应用指南 - 质粒大规模生产解决方案

目录 1 2 4 4 6 8 质粒是宿主染色体(或拟核)以外的闭合环状双链DNA分子，它们天然存在于E.Coli等细菌中，并为宿主提供竞争优势，包括抗生素抗性以及在极端环境中生存的能力，已成为重组DNA技术的基本工具。在治疗水平上，pDNA常被用作病毒载体基因治疗、无论是作为关键起始原料，还是作治疗性药物本身，质粒DNA的生产都至关重要。根据质粒使用的类型(在药物开发中是否用作起始/关键原料、中间体、原料药或药物产品)，有不同的机构推动不同的指南进行指导，以规范质粒的生产，克服相应的挑战。鉴于临床开发后续阶段的监管日益严格，重要的是通过原材料的控制、工艺的开发、1Gibco™细胞培养注射用水(WFI)Gibco™Gibco™细胞培养注射用水(WFI)Gibco™NaOH溶液一次性搅拌罐S.U.M.菌体裂解菌体裂解大肠杆菌发酵培养大肠杆菌发酵培养Gibco™Difco™SoytoneGibco™Bacto™Gibco™Difco™SoytoneGibco™Bacto™ThermoScientific™HyPerforma™玻璃反应器Gibco™Bacto™CDSupremeFermentationProductionMedium一次性发酵罐S.U.F./增强型一次性发酵罐eS.U.F.2ThermoScientific™DynaChrom™一次性层析系统POROS™50D弱阴离子交换填料POROS™50ThermoScientific™DynaChrom™一次性层析系统POROS™50D弱阴离子交换填料POROS™50HQ强阴离子交换填料疏水层析填料3 质粒纯化ThermoScientifc™Nalgene™ThermoScientifc™BioProcessBiotainer™生物储存瓶Containers一次性生物工艺容器5 质粒储存4 放行检测4残留DNA定量系统PrepSEQ™残留DNA残留DNA定量系统PrepSEQ™残留DNA样品制备试剂盒自动核酸提取仪(磁珠法)3以提高质粒产量1到50倍。此外，对于一些大肠•提高大肠杆菌发酵密度(培养基、补料、培养方式、溶如果使用人源或动物源物质，应符合《中华人民共和国药o-《药品共线生产质量管理指南》基因治疗和细胞治疗产品由于涉及的活体材料的可变性及可能含有传染性疾病的病原体，如质粒、病毒、病原体类产品的危害性较高，建议专用生产线或使用一次性生产系o-《欧洲药典》(EP8.0,2014)第5.2.8章医用产品的生产应优先考虑使用“非TSE相关动物物种材为减少TSE传播的潜在风险，建议使用无动物源生产原料4ThermoScientificHyPerforma提供最优化的混合效率、平均kLa和最小的剪切力，支持从细增加冷水循环面积，降温效果是其他品牌同类ThermoScientificHyPerforma一次性发酵罐Hyperforma一次性发酵罐(S.U.F.)采用传统的不锈钢发酵罐设计原理，通过高效的传质、混合和温度控制，专为微计。5:1的调节比可轻松实现从小体积至大规模的放大。增强型eS.U.F.更是通过升级改良，增加35%的冷却夹套面积，进一步•强大的混合能力，优异的氧传质能力，高效的控温能力•定制化一次性生物反应袋可精确匹配工艺需求•应用实例中最高OD600可达240•不含水解物和动物源成分，保证质量和一致性•灵活的包装，轻松放大至大规模体积发酵，优化发酵工作流•相比传统TB培养基质粒产量提高30%~40%，且提高批次间稳•不含动物源成分，完全植物来源的水解物•相比传统动物源和大肠杆菌发酵培养基可以更好地提高大肠•不含动物源成分，完全植物来源的水解物•相比传统动物源和大肠杆菌发酵培养基可以更好地提高质粒5降解DNA，将基因组DNA分解成小片段，从而度会产生很大的剪切力，同样会将DNA打断，•裂解罐集中供碱，造成局部过碱，裂解不充分•采用搅拌的方式进行混匀，因其传质是非线性相关，放•质粒DNA对剪切力敏感，产业化生产中如何保障质粒6•根据客户需求和包装规格不同，我们可以提供瓶子和一次性•除满足药典要求外，Gibco高品质注射用水每批次还会额外检•该产品可用于生物工艺的多个环节，如细胞培养、缓冲液配•多药典级原料•产品可应用于pH值调节、设施/设备消毒以及色谱柱清洁、消ThermoScientificHyPerforma一次性搅拌罐S.U.M.•顶置斜桨机械搅拌提供稳定的功率输入和平均的径向辐向液•可在低速搅拌下提供良好的混匀效果，同时降低剪切力，防•封闭轴承设计可减少搅拌过程中产生的颗粒物，符合•苏州生产的SUM价格相较进口版本下降20%，标准货号耗材7菌体裂解后除了目标产物质粒外，还有菌体碎粒一般比蛋白质大得多；第二，质粒带电非常高；第三，pDNA有很多种形式。