广东地区耶氏肺孢子菌的药物靶位基因多态性分析

广东地区耶氏肺孢子菌的药物靶位基因多态性分析摘要目的：了解广东地区耶氏肺孢子菌的药物靶位基因的基因多态性和耐药相关基因突变的情况。方法：从148例AIDS并肺炎患者的呼吸道标本中扩增出51个线粒体大亚基rRNA(mtLSUrRNA)基因片段，对51例阳性样本继续进行PCR扩增，以耶氏肺孢子菌药物靶位基因DHPS、DHFR、Cytochromeb为研究靶标，对扩增产物进行测序和序列分析，与Genebank已知的参考序列进行比对，分析基因多态性。结果：51例样本全部扩增出DHPS基因、DHFR基因和Cytochromeb基因，序列分析显示DHPS基因中3（6%）株为耐药相关突变株，48（94%）株野生株；DHFR基因中1株在188碱基位点有非同义突变，21株在312位点有同义突变，30株为野生株，未发现与药物耐药相关的突变株；Cytochromeb基因在5个位点有基因多态性，其中4个为同义突变，1个为非同义突变，未发现与药物耐药相关的突变。根据这5个位点的基因多态性分型可以分为6个基因型，其中2个基因型为首次检测到，51例样本中CYB1型25例、CYB2型13例、CYB5型2例、CYB8型4例，新检测到的CYB10型4例，CYB11型3例。结论：广东地区耶氏肺孢子菌药物靶位基因出现与耐药相关的基因突变还比较少见，一线药物复方新诺明（TMP-SMX）对PCP的治疗仍然非常有效，Cytochromeb基因的基因多态性明显，可作为多位点序列分型研究的靶位基因。前言:肺孢子菌肺炎（PneumocystisPneumonia，以下简称PCP）是免疫抑制宿主、尤其是艾滋病患者常见的机会性感染之一，患者容易出现严重呼吸衰竭，导致人类罹患这种肺炎的病原菌为耶氏肺肺孢子菌(Pneumocystisjiroveci,Pj)，磺胺类药如复方磺胺甲恶唑(TMP-SMZ)是一线治疗和预防PCP的药物，sulfamethoxazole作用的靶位是二氢蝶酸合成酶（DHPS）基因，trimethoprim作用的靶位是二氢叶酸还原酶（DHFR）基因；阿托伐昆是治疗和预防PCP的二线药物，细胞色素B（Cytochromeb）基因是阿托伐昆的作用靶位，国外已有较多研究表明使用以上药物进行预防或治疗PCP，可能导致药物靶位基因突变株的增加，从而可能使PCP的预防和治疗失败，而我国相关的研究还比较少，本研究拟对广东地区分离的耶氏肺孢子菌的这三个药物靶位基因进行基因多态性分析，为临床用药提供依据。对象与方法一、病人与标本本研究共收集了2009年11月至2014年9月广州市第八人民医院住院收治的148例艾滋病并肺炎的患者，艾滋病诊断符合中华医学会和卫生部联合颁布的《艾滋病诊疗指南》中的标准ADDINKyMedRef2008REF:REF{F925AC14-3759-4B4E-8A49-D486F8789B2F}[1]。患者在签署知情同意书后行支气管纤维镜检查，标本采集后立即送抵医院检验室，取2ml液化后的肺泡灌洗液（BALF），3430×g离心10min，取100ul沉淀物涂片六甲基四胺银（GMS）染色后由2位经验丰富的技术人员镜检，其余沉淀物一20℃保存用于PCR检测。二、临床资料的收集包括性别、年龄、CD4细胞计数、LDH、新发感染还是复发感染、药物预防或治疗情况以及转归等。三、肺泡灌洗液（BALF）样本DNA的提取采用QIAampDNAMiniKit试剂盒提取。将BALF用1000转/min离心10分钟，收集沉淀；然后按照试剂盒说明进行操作。最后EP管中收集的即为BALF内的基因组DNA。-20℃保存备用。四、目的基因的扩增1.mtLSUrRNA基因的扩增参考Genebank公布的耶氏肺孢子菌的线粒体基因组全序列（序列号JX855937）ADDINKyMedRef2008REF:REF{80DBBC3C-C5BF-487D-9E05-19A6FA8E5C31}[2],设计扩增mtLSUrRNA基因的引物为rns.f4和rns.r11（见表1）。PCR体积为50ul体系（本研究以下PCR反应体系与此相同）:含模板DNA1μl，2xLongAmpmastermix25μl，上游引物(5μmol)4μl，下游引物(5μmol)4μl，灭菌蒸馏水16μl。