反应6沉淀反应62.技术要点稀释待检样品和标准品加最适工作浓度的抗体孵育立即比浊（速率单位RU）绘标准曲线RU抗原浓度标准曲线沉淀反应6全量标本量适量标本稀释标本ARRAY360：自动进行1:6、1:36、1:216和1:1296等稀释度稀释，也可以根据需要临时设定稀释度。

沉淀反应63.方法评价：可自动化，快速；（在第一阶段检测、60s内完成测定）敏感度高，最小检出量达μg/L水平；重复性好（CV＜5%)；但抗体的质量要求高，仪器和试剂较贵。沉淀反应6代表性仪器：美国BECKMAN公司：全自动特定蛋白分析系统ARRAY360IMMAGE全自动特定蛋白分析仪

沉淀反应6IMMAGE全自动特定蛋白分析仪沉淀反应6

1.抗原抗体比例：抗体过量；抗原过量监测

2.抗体的质量：特异性高、亲和力好、效价高

3.增浊剂的使用：（提高反应速度）

PEG6000，tween-20

（一）免疫比浊分析的影响因素

四）、免疫比浊分析的影响因素和临床应用沉淀反应64.伪浊度:

标本（高血脂、反复冻融）抗体：效价低、特异性差

PEG浓度过高器材不清洁

5.入射光光源和波长：氦氖光源，633nm6.标准曲线制备与质量控制

沉淀反应6（二）临床应用免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ链、λ链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白：前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。

沉淀反应6原理：将可溶性抗原与相应分别放入凝胶（如琼脂、琼脂糖等）内进行扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度比例恰当的位置，形成肉眼可见的免疫沉淀线、沉淀环。第二节凝胶内沉淀试验分类：①单相琼脂扩散试验(singlegeldiffusiontest)

②双相琼脂扩散试验(doublegeldiffusiontest）③凝胶免疫电泳(gelimmuno-electrophoresis)沉淀反应6抗体+琼脂一、单相琼脂扩散试验(一)原理Ag沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。沉淀反应637℃24-48h(二)技术要点系列浓度标准品标本测量沉淀环直径抗体+1.5%琼脂56度绘制标准曲线沉淀反应6

T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线

t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Mancini曲线大分子抗原Fahey曲线小分子抗原沉淀反应6C(mg/ml)d2(mm)Mancini曲线扩散＞48h、大分子抗原d

(mm)Fahey曲线扩散＜24h、小分子抗原logC绘制标准曲线：沉淀反应6(三)影响因素1.抗原分子量

分子量大，扩散慢，沉淀环较小；分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。

2.抗体种类

实验证明马抗血清为1-10IU/ml，羊为0.4-4IU/ml，兔抗血清可测抗原0.1-1IU/ml，为提高实验敏感度，应选兔抗血清。沉淀反应63.抗体稀释度

抗体浓度易小，因相应沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，方法敏感度较高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。沉淀反应64.扩散时间与温度

扩散时间赿长，扩散温度在4-37℃范围内，升高温度，反应时间缩短。注意扩散要达到终点后，其沉淀环直径才与抗原含量呈一定关系。抗原含量越高，达到一定关系所用扩散时间越长。沉淀反应65.每次都要做标准曲线，并必须加测质控血清；6.双环现象（重链病）；7.单克隆抗体测正常人多态性抗原，则抗体相对过量，结果降低；8.多克隆抗体测定单克隆蛋白，则抗原相对过量，结果增加。沉淀反应6(四)方法评价一种简便、实用的定量方法；不需特殊仪器制备；灵敏度稍差为1.25mg/L；耗时长,影响因素多（操作规范时，重复性和线性尚可依赖），目前临床中少用。

沉淀反应6(一)原理：AbAg染色标本图1.抗原抗体双向自由扩散2.24小时出结果3.呈现沉淀线或弧

二、双向琼脂扩散试验(doublegeldiffusiontest)沉淀反应6(二)操作步骤制板1.5%琼脂、4ml／每片打孔孔径3mm，孔间距3~5mm加样孵育37℃、24-48h沉淀反应6