但是目前质粒统层析填料对pDNA的结合载量较低。因此在保证产率/回收率和纯度的情况下，选择省时间、•传统质粒三步纯化法纯化成本高，生产效率低•大多数软胶介质，不能在高流速下运行，降低纯化效率8DynaChrom系统为层析供了完整的一次性解决方案。预设的系统选项和模块化流路组件设计可以满足用户不同的用于多个层析步骤，并可与自动化功能包相结合，提供高一致性、高性能的纯化工艺平台。•ThermoScientific™TruChrom™自动化软件基于Emerson™为技术转移、数据整合和数据存储带来了便利。可灵活配置•易于放大，同一设备支持1-1980L/hr流量范围，可满足从临床•硬件可支持四种规格的一次性管路组件，安装简便，软件可POROS™灌注层析填料是目前工业级生物分离领域中性能最好的层析介质，其硬质、高效的颗粒将层析通量提高为质的2~3倍，并可以获得高分辨率的分离效果，同时POROS™灌注层析产品易于清洗和装柱，越来越多的客户将POROS™填•可放大性强，可以在高流速下运行，表现稳定•大孔硬胶介质，提高传质流速和结合载量•填料粒径小，提高分辨率和杂质分离能力•已有许多客户将POROS™填料用于其FDA认证的生物治疗产9如鉴别、含量、纯度(包括DNA形式及宿主残留DNA等杂质)及内毒素等。其中E.coli作为质粒生产的宿主菌，其残留宿主DNA作为工艺杂质需工艺过程中的原料产品，还是作为病毒载体及mRNA终产品里的杂质，其含量同样需要准确o-《中国药典》2020版三部《人用疫苗总论》对关键质量属性相关的工艺杂质(如细胞基质残留DNA)如因产品特性无法在成品中检测时，应在适当的中间产物取样检测，检测结果应能准确反映每一成品剂量中的残留o-《中国药典》2020版三部《人用基因治疗制品总论》例如来自包装细胞系或细菌的宿主细胞DN如使用致瘤细胞系，残留DNA水平应严格控制并保持在最低水平。如已经证明可以有效控制或去除，并达到可接受•磁珠法提取试剂，支持手工或自动化提取•适用于多种复杂基质样本•适用于不同工艺阶段样品•稳定耐用，磁珠法核酸提取经典平台•高通量，单次完成1-96样本提取•开放平台，支持常见磁珠法试剂盒纯化后的质粒保存在TE缓冲液中，一般质粒可以在4°C短时间保存，经常使用的质粒可以保存在-20°C冰箱中能保存半年，长期保存建议放在-80°C冰箱。因此储存容器不仅需要降低残留污•专为药物活性成分样品的储存和运输设计•不同材质可选，适用于不同温度条件储存•防穿刺，耐碰击的瓶盖和瓶体保护存储物安全，且有效防止•提供完善的验证文件支撑，节省您的验证时间和成本业的液体处理、储存和运输而研发。容量50m•厚度高达14mil，五层共挤压结构减少分层的可能•良好的韧性和抗穿刺性，高气液阻隔性能；支持-80°C至6•苏州生产，支持定制。货期短，标准货号有安全库存单组分的干粉培养基用于高效的质粒和重组化学限定的发酵培养基，支持强大的质粒和重组蛋白生产。它是一种不含水解物和动物源成分且易于使用的培养基，可用于替代水解物和动物源培养基，可节省时间和精的营养成分。该配方利用了ThermoFisher在蛋白胨、发酵和创新的化学限定培养基我们的化学限定的配方没有动物源成分，这消除了BSE/TSE相关的风险，并且监管的除大量的原材料管理，称重，或混合多种成分，您将实现效率的提高和各种繁琐步骤•有效期18个月，储存在2-8°C的冰箱中•可同时支持高压灭菌或者除菌过滤•为标准发酵设备而设计•可轻松放大至大规模体积的发酵CDFPM培养基与TB培养基一致性对比OD600测量值低于15。28小时AB160140100806040200HyPerformaeS.U.F.在罐体底热夹套，将设备的冷却面积增加了25%，与此同时，侧壁的夹套面积也增加了10%。因此，与原始HyPerformaS.U.F.相比，HyPerformaeS.U.F.的冷却表面积共增加35%。使用设定点范围为-5°C至55°C的24kWThermoScientific™NESLAB™温度控制装置(TCU)(460VAC，60Hz，3相，50A；货号：SV50239.08)以及300LHyPerformaeS.U.F.进行实际测试，结果表明，增加的35%夹套面积使设备的全体积加热(从10°C到42°C)时间缩冷却时间缩短20分钟，改进了25%。在开发HyPerformaeS.U.F时，我们对各种叶轮进行了研最终我们选定了五种叶轮形制在液体中进一步测试功耗和kLa性能。我们将两个选中的最优叶轮与Rushton叶轮一起用于极端情况下的大肠杆菌培养。在处于室温的未通气的水中进行混合时，第一种叶轮(虽然直径和叶片高度都大于Rushton叶轮)用电量与Rushton叶轮相等。