反应条件：预变性94℃30S，10个循环扩增：变性94℃30S,退火55℃60S每个循环降1.0℃,延伸65℃2.5min。32个循环扩增：变性94℃15S,退火45℃30S延伸65℃2.5min。延伸65°C,5min.。取PCR产物5μl在1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像仪照相，如果电泳条带在850bp的位置，则考虑下一步送测序。经测序证实含有肺孢子菌DNA片段的标本才继续检测以下三个药物靶位基因。2.DHPS基因的扩增参考文献和Genebank公布的耶氏肺孢子菌的DHPS(序列号AF139132)ADDINKyMedRef2008REF:REF{6B8D5353-7685-44E7-8044-845EE7497436}[3]，合成扩增DHPS基因的引物第一轮为PK160和PS876，第二轮为PK160和PS634（见表1）反应体系与1.3．1相同，反应条件（第一轮）：预变性94℃30S，10个循环扩增：变性94℃30S,退火55℃60S每个循环降1.0℃,延伸65℃2.5min。32个循环扩增：变性94℃15S,退火45℃30S延伸65℃2.5min。延伸65°C,5min。第二轮：预变性94℃30S，35个循环扩增：变性94℃15S,退火50℃30S延伸65℃2min。延伸65°C,5min。3DHFR基因的扩增参考文献和Genebank公布的耶氏肺孢子菌的DHFR(序列号AF090368）ADDINKyMedRef2008REF:REF{42120D43-C1F2-4CB8-956F-76EC854F64C8}[3]，合成扩增DHPS基因的引物FR208和FR1038（见表2），反应体系与1.3．1相同。反应条件：预变性94℃30S，10个循环扩增：变性94℃30S,退火55℃60S每个循环降1.0℃,延伸65℃2.5min。2个循环扩增：变性94℃15S,退火45℃30S延伸65℃2.5min。延伸65°C,5min。4CYB基因的扩增参考文献和Genebank公布的耶氏肺孢子菌的CYB(序列号AF074871）ADDINKyMedRef2008REF:REF{318190D6-EF81-4C8E-956B-9642B38E07CA}[4]，设计扩增CYB基因的引物cob.f5和Mit.r21（见表2）。反应体系与1.3．1相同，反应条件：预变性94℃30S，10个循环扩增：变性94℃30S,退火55℃60S每个循环降1.0℃,延伸65℃2.5min。32个循环扩增：变性94℃15S,退火45℃30S延伸65℃2.5min。延伸65°C,5min。每次PCR反应均设阴性对照(以灭菌蒸馏水为模板)，监测污染；阳性对照(以PCR产物测序证实含有肺孢子菌相应基因的DNA为模板)，监测反应体系和条件。表1本研究各扩增各目的基因反应所用引物序列Table1.Nucleotidesequencesofprimersusedinthisstudy引物序列Sequence(5’-3’)扩增目的基因rnl.f7CCTGTGTCGGTTTTAGTACGGLSUrnl.r11CTTTTGCATAATGGGTCAGCLSUPK160GTTAATCCTGGTATTAAACCAGTTTTGCCDHPSPS876ATAAATTGCAAAATTACAATCAACCAAADHPSPS634GCAACCAAGGCAAACCATTAAADHPSFR208GCAGAAAGTAGGTACATTATTACGADHFRFR1038AACCAGTTACCTAATCAAACTATATTDHFRcob.f5CCCAAAGAACTACAACTTCACYBmit.r21GCATTCGTTTTACACGCGATCYBcob.f4CAATAATACCCACCAGAGGACYB五、目的基因的鉴定和测序1．目的基因的鉴定PCR扩增产物长度分别为850bp（mtLSUrRNA)、916bp（DHPS）、663bp（DHFR）、1038bp（CYB）。所有PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像仪照相。