应用(三)双向琼脂扩散试验的应用抗原或抗体的有无及纯度；估算抗原及抗体的相对含量及相对分子量；分析抗原的性质；滴定抗体的效价。沉淀反应64.抗原抗体纯度鉴定

“1”

为单一抗原抗体系统。

“n”

为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。抗原抗体纯度鉴定*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。沉淀反应61.检测未知抗原或抗体AgAbABCDEF

A:浓度Ag、Ab及扩散率近似；B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab；C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab；D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似；E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab；F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab；估计相对含量及分子量沉淀反应62表示标准Ag1表示待检Ag待检Ag与标准抗原完全吻合；待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应；待检Ag有与Ab相对应的Ag，但与标准Ag不同；待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低；抗原性质分析沉淀反应61.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。3.可进行任意稀释。抗体效价滴定沉淀反应6三、免疫电泳技术

(immunoelectrophoresistechnique)电泳技术+免疫扩散技术特点：1.高特异性；2.高分辨率、快速、微量。沉淀反应6

电泳原理pH8～8.6

缓冲液中阴粒离子多等电点pH3～4分子量较小等电点pH5～6分子量较大阴粒离子少向正极电泳力小向正极电泳力大沉淀反应6影响因素1.电场强度：恒定电流2～4mA/cm,恒定电压2～10V/cm4.电渗作用：在电场中液体相对于固体的移动。2.溶液pH值：缓冲液偏碱性，蛋白质带负电荷3.离子强度：高，泳动慢；低，泳动快，缓冲能力↓0.05mol／L、pH8.6的巴比妥缓冲液沉淀反应6

电渗作用带负电的琼脂静电感应-+--------------------++++++++++++++AV0-----------V沉淀反应6一）、对流免疫电泳(counterimmunolelctrophresis,CIEP)(一)原理在pH8.6的琼脂凝胶中：

抗体球蛋白：带少量负电荷且分子较大，因此电泳力＜电渗力，泳向负极，放(+)；

抗原蛋白质：带较强负电荷且分子较小，因此电泳力＞电渗力，泳向正极，放(－)；电泳一定时间后，二者相向运动，形成肉眼可见的沉淀线。沉淀反应6

示意图I=3～4mA/cm、30min+1：Ag与Ab对应；2：Ab＞Ag，Ag为弱阳性3：Ag＞＞＞Ab，

Ag强阳性4：Ag＞＞Ab，Ag含量较高；（二）操作步骤-1.2%巴比妥琼脂凝胶沉淀反应6(三)方法评价

简便、快速；敏感度较双相琼脂扩散试验高8~10倍，但分辨力较其低；可测出ug/ml级的蛋白质；目前已不推荐使用。沉淀反应6三、火箭免疫电泳

（rocketimmunoelectrophoresis,RIE)单向免疫扩散+电泳技术原理＋－AbAg峰形高低与抗原量成正比沉淀反应61.制板：56度将抗体混于凝胶中2.打孔：3.加样4.电泳：抗原向正极泳动5.观察沉淀峰6.绘制标准曲线+6～8mm5mm二）操作步骤沉淀反应6沉淀峰高抗原浓度1.测定沉淀峰高度2.在标准曲线上查找相应抗原浓度标准曲线

标准曲线沉淀反应6注意事项2.琼脂应为无电渗或电渗很小1.电泳顶部云雾状或圆形，应继续电泳3.标本多时，应将琼脂板置于电泳槽上，搭桥并开启电源后加样，否则形成宽底。4.IgG在pH8.6的缓冲条件下净电荷为零，因此需经甲醛化处理

注意事项沉淀反应6（四）方法评价：

与双扩比较：敏感

较单扩散敏感10-16倍（达ug/ml以上）；

快速

仅需1h左右。但敏感度仍不高,方法繁琐,影响因素较多。用途

适用快速诊断检测。如乙型肝炎抗原的快速检测。沉淀反应6(一)原理观察沉淀弧根据沉淀弧的数量、位置和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。双相免疫扩散：区带电泳：电泳抗原抗体四、免疫电泳

(immunoelectrophoresis,IEP)沉淀反应6

(二)操作步骤莊榮輝(1985)博士論文.p.81+