饲料中β-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法 征求意见稿

2饲料中β-受体激动剂的测定液相色谱-串联质谱法本文件描述了饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、克伦普罗、班布特罗、妥布特罗、卡布特罗、羟甲基克伦特罗、利托君、马喷特罗、溴代克伦特罗、克伦塞罗、苯氧丙酚胺和克伦潘特等21种β-受体激动剂液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、克伦普罗、班布特罗、妥布特罗、卡布特罗、羟甲基克伦特罗、利托君、马喷特罗、溴代克伦特罗、克伦塞罗、苯氧丙酚胺和克伦潘特等21种β-受体激动剂的测定。本文件中沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗的检出限为5μg/kg，定量限为10μg/kg；齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、克伦普罗、班布特罗、妥布特罗、卡布特罗、羟甲基克仑特罗、利托君、马喷特罗、溴代克伦特罗、克伦塞罗、苯氧丙酚胺和克伦潘特的检出限为10μg/kg，定量限为50μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样中的β-受体激动剂用盐酸-甲醇溶液提取，经固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准溶液校准，外标法定量。5试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1水：GB/T6682，一级。5.2甲醇：色谱纯。5.3乙腈：色谱纯。35.4甲酸：色谱纯。5.5盐酸溶液（0.1mol/L）：移取8.3mL盐酸，用水稀释、定容至1000mL，混匀。5.6盐酸-甲醇溶液：移取80mL盐酸溶液（5.5），加入甲醇20mL，混匀。5.75%氨水甲醇溶液：移取5mL氨水与95mL甲醇，混匀。5.80.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸（5.4），用水稀释、定容至1000mL，混匀。5.90.1%甲酸乙腈溶液：移取1mL甲酸（5.4），用乙腈稀释、定容至1000mL，混匀。5.10标准储备溶液（1mg/mL）：准确称取21种β-受体激动剂（中英文名称、CAS号、纯度等按附录A规定执行）标准品各10mg（精确至0.01mg），分别于10mL容量瓶，用甲醇（5.2）溶解、定容、混匀。于－18℃以下保存，有效期12个月。或购买有证标准溶液。5.11混合标准中间溶液（10μg/mL分别准确移取标准储备溶液（5.10）各0.5mL于50mL容量瓶中，用甲醇（5.2）稀释、定容、混匀。于－18℃以下保存，有效期6个月。5.12混合标准系列溶液：准确移取适量混合标准中间溶液（5.11用0.1%甲酸溶液（5.8）稀释、定容、混匀，配制成质量浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的混合标准系列溶液。临用现配。5.13固相萃取柱：混合型阳离子交换柱，60mg/3mL，或性能相当者。5.14微孔滤膜：0.22μm，有机系。6仪器设备6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。6.2分析天平：精度0.01g和0.00001g。6.3旋涡混合器。6.4超声波清洗器。6.5振荡混合器。6.6离心机：转速不低于8000r/min。6.7固相萃取装置。6.8氮吹仪：温度可控制在50℃。7样品按GB/T20195制备试样，称取样品至少200g，粉碎后通过0.425mm孔筛，充分混匀，装入密闭容器中保存，备用。选取类型相同，均匀一致、且在待测物保留时间处，仪器响应值小于方法定量限30%的饲料样品，作为空白试样。8试验步骤8.1提取平行做两份试验。称取试样2g（精确至0.01g）于50mL离心管中，准确加入20mL盐酸-甲醇溶液（5.6），涡旋混匀，振荡提取20min，以8000r/min离心5min，上清液作为备用液。8.2净化8.2.1配合饲料、浓缩饲料和精料补充料4固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化。准确移取5mL备用液（8.1）过柱，依次用3mL水、3mL甲醇淋洗，抽干，用5mL5%氨水甲醇溶液（5.7）洗脱，收集洗脱液，于50℃氮吹至干，准确加入1mL0.1%甲酸溶液（5.8）溶解，涡旋混匀，过微孔滤膜（5.14），备用。8.2.2添加剂预混合饲料取适量备用液（8.1），过两次微孔滤膜（5.14），备用。8.3基质匹配混合标准系列溶液制备8.3.1配合饲料、浓缩饲料、精料补充料选取同类型空白基质试样，按8.1和8.2.1步骤处理，净化吹干，准确加入1mL混合标准系列溶液（5.12）复溶，配制成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL系列基质匹配混合标准系列溶液。8.3.2添加剂预混合饲料选取同类型空白基质试样，按8.1和8.2.2步骤处理，准确移取适量上清液稀释混合标准中间溶液（5.11）至浓度为1μg/mL基质混合标准溶液，再将其稀释成浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL系列基质匹配混合标准系列溶液。8.4测定8.4.1液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a）色谱柱：C18柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.8µm，或性能相当者；b）柱温：35℃;c）流速：0.3mL/min；d）进样量：5μL；e）流动相：A：0.1%甲酸溶液（5.10），B：0.1%甲酸乙腈溶液（5.11），梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序55558.4.2质谱参考条件质谱参考条件如下：a）电离模式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+b）检测方式：多反应监测（MRM）；d）干燥气流速：14L/min；e）雾化器压力：20psi；f）鞘气温度：400℃;g）鞘气流速：11L/min；h）毛细管电压：3000V；i）喷嘴电压：1500V；多反应监测（MRM）离子对、碎裂电压及碰撞能量参考值见表2。表2多反应监测（MRM）离子对、碎裂电压及碰撞能量参考值1523845678896668.4.3基质匹配混合标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下，分别取基质匹配混合标准系列溶液（8.3）和试样溶液（8.2）上机测定。基质匹配混合标准溶液的定量离子色谱图见附录B。8.4.4定性在相同试验条件下，试样溶液与基质匹配混合标准系列工作溶液中待测物的保留时间相对偏差应在±2.5%之内。根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中待测物定性离子的相对离子丰度与浓度接近的基质匹配标准系列工作溶液中对应的定性离子的相对离子丰度，若偏差不超过表3的规定，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差>50>20～50>10～208.4.5定量以基质匹配混合标准系列溶液中待测物的浓度为横坐标，定量离子的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内，若超出7线性范围，应重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与基质匹配混合标准溶液的浓度相差不超过30%。9试验数据处理试样中待测物的含量以质量分数wi计，单位为微克每千克(μg/kg）表示，多点校准按公式（1）计算，单点校准按公式（2）计算：…………式中：ρi——由基质匹配混合标准曲线查得试样溶液中待测物的浓度，单位纳克每毫升（ng/mLV——试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；V2——最终定容体积，单位为毫升（mLf——超出标准曲线后的稀释倍数；V1——净化时所用试样提取溶液的体积，单位为毫升（mLm——试样质量，单位为克（g）。…………式中：Ai——试样溶液中待测物的色谱峰面积；Cis——基质匹配混合标准溶液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——试样提取溶液的体积，单位为毫升（mLV2——最终定容体积，单位为毫升（mL）；Ais——基质匹配混合标准溶液中待测物的色谱峰面积；V1——净化时所用试样提取溶液的体积，单位为毫升（mLm——试样质量，单位为克（g）。测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。10精密度在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的20%。8附录A21种β-受体激动剂标准品中文名称、英文名称、CAS号和纯度要求21种β-受体激动剂标准品中文名称、英文名称、CAS号和纯度要求见表A.1。表A.121种β-受体激动剂标准品中文名称、英文名称、CAS号和纯度要求123456789HydroxymethylclenbuteMapenterolhydrochlBromchlorbuterolhydrochloIsoxsuprinehy