PCR产物送Invitrogen公司（广州实验室）进行基因测序，将获得的DNA序列在Genbank网站（/genbank）中BLAST证实测序结果是否有相应的目的基因存在。2.目的基因序列编辑、比对和分型对各个目的基因的序列进行编辑，然后参考各目的基因已知序列对本研究所获得的耶氏肺孢子菌株进行分型，使用序列分析软件（sequencher5.3软件）比对已有序列，确定相同和不同序列，将不同序列分别用BLAST进行同源性比较，调取与GenBaak中相同序列，用于分型。倘若以上研究获得的基因片段序列在Genebank未能比对出相同序列，且差异出现在评分位点，并且至少来自两个不同样本，经再次PCR扩增和测序证实可重复，则此序列被认为是新基因型；序列差异出现在评分位点之外，并且至少来自两个以上不同样本，经再次PCR扩增和测序证实可重复，此序列也被认为是新基因型。六、统计学方法所有数据采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，计数资料的比较采用卡方检验，组间均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果一、HIV并PCP患者和非PCP患者一般情况比较Table1ComparisonsofHIV-infectedpatientswithandthosewithoutPCP临床信息PCR阳性(n=51)PCR阴性(n=97)T值或卡方值P值年龄（均数±标准差）45±1142±101.40.15性别男（%）44（86%）85（87%）0.060.82CD4细胞计数（均数±标准差）(cells/_l)28±35108±155-4.8740CD4细胞计数<100cells/ml，例数（%）49（96%）66（68%）15.170初诊HIV感染例数（%)48（94%）83(86%)2.400.12PCP预防用药例数（%）3（6%）6（6.2%）0.050.94入ICU例数（%）3（5.9%）8(8.2)0.270.60存活例数（%）49（96.1%）90(92.7%)0.630.43二、DHPS和DHFR基因多态性表251例HIV并PCP患者的肺孢子菌DHPS和DHFR基因的基因多态性Table2Thepolymorphismsof

P.jiroveciiDHPSandDHFRgenein51HIV-infectedpatientswithP.jiroveciipneumonia例数DHPS碱基位置aDHFR碱基位点a16316918831228bACAT8ACAC11ACAT/Cc1ACA/GcC2A/GcC/TcAT1AC/TcAT/Cc说明aDHPS基因和DHFR基因的参考序列(基因库收录号码AF139132和AF090368).bDHPS基因andDHFR基因的野生株检出例数c通过克隆证实突变株和野生株并存的情况，每个样本至少检测出3个相同克隆方可确认。三、CYB基因多态性以CYB为目的基因成功扩增出51个PJ阳性样本，通过与基因库的PJ参考序列（AY628435）进行比对，发现有6个基因型，其中CYB1型25例、CYB2型13例、CYB5型2例、CYB8型4例，另有2个基因型为本次研究首次发现，我们分别将之命名为CYB10、CYB11型，其中CYB10型4例，CYB11型3例。CYB基因多态性见见表3.表3Cytochromeb基因多态性Table3Thepolymorphismsof

P.jiroveciiCytochromebgenein51HIV-infectedpatientswithP.jiroveciipneumonia例数基因分型Cytochromeb基因碱基位点a255b279b513b516b838c25CYB1CCACC13CYB2CCACT2CYB5CTATC4CYB8CTACC4CYB10dATACC3CYB11dCCGCC说明a.DHPS基因和DHFR基因的参考序列(GenBankaccessionno.AF074871)b.同义突变位点c.非同义突变位点d.本研究首次发现的基因型讨论本研究应用PCR法从148例HIV合并肺炎患者的呼吸道标本中检测到了51例肺孢子菌的核酸，并通过基因测序证实，提示PCP仍然是我国HIV感染者主要的机会性感染之一，尤其是在CD4细胞低于100的病人中更为常见。