饲料中恩拉霉素的测定 液相色谱-串联质谱法 编制说明

1《饲料中恩拉霉素的测定液相色谱-串联质谱法》编制说明（公开意见征求稿）（一）工作简况2023年国家标准化管理委员会发布通知（国标委发），检测所、通威股份有限公司和河南省农畜水产品检验技术研饲料监察所）共同承担。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）恩拉霉素，又名恩来霉素、恩霉素、安来霉构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。根据其为恩拉霉素A(C107H138Cl2N26O31)和恩拉霉素于甲醇、含水乙醇，难溶于乙醇和丙酮，不溶于醋酸、氯素标准品对恩拉霉素A和恩拉霉素B的含量占比在商品说明恩拉霉素在饲料中具有很高的稳定性，在室恩拉霉素对革兰氏阳性菌有很强的活性，特别是力很强。长期使用后不容易产生抗药性，因它改变了肠猪、鸡对饲料中营养成分的利用率，促进猪、鸡增重。4部公告第168号曾批准恩拉霉素预混剂可在饲料中长号，该文件规定自2020年1月1日起，退出除剂品种，其中包括恩拉霉素预混剂，并规定自2020年7月1168号和第220号废止。2019年12量标准，注销相关兽药产品批准文号和进口兽药注册证书微生物学法》为微生物学法，采用大孔吸附树脂进行净素产生抑菌圈的大小来测定饲料中恩拉霉素含量。方法项目组接到标准修订任务后，成立了工作组负责本标准的起草工作。对该标在2020年8月至9月期间通过大量查阅国内外有关文献，熟练掌握了恩拉霉素的化学结构、理化特性等，并制定实施方案。2020年10月至2020年12月，针对饲料中恩拉霉素的检测方法、仪器条件、方法线性、灵敏度和精确度等进行探索，并在实验室进行了多次实验，建立了恩拉霉素在不同饲料基质中的前处理方法，经验证发现本方法能很好满足饲料中恩拉霉素的检测要求，2021年1月到6月批量2021年7月至2022年4月分别委托农业农村部农产品质量安全监督检验测试中心（宁波）、北京英太格瑞检测技术有限公司、上海市兽药饲料检测所三家单位进行了复核试验，不同实验室间两种药物的平均回收率均在60%～120%范围内，量与标准检测技术研究所、中国农业大学等25家涉及国内科研、教学和管理等领域的有关单位的教授、专家和技术人员征求意见。发函单位共计25个，回函单位20个，未回函单位5个；提出意见单位20采纳93条，部分采纳或不采纳27条。然后对意见进行汇总处理，进一步对标准文2024年4月29日，上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测审查。专家组由李云、李俊玲、樊霞、李宏、吴银良、周炜、王金荣七位专家组成。在听取起草专家汇报的基础上?专家组审查了1.建议将方法检出限和定量限统一为0.05m2.建议进一步完善2种标准系列溶液的制备方法及基质匹配标准系列溶液的采纳。已在标准文件中细化标准系列溶液及基质匹配标准系列溶液的制备过采纳。已补充相关数据。采用1mg/ml标准储备液按照净化步骤处理，最后将进样浓度稀释至100ng/mL，同时与标准储备液直接稀释至100ng/mL，通过峰面积比较两者之间的偏差范围在1.5%~3.48%，未发现固相萃取柱存在明显过载效应，重复12341234720240619r1F2 7.88e6100790.5>1089(enramycinB 7.88e62.004.0020240619r1F2100790.5>95(enramycinB)%%5.142.64e6%%2.004.0020240619r1F1100785.7>1089(enramycinA) 2.004.0020240619r1F15.124.15e6100785.7>95(enramycinA5.124.15e60Time2.004.0020240619std100ngmlF2100790.5>10 20240619std100ngmlF2100790.5>95(enramy%%%%20240619std100ngmlF1100785.7>1089(enram 20240619std100ngmlF1100785.7>95(enramy0Time100785.7>95(enramy0Time（二）标准编制原则、主要内容及其确定依据用标准溶液在全扫描方式下，优化毛细管电压、锥孔电压、源度、脱溶剂气流速8>1089.0、785.8＞95.1和785.8＞122.1，其中离子对785.8＞1089.0虽然响应不是94.88100-/785.17%% 179.06770.81687.41687.41/.w-.…M---·94.88100-/790.62% 108.93%/776.27 193.06688.20/393.24673.73I/393.24673.73I9（m/z）分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、恩拉霉素的响应影响，结果表明水相中加入易收到杂质干扰，最终选择甲醇-0.1%甲酸水作为流动相。不同流动相下恩拉霉素15:55:47Enramycin0407-014.654.65%%aa1.002.00Enramycin0407-01100 %4.60%1.002.0016:52:08Enramycin0407-05100 %c%1.002.00Enramycin0407-051001.82 %%1.002.0016:28:49Enramycin0407-04 1002.24 2.192.36% 2.132.702.792.48% 2.132.702.79 3.203.554.161.002.00Enramycin0407-042.122.12 2.24%% 2.873.043.573.835.561.002.0017:22:16Enramycin0407-08%d%1.002.00Enramycin0407-082.872.87%%1.002.00：：0552.1.3.1配合料、浓缩料和精料补充考察了2%甲酸甲醇、1%三氟乙酸甲醇、0.1mol/L恩拉霉素A和恩拉霉素B标准品于试料中，加入20mL提对恩拉霉素的净化条件进行考察，参考相关文献，结水甲酸乙酸乙酯水醇ENV柱为反相固相萃取柱，需控制过柱液有机相比例。我们对配合料的提取溶液进行进一步优化。考虑恩拉霉素易溶于稀盐酸，并且甲醇-0.1mol甲醇-0.1mol/L盐酸溶液（55对提取方法进行考察，比较了只超声和超声后涡旋振采用RetainPEP柱作为净化柱，提取液宜5min。