国境口岸鸟分枝杆菌PCR检测方法

国境口岸鸟分枝杆菌PCR检测方法本标准规定了国境口岸痰样本中鸟分枝杆菌的PCR检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员感染鸟分枝杆菌的检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1193基因检验实验室技术要求人间传染的病原微生物名录(卫生部)下列术语和定义适用于本文件包括鸟分枝杆菌亚种(M.miumswubo)、副结核亚种(M.penatutherculsisuhop)、Msilvatirumsauho3个亚种。鸟分枝杆菌为抗酸杆菌，菌体大小0.6μmx(137℃,罗氏培养基上培育7d或更长的时间，通常产生光滑无色素的菌落，老菌落可能变为黄色。鸟分枝杆菌病Mycoberium.um由鸟分枝杆菌复合群感染引定的疾，感染后可侵害多种组织器官包括肺、骨髓、淋巴结等润。鸟分枝杆菌引起的肺部病变是最常见的非结核分支杆菌肺病，其临床表现、影像特点和病理变化类似肺结核，不做菌种鉴定，两者容易混淆——鸟分枝杆菌相关的大量活菌培养和动物感染实验操作应在生物安全二级(BSL-2或ABSL-2) 分枝杆菌相关的未经培养的感染性材料的操作在生物安全二级(BSL2)实验室内进行： 鸟分枝枉菌相关的灭活材料的操作在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行： 名分枝枉菌的细菌培养物运输包装分类为B类，UN编号为3373—验过程中的废奔物，收集后进行高压蒸汽灭菌，作为医疗废弃物处理或其他等效的处理方法。5仪器和设备5.2PCR检测仪。5.4水平凝胶电泳仪。5.5凝胶成像仪。5.6正置光学显微镜。5.7超纯水器或双蒸水器。5.8高压灭菌锅。5.9台式高速冷冻离心机(RCF3500g以上)6试剂和耗材6.1罗氏培养基。6.2Middlehronk7H9培养基。6.7pH6.8磷酸缓冲液(PBS)6.8PCR通用试剂。6.9无菌去离子水。6.11电泳缓冲液储存液(5×TBE):称取54gThis,3.72gNa₂EDTAH₂O和275g硼酸，溶于800mL的dH₂0中，充分搅拌溶解后加水定容至1L,pH8.0,室温保存。10倍稀释后使用。7痰样本的采集、运输、保存和处理7.1痰样本的采集、运输、保存露天开放通风环境或负压环境内，在专业人员指导下，受检测人员早晨空腹采集肺深部的痰液5mL,置于50mL无菌离心管中，1h内送达实验室进行检测。如果不能及时送达，可以4℃-8℃保存，24h内应送达实验室检测。痰液中需要看到干酪样的瘀块。痰样本放置于样本运输箱内，运输至实验室。7.2痰样本的液化除菌处理痰样本的处理需要在生物安全柜内完成。确认频样本的数量为5mL,并且其中有不少于3个干酪样痰块后，加入2倍体积的4%NaOH和2.9%拘橼酸钠的混合溶液(使用时按照0.25g50mL含量加人NALC),缓慢混匀20min后，加入pH6.8的PBS至50mL,充分混匀后，4℃水平离心15min,检测过程中分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为鸟分枝杆菌标准菌株(ATCC25291):阴性对照用无菌水或非鸟分枝杆菌的细菌核酸作为PCR反应的模板。8.3.4PCR反应体系组成95℃预变性3min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环；72℃廷伸5min;4℃保温。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。用0.5×TBE电泳缓冲液制备1.8%的琼脂糖凝胶平板(含溴化乙锭或其他等效染料)。取PCR扩增产物10μL和上样缓冲液1μL混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。按100V的电压条件电泳约1h。采用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果显微镜检查找到染色呈红色的杆菌时，判断为“找到抗酸杆菌”。显微镜检查未找到染色呈红色8.4.2PCR结果判断当阳性对照出现为91bp核酸条带，而空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判断及报告，否则视为实验失败，需重新实验本标准检验结果判断如下：——检测样本出现为91hop核酸条带，判断为“检出鸟分枝杆菌基因”;——检测样本没有任句核酸条带出现，判断为“未检出鸟分枝杆菌基因”。8.5结果报告本标准检测报告如下：——检测细菌培养样本中