DB6521T 074-2024SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度技术规程

ICS65.020.01CCSB216521IDB6521/T074—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所提出。本文件由吐鲁番市农业农村局归口。本文件起草单位：新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所、新疆葡萄瓜果技术开发服务公司、新疆维吾尔自治区种业发展中心、新疆农业广播电视学校。本文件主要起草人：李超、杨英、陈伟、杨咪、孙玉萍、杨军、耿新丽、徐畅、赵文霞、李婧、程晓宇、张银欢。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所。对本文件的修改意见、建议，请反馈至新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所（鄯善县苗园路4号）、吐鲁番市市场监督管理局（吐鲁番市高昌区西环北路2712号）。新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所（鄯善县苗园路4号联系电话邮编：838200。吐鲁番市市场监督管理局（吐鲁番市高昌区西环北路2712号联系电话（传邮编：838000。1DB6521/T074—2024SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度技术规程本文件规定了甜瓜品种纯度SSR（simplesequencerepeat，SSR）分子标记鉴定的原理、仪器设备和PCR反应相关试剂、方法步骤和纯度计算的要求。本文件适用于甜瓜杂交种纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.1农作物种子检验规程总则GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1品种纯度purityofvariety指品种在特征方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检作物种子数的百分率表示。3.2简单重复序列simplesequencerepeat(SSR)由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.3聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)利用DNA在体外95℃高温变性成单链，低温（通常是55℃~60℃)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，温度再调至DNA聚合酶最适反应温度（72℃),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5´~3´)的方向合成互补链。3.4引物primer2DB6521/T074—2024人工合成的两段寡核酸序列。一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。4原理品种的不同本质上是由于其遗传物质DNA核苷酸序列不同所致。SSR广泛分布于甜瓜整个基因组中，根据微卫星序列两段互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列串联重复数目不同造成了品种间的多态性，通过PCR的方法扩增出不同长度的扩增产物，将扩增产物进行凝胶电泳，在电场作用下由于分子量大小不同而分离，再经硝酸银染色，可辨别SSR电泳图谱。SSR分子标记呈共显性，选用品种间具有多态性的SSR引物，杂交种F1代种子的DNA-PCR扩增产物谱带中应具有双亲谱带，以此鉴定甜瓜杂交种种子纯度。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制溶液配制方法见附录B。引物相关信息见附录C。8操作程序8.1样品准备取200粒种子，催芽。8.2DNA提取8.2.1总则DNA提取方法应保证提取的DNA质量符合PCR扩增的要求，DNA溶解液的紫外光吸光度OD260与OD280的比值应介于1.8～2.0之间。DNA提取可任选8.2.2与8.2.3中的一种方法。其中改良CTAB法提取量大，质量好，可长期保存；碱裂解法简单快速，但提取量小，质量一般，不宜保存。8.2.2改良CTAB法提取DNA：a)将样品置于2.0mL离心管，液氮冷冻后，迅速研磨成粉末；b)加入800μL2%的CTAB，混合均匀后，65ºC水浴30min，每10min轻轻上下摇晃5～10次；3DB6521/T074—2024d)8,000rpm离心10min，抽取上清液到一个新的离心管中；e)加入2/3体积的异丙醇，上下颠倒200次，混匀；f)12,000rpm离心10min，此时DNA成白色团装聚于管底，弃去上清；g)用75%乙醇洗涤2次，最后一次用移液枪吸干管底的多余酒精，然后放置在超净台中吹干水h)加入50μL含有RNase的ddH2O溶解DNA，放置在4ºC备用。8.2.3碱裂解法提取DNAa)将种子嫩芽取下，装入2mL离心管，同时放2颗小钢珠；；b)加100μLNaOH（0.1mol/L）溶液，用高通量组织研磨器打碎样品；c)然后将离心管置于沸水中1min，冷却后加入100μLTris缓冲液（100mmol/L，pH8.0），充分混匀备用。取1.5～3μL作为PCR反应模板DNA进行PCR扩增。注：嫩叶DNA提取用CTAB法；种芽DNA提取采用碱裂解法。8.3PCR扩增8.3.1反应体系PCR反应体系（共20μl）：6.4μLddH2O；10μLMixforPAGE；0.6μL上下游混合引物（10μmol/L）；3μL模板DNA。8.3.2反应程序94℃预变性5min；94℃变性30s，55～60℃退火15s，72℃延伸15s，36个循环；72℃延伸4min；4℃保存。8.4PCR产物检测SSR-PCR扩增产物采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。电泳分离的SSR-PCR扩增片段用银染法染色。