准确移取1mL上清液，加入0.1mol/L盐酸溶液10mL，涡旋混匀，作为备用酯淋洗，抽干2min。加6mL0.1mol/L盐酸甲醇溶液洗脱，抽干2.1.4.2预混合饲料、混合平行做两份试验。称取试样2g（精确至0.01g），于50mL离心管中，加入2%移取适量备用液通过RetainPEP固相萃取峰信噪比（S/N）都在3:1以上；③试样色谱峰保留时间应与标准溶液的一致，容许偏差为±2.5%;④检测到的离子丰度比应与标准溶液的一致，容许偏差达到欧基质效应值介于0.85和1.15之间表明无明显基质效应，大于1.15是基质增强，小于应B20ZJ08122，纯度为95%，恩拉霉素B货号为B20ZJ08121，纯度为8分别准确称取恩拉霉素A和恩拉霉素B对照品各10mg（精确至0.01mg）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。准确吸取恩拉霉素A和恩拉霉素B标准储备液各1详见图15和图16。采用高效液相色谱-紫外检测法考察标准溶液稳定性，经考察，恩拉霉素A标准储备液稳定性偏差为2.8取空白样品，按提取净化步骤处理得到空白基质溶液，精密量取适量混合标供液相色谱-串联质谱仪测定。以定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标从表中可以看出在不同饲料基质中，恩拉霉素A和恩拉霉素B在2ng/mL~200Y=906.88X+18.9363Y=654.45X+2.1954Y=566.571X+12.5171Y=412.441X+29.7995Y=849.706X+23.7266Y=563.234X+0.08494Y=472.029X-99.0224Y=778.77X+123.938Y=485.327X+123.673Y=915.646X+55.331料Y=612.729X-17.0736Y=195.543X+9.37413Y=83.3961X+43.3276Y=317.427X+671.767料Y=187.373X+626.195Y=252.195X+95.6556Y=1026.61X+23.8751Y=880.481X+9.78548空白试样按相同的步骤处理后，测定结果表明：在相应的保留时间，空白试）：料、猪浓缩料和预混合饲料中的添加回收情况。参考中华人民共和国农业农12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ1ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ12345512345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ1Ⅰ12345ⅠⅡⅢⅠ5.943.52ⅡⅢ5ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ14523ⅠⅡⅢⅠ85.990.78.575.78ⅡⅢⅠⅡⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠ85.894.980.996.096.496.891.487.194.189.886.897.687.889.291.583.784.688.391.995.897.45.813.983.043.6012345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ1ⅠⅡⅢⅠ4.605.08ⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ14523ⅠⅡⅢⅠ97.788.895.499.398.697.1ⅡⅢ1ⅠⅡⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠ12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ1ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ96.486.887.487.089.696.586.595.191.090.794.391.496.287.186.289.988.788.895.286.593.885.789.696.595.392.990.790.094.787.295.687.786.690.093.592.594.285.591.491.493.488.496.087.793.093.389.690.291.289.590.891.591.691.23.025.073.175.272.755.764.393.501.824.014.523.16ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ85.486.892.794.792.095.788.793.487.386.892.396.594.492.089.785.296.893.696.993.087.192.193.792.189.987.486.285.192.992.486.486.289.297.092.390.791.289.789.687.888.287.585.289.388.589.190.991.791.190.490.889.291.889.35.622.943.864.173.433.505.423.983.304.143.464.2412345ⅠⅡⅢⅠ98.487.391.493.687.779.081.983.194.778.894.882.479.296.583.784.487.188.683.399.789.486.087.088.68.328.616.578.647.49ⅡⅢ80.496.690.082.392.292.898.687.091.192.090.590.17.236.176.91ⅠⅡⅢⅠ88.687.684.789.089.682.881.195.781.698.396.480.380.794.283.993.181.196.093.8100.584.391.888.091.75.216.987.618.317.18ⅡⅢ85.384.784.684.493.582.278.889.594.986.387.485.47.673.177.08ⅠⅡⅢⅠ98.179.398.385.896.684.783.588.195.782.980.199.590.282.379.797.193.585.587.486.894.882.985.891.53.242.918.916.957.93ⅡⅢ96.785.493.278.783.092.395.799.393.589.892.489.15.928.636.87说明该方法对不同饲料样品中，不同含量的测定均有较好的准确度。