饲料中猪源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 征求意见稿

1GB/T21101—202X饲料中猪源性成分的定性检测实时荧光PCR法本文件规定了猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。本文件适用于饲料（包括饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料）中猪（Susscrofa)）源性成分的实时荧光PCR定性检测。也适用于动物组织及加工品中猪（Susscrofa)）源性成分的实时荧光PCR定性检测。本文件相对检测下限为0.1%（W/W)，绝对检测下限为5拷贝DNA/PCR反应。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRreal-timePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程3.2Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）bp：碱基对（basepair）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）Tris：三羟甲基氨基甲烷（trihydroxymethylaminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）5原理2GB/T21101—202X根据猪β-actin基因的特异性序列设计引物和探针，采用实时荧光PCR技术进行扩增，根据扩增反应中产生的荧光信号和Ct值实现对猪源性成分的定性检测。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。6.1实时荧光PCR试剂（2×实时荧光PCR预混液)。6.2溶液配置用水：应符合GB/T6682二级水的要求。。6.3实时荧光PCR用超纯水：不含DNA酶和RNA酶。6.41mol/LTris-HCl溶液（pH8.0称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa、121°C条件下灭菌20min。6.50.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)：称取186.1gNa2EDTA·2H2O溶解于800mL水中，磁力搅拌器121°C条件下灭菌20min，室温保存。6.6TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mLTris-HCl溶液和2mLEDTA溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa、121°C条件下灭菌20min。6.7引物和探针：用TE缓冲液将每条引物或者探针分别配制成100μmol/L储存液备用，置-20℃以下冻存，避免多次冻融。序列见表1。表1引物探针序列5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’猪5′-CGTAGGTGCACAGTAGPorcine-97bp-R5′-[FAM]-CCAGGTCGGGGAGTC-[7仪器设备7.1密闭的样品粉碎仪或研磨机：碾磨细度达到60目，粉碎容器和刀具易于清洗。7.2离心机：离心速度≥14,000rpm。7.3紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪。7.4实时荧光PCR仪。7.5电子天平：感量：0.1g。7.6微量移液器：2、10、100、200、1000μL等各种规格。8样品按照GB/T20195规定制备试样，至少200g，使用样品粉碎仪或研磨机粉碎成粉状，混合均匀，装入密闭容器中，备用。在粉碎或碾磨一个样品后，要将粉碎仪或研磨机的容器和刀具清洗干净，防止污染下一个样品。3GB/T21101—202X9检测步骤9.1核酸提取按照GB/T19495.3的方法提取。提取出的核酸如需保存，须置于≤-20℃冰箱中。称取粉碎后的样品0.2~0.3g，按照GB/T19495.3附录C.6.2中CTAB-2方法或其他合适的方法提取核酸。每个样品设置两个提取重复，并且设置一个提取空白对照。也可采用经验证可靠的商业化DNA提取纯化方法或试剂盒进行核酸提取纯化，具体参照说明书使9.2DNA浓度和纯度的测定吸取DNA提取液1μL，以超纯水作为空白对照，使用分光光度计或微量核酸蛋白测定仪测定DNA模板的质量浓度。将提取的DNA溶液用于实时荧光PCR检测。将提取的DNA模板的质量浓度稀释到20ng/μL，用于实时荧光PCR检测。9.3实时荧光PCR9.3.1对照和样品检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照、空白对照。含有已知猪源成分的DNA样品或含目标片段的质粒作阳性对照，用已知不含有目标物种成分的样品（植物核酸样品）作阴性对照，用等体积的超纯水代替模板作为空白对照。由于核酸提取时，已经设置了两个重复，在进行实时荧光PCR检测时，对于每个DNA样品，不再设置重复，只进行单次实时荧光PCR检测。9.3.2反应体系按照表2配置50μL反应体系。表2实时荧光PCR实验反应体系—注：最终反应体系中试剂添加的种类和总体系体积可能会根据不同的实时荧光PCR试剂产生差异。进行不同体系配置时，需要参照不同试剂使用说明书，并且需要保证表2中所列引物、探9.3.3反应程序按照表3的程序在实时荧光PCR仪上进行实时荧光PCR扩增。表3实时荧光PCR反应程序4GB/T21101—202X1注：根据不同实时荧光PCR试剂的要求，可以对反应程序中循环（扩增）步骤进行相应等效修改。10质量控制10.1内参对照基因扩增的质量控制当进行真核生物内参对照基因18SrRNA基因检测时，符合下列条件，说明样品提出了DNA，适合进行目标动物成分的实时荧光PCR检测。a)提取空白对照：荧光通道无荧光信号检出，Ct值≥37.0b)实时荧光PCR空白对照：荧光通道无荧光信号检出，Ct值≥37.0。c)阴性对照：荧光通道无荧光信号检出，Ct值≤28.0。d)阳性对照：荧光通道有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤28.0。e)待测样品：荧光通道有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤33.0。10.2目标动物物种特异基因扩增的质量控制当进行目标动物物种特异基因的实时荧光PCR检测时，以下条件有一条不满足时，实验视为无效，需重新进行检测。a)提取空白对照：荧光通道无荧光信号检出。b)实时荧光PCR空白对照：荧光通道无荧光信号检出。c)阴性对照：荧光通道无荧光信号检出。d)阳性对照：荧光通道有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线。11结果判定和表述11.1结果判定在符合第10章的情况下，对样品的检测结果按以下进行判定：a)阳性结果的判定如果荧光通道有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，并且同一样品的两个实时荧光PCR检测结果一致，则判定被检样品为阳性。b)阴性结果的判定如果荧光通道无荧光信号检出，并且同一样品的两个实时荧光PCR检测结果一致，则判定为被检样品阴性。c)痕量样品结果的判定5GB/T21101—202X对于同一个样品的两个实时荧光PCR结果，一个为阳性，另一个为阴性时，应重新提取DNA（设置两个重复并对每个DNA样品，进行单次实时荧光PCR检测。如果两个实时荧光PCR复测结果均为阳性时，该样品判定为阳性；如果两个实时荧光PCR复测结果一个为阴性、另一个为阳性时，该样品判定为阴性；如果两个实时荧光PCR结果均为阴性结果时，该样品判定为检测限以下为阴性。11.2结果表述11.2.1结果为阳性的表述为“检出猪源性DNA成分”。11.2.2结果为阴性的表述为“未检出猪源性DNA成分”。12实验污染防治措施按照GB/T27403中附录D的规定执行。6GB/T21101—202X猪源性物种检测靶基因参考序列18SrRNA：5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCCCGACCCGGGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAATACAGGACTCTTTCGAGGCCCTGTAATTGGAATGAGTCCACTTTA