8.4.1凝胶制备蘸取洗洁精用清水将玻璃板反复擦洗干净，再用去离子水冲洗后晾干；将前后两块玻璃板用铁夹固定好，将一定体积的8%非变性聚丙烯酰胺溶液中加入0.5%体积的10%过硫酸铵溶液和0.1%体积的TEMED，充分混匀后，立即灌胶至玻璃胶室，灌胶过程防止气泡产生。灌满胶后，及时将样品梳插入其中，待胶凝固后使用。8.4.2电泳待凝胶凝固后，将玻璃板用铁夹固定到电泳槽上，加入0.5×TBE电泳缓冲液，中间的液面应没过4DB6521/T074—2024内侧的导电丝，底部的液面应超过电泳槽的1/2（电泳缓冲液可反复使用多次，一般一周更换一次拔出样品梳。每一个加样孔点入2～5μLPCR扩增产物样品，连接电极，设置电压150V，电流500mA，一般电泳1h左右（指示剂到达胶板中下部即可）停止电泳，关闭电源。8.4.3染色取下玻璃板，轻轻撬开，将凝胶从玻璃板上剥离，浸入固定液中，置于摇床上摇动两次，每次6min；固定结束后，倒掉固定液，加入0.2%硝酸银染色液，置于摇床轻轻摇动，染色12min；倒去染色液后，先加入适量的硫代硫酸钠溶液（或去离子水）清洗30s，倒掉后再用适量去离子水漂洗30s后倒掉；在新配制的显影液中摇动至出现清晰的条带；可在胶片灯上直接记录或用相机拍照保存。注：固定液、染色液，去离子水和显影液的用量，可依据胶板数量进行调整，以没过胶面为准。8.5SSR扩增图谱的判读对甜瓜SSR图谱进行数据记录时，采用每对引物在不同品种中扩增的整体带型为单位进行数据记录。在进行甜瓜品种纯度鉴定时，可根据每个单株材料扩增出的整体带型，比对200个单株整体带型差异。由于SSR引物呈共显性，合适的SSR引物PCR扩增产物谱带具有双亲的条带。9甜瓜杂交种纯度计算以合适的SSR引物扩增送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的送检样品数占总检测样品数的百分率表示纯度，计算公式如下：（1）式中：C——品种纯度，单位为%；T——供检样品总数，单位为个；N——非本品种供检样品数，单位为个。10记录与档案应对整个试验过程进行详实记录，记录档案至少保存两年，做到可追溯。5DB6521/T074—2024（规范性附录）主要仪器设备及试剂A.1主要仪器设备A.1.1水浴锅A.1.2PCR仪A.1.3电泳仪A.1.4垂直电泳槽及配套的制胶附件A.1.5高速冷冻离心机A.1.6水平摇床A.1.7电子天平A.1.8制冰机A.1.9磁力搅拌器A.1.10冰箱A.1.11紫外分光光度计A.1.12高通量组织研磨仪A.1.13通风橱A.1.14微波炉A.1.15凝胶成像仪A.1.16pH计A.1.17移液枪A.1.18胶片观察灯A.2主要试剂A.2.1无水乙醇A.2.2三氯甲烷A.2.3氢氧化钠A.2.4丙烯酰胺A.2.5过硫酸铵（APS）A.2.6冰醋酸A.2.7硝酸银A.2.8琼脂糖A.2.9MixforPAGEA.2.10去离子水A.2.11ddH2OA.2.12硼酸A.2.13引物A.2.14十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）A.2.15异丙醇A.2.16甲叉丙烯酰胺6DB6521/T074—2024A.2.17硫代硫酸钠（Na2S2O3）A.2.18甲醛A.2.19四甲基二乙胺（TEMED）A.2.20DNAMarkerA.2.21异戊醇A.2.22氯化钠A.2.23Tris碱A.2.2440%Acr-BisA.2.25Tris-HCl7DB6521/T074—2024（规范性附录）溶液配制B.1DNA提取B.1.10.5mol/LEDTA溶液称取18.61gNa2EDTA•H2O，溶解于70mLddH2O中，定容至100mL，pH调至8.0，高温灭菌。B.1.21mol/LTris-HCl溶液称取12.1gTris碱溶解于80mlddH2O中，ddH2O定容至100mL，调节pH至8.0。B.1.3CTAB提取液称取4.0gCTAB、16.364gNaCl、量取20mL的1mol/LTris-HCl（pH=8.0）、8mL的0.5mol/LEDTA、70mL的ddH2O震荡摇匀，定容至200mL，高温高压灭菌30min，冷却后置于阴凉干燥处备用。B.1.40.1mol/LNaOH2gNaOH，加ddH2O定容至500mL。B.1.50.1mol/LTris缓冲液12.1gTris，加ddH2O定容至1000mL，调节pH至8.0。B.2PCR扩增B.2.1MixforPAGE成品（MixforPAGE）。B.2.2引物用ddH2O按照说明分别配制正向引物、反向引物使其终浓度均为20μmol/L的储存液，等体积混合成10μmol/L的工作液。B.3电泳B.3.150×TAE（500mL）8DB6521/T074—2024121gTris、Na2EDTA•H2O18.6g或0.5mol/LEDTA（50mL）、400mL去离子水、28.55mL冰乙酸，调pH=8.3，定容至500mL。B.3.210×TBE（1000mL）108gTris、55g硼酸、37.25mLEDTANa2，ddH2O定容至1000mL。B.3.340%Acr-Bis丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺按质量比19:1配制。B.3.4TEMED成品（四甲基二乙胺）。B.3.510%APS20g过硫酸铵加ddH2O定容至200mL（400μL分装20℃保存）。B.3.6聚丙烯酰胺凝胶每块胶的配制（总体积：40mL28mLddH2O、4mL10×TBE、8mL40%Acr-Bis、40μLTEMED、400μL10%APS。B.4染色B.4.1固定液50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸，加ddH2O至500mL。B.4.2染色液1gAgNO3，加ddH2O至500mL。B.4.3清洗液120μL10%Na2S2O3，加ddH2O至500mL。B.4.4显影液7.5gNaOH、1.5mL甲醛，加ddH2O至500mL。9DB6521/T074—2024（规范性附录）核心引物表C.1核心引物序号名称正向引物(5′-3′)反向引物(5′-3′)1SSR12083GAATTGGCCCATCCTTCATTGCCATTCCAAAAACTTTTCAAC2MU5554-1CCTTCATGATCCTCTACTAAACCCTCTTCCATGCTTTTCTCGCT3TJ10ACGAGGAAAACGCAAAATCATGAACGTGGACGACATTTTT4PM3