各种基质的Enramycin-20220323-1012:MRMof3ChannelsES+3.03100790.687>1089.09(EnramycinB)1.64e43.031004.174.102.022.274.104.403.75 0.822.754.403.75 0.822.755.005.7801.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-1011:MRMof3ChannelsES+1002.79785.84>1089.04(EnramycinA) 3.83e4 4.044.24 1.992.112.223.063.70 4.044.240Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-492:MRMof3ChannelsES+ 4.18e31001.822.082.184.25790.687>1089.09 4.18e33.822.244.311.694.43 0.811.524.75 1.752.743.822.244.311.694.43 0.811.524.75001.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-491:MRMof3ChannelsES+ 4.154.265.38e31004.23785.84>1089.04 4.154.265.38e32.094.104.302.212.012.613.664.051.761.764.410.820.821.5400Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-1072:MRMof3ChannelsES+1003.05790.687>1089.09(EnramycinB) %%2.032.1 1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-1071:MRMof3ChannelsES+1002.79785.84>1089.04(EnramycinA) 3.77e4%% 0Time0Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-332:MRMof3ChannelsES+1003.01790.687>1089.09(EnramycinB) 1.87e43.8302.102.373.763.8301.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-331:MRMof3ChannelsES+1002.77785.84>1089.04(EnramycinA) 1.39e50Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-252:MRMof3ChannelsES+1004.174.24790.687>1089.09(EnramycinB) 1.892.243.153.804.08 1.892.243.153.804.084.332.272.27 1.693.101.661.664.42 0.84 0.841.604.675.181.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-251:MRMof3ChannelsES+ 4.265.59e31004.18785.84>1089.04(EnramycinA)4.064.064.293.131.882.032.282.793.994.363.134.504.850Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-372:MRMof3ChannelsES+790.687>1089.09(EnramycinB)%% 1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220324-371:MRMof3ChannelsES+1002.77785.84>1089.04(EnramycinA) %%0Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-732:MRMof3ChannelsES+790.687>1089.09(EnramycinB)%% 1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-731:MRMof3ChannelsES+1002.79785.84>1089.04(EnramycinA) 2.28e4%%2.092.262.983.0Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-652:MRMof3ChannelsES+3.821002.16790.687>1089.09(EnramycinB)2.33e33.821002.16 2.062.223.013.784.252.000 0.213.013.784.252.0001.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-651:MRMof3ChannelsES+1002.172.503.644.24785.84>1089.04(EnramycinA) 1.34e32.731.90 1.973.334.10 1.34e32.731.903.285.280.811.234.493.285.280.811.234.49 0.171.575.366.026.216.7300Time1.002.003.004.005.006.00Enramycin-20220323-742:MRMof3ChannelsES+1003.04790.687>1089.09(EnramycinB) 8.48e33.822.432.623.784.1902.432.623.784.190