目前复方磺胺甲恶唑（TMP-SMX）仍然是临床上预防和治疗PCP的一线药物，国外已经有较多的关于该类药物靶位基因特殊位点突变的研究，尤其是在DHPS基因方面的研究非常深入，美国学者SteinCR等对2004年1月以前的关于磺胺药物使用与肺孢子菌DHPS基因突变的相关性研究进行了Meta-分析，得出结论在磺胺类药物的选择性压力下，肺孢子菌的DHPS基因会出现突变ADDINKyMedRef2008REF:REF{727DF905-7A14-4C06-B9D2-55253C3A1A4E}[5];多数的研究也发现肺孢子菌DHPS基因突变的位点主要发生在第163位核昔酸的G替代A,或第169位核昔酸的T替代C,相应的第55位氨基酸的苏氨酸变为丙氨酸(Thr/Ala)(1型突变M1),57位的脯氨酸变为丝氨酸(Pro/Ser)(2型突变M2),有的为双突变(M3)。根据这些不同，确定了4个不同的DHPS基因型，野生型序列是Thr55/Pro57,DHPS双突变Ala55/Ser57可能会影响底物结合，可能与抗药性有关ADDINKyMedRef2008REF:REF{DC8CBC62-B53E-4095-972A-DA0BB689DED2}[3,6]。本课题组曾对2009年至2013年的病例进行研究，从25例标本中检测到3例DHPS基因突变株ADDINKyMedRef2008REF:REF{87CBF4AC-44A5-4936-BCA6-3A454C26FB94}[7]，本研究再次扩大了样本量，增加检测了2013至2015年的样本26例，未发现有DHPS突变株，突变株的检出率明显低于美国、欧洲等发达国家，与我国之前北京患者的发生率相似ADDINKyMedRef2008REF:REF{3F37CE96-3223-49BC-B58B-0566AF6B18F5}[8]，与印度、巴西、泰国等发展中国家DHPS突变率的比例也相近ADDINKyMedRef2008REF:REF{99C9F4C7-2930-4794-A2F6-8D96E30FC56F}[9-11]，结合患者临床资料分析：本研究入选的患者多数为初诊的HIV感染者，既往未曾有磺胺类药物的暴露史；本研究的样本数偏少以及入选的重症病例偏少也有可能影响到真实的情况，还有待进一步扩大样本的研究，本研究检出的3例DHPS突变株，通过克隆后再测序发现3例样本均为野生株和突变株混合存在，结合文献分析原因可能为突变株可以在药物选择性压力下出现，也有可能通过人际间传播获得。关于肺孢子菌的DHFR基因的多态性，国外较多学者也早有研究，MaL等的研究和Takahashi等的研究发现TMP-SMX的预防性用药极少导致DHFR基因的耐药相关的突变，最常见的是在312位点的同义突变ADDINKyMedRef2008REF:REF{A3561CA8-B70E-42E6-952C-A9C3C2F86B0A}[3,12]，NahimanaA等人的研究发现，在使用乙胺嘧啶预防的人群中，DHFR基因的突变明显增加，而且可导致预防失败，他们发现其中5个碱基位点的非同义突变可能与乙胺嘧啶预防失败相关，这5个位点分别为第77、194、235、472、500碱基位点ADDINKyMedRef2008REF:REF{1693284B-1ECB-493A-94F5-E5F1567088F4}[13]，我们的研究发现1例DHFR基因在188位点有非同义突变，该位点的突变是否与耐药相关未见有研究报道，有21（41.2%）例在312位点的同位突变，这点与泰国的研究相符ADDINKyMedRef2008REF:REF{0BC64348-47FD-4986-AED6-CC41618489E7}[14]。关于DHFR基因，国内尚未见有其他课题组有报道。本课题组也在之前的25例标本中进行了检测，未发现有耐药相关的突变，此次扩大样本检测仍然未发现有耐药相关的突变基因。Cytochromeb基因是PCP的二线治疗药物阿托伐昆的靶位基因，已有研究发现在阿托伐昆选择性压力下PJ的Cytochromeb基因会发生突变，已经发现的碱基突变位点有7个，分别为第299、359、362、369、374、716、742碱基位点，这几个位点的突变与阿