第二种较大的增强型叶轮所用的电量比Rushton叶轮多50%左右。最后，我们选择使用第二个叶轮进行生产，因为由于HyPerformaeS.U.F.s的叶轮比HyPerformaS.U.F.s中原来的Rushton叶轮更大，我们同时对变频器(variable图2.HyPerformaeS.U.F.中的增强型叶轮提供优于HyPerforma为进行平行对照，除叶轮变化之外，其他实验条件均保持完全一致。增强型叶轮性能的改善是通过减少整个培养过程中补充的氧气量来证明的。当培养液中的碳源耗尽时开始补料，当系统检测到溶解氧(DO)突增时则开始自动补料。图3是配备增强型叶轮的30L和300LHyPe之间观察到类似的氧气消耗量(vvm)(图3)。与配备配备在HyPerformaS.U.F.即将运行结束时补氧观察到噪声的增加，是由于增加了消泡剂的添加量。而在使用增强型叶轮的eS.U.F.中，消泡剂用量较少。此外，在使用300LHyPerformaS.U.F.培养的最后1.25小时内，由于使用原37°C以上。采用较大型号的TCU或TCU中的泵可减少或防止这种噪声。然而，这种噪声也证明在要求更高的培养的。当夹套面积增加时，即使OD达到210(比原始300LHyPerformaS.U.F.温度开始升至设定点以上时高70)，温度也不会高于37°C设定值的0.2°C。 时间(小时)标准化搅拌(最大rpm%)标准化标准化O(vvm)增强型30L搅拌增强型300L搅拌ORushton30L*O增强型30LO增强型300LEFT(小时)为了针对HyPerformaeS.U.F.的改造进邀请了两位客户进行了外部验证。由于这些客户均为现有设备的用户，范围仅限于HyPerformaeS.U.F.叶轮的州剑桥市，官网：)进行。Synlogic是一家将合成生物学的变革潜力带入医学临床阶段的生物技术公工艺开发和放大工具。Synlogic的某些发酵工艺需要对部以精确地做到这一点，提供微生物生长的所需的必要微大氧气流量减至总发酵流量的仅7%(图4)。这使在30L此外，为了评价放大情况，客户还对300LHyPerforma也产出了相似的结果，最大补氧量约为20SLPM，而30其未来的工艺开发提供了信心。鉴于这些成功的结果，第二个客户是亚洲的一个CDMO，他们面临着与其他的氧气；更换多个高压气瓶的需求非常昂贵，需要较大的人力成本。同时，他们也希望消除一个长期存在的物流挑战。客户现有设施中气体管道的容量有限，因此升级成本避免了昂贵的设施升级或成本负担，以及使用大量高压氧气瓶的安全问题。该客户证明，当他们从配备Rushton叶需要使用最大流量为6SLPM的氧气，不到一个气瓶即可完成运行。该客户对HyPerformaeS.U.F.可与不锈钢发酵罐相媲美的性能非常满意，并计划在工艺开发和GMP生HyPerformaeS.U.F.的设计显著提高了冷却能力，并降低效率更高的增强型抛物面叶轮。对增强夹套的测试证实，加热和冷却的温度变化分别缩短了23%和25%。在使用相入的气体更有效地分布在整个培养过程中，与Rushton叶质粒DNA在新型疗法中的应用广泛，因此其生产也受到了较大的关注。利用阴离子交换层析的纯化方法可以实现灵活、可放大的质粒DNA的纯化工艺。ThermoFisherScientific开发了多POROS™填料可以在高线性流速下运行，与其他填料相比，大孔结构降低了传质阻力，并且小粒径提高了去除杂质的效果。POROS具有一系列不同的阴离子层析填料实验使用200μLRoboColumn™高通量筛选柱对表明，在pH7.0,POROSD50表现出最高的回收率(如图三种AEX填料在pH7.0和60mS/cm的上样电导率下均表现出最佳回收率(如表一)。实验使用1mL层析柱测试AEX以POROS™D50因具备大孔径和内孔表面积的优势，成capacity77571mS/cm时流穿，pDNA在电导率150mS/cm时洗脱，证实D50填料>10mg/mL的结合能力，通过在洗脱缓冲液中添加2•手动或自动样本制备，从复杂样本基质中高效回收残留•从样本到结果的完整解决方案，包括样本制备试剂盒、重组蛋白的E.coli表达系统的宿主细胞DNA。该系统可靠且快速，通常在4小时内即可对大肠杆菌DNA进行灵敏性(定量限=15pgDNA/ml供试样本，图1)和特异性(图3)定量。该性能有助于以高可信度从包括过程中样本至原液的多种样本类型中获得定量数据，无论样本是含有完整或碎DNA-卡那霉素抗性基因定量试剂盒•通过创新的DNA-free预混液实•通过手动和自动样本制备提供重现性结果，经优化以从•易于使用，5小时内即可获得结果•从样本到结果的完整解决方案，包括样本制备试剂盒、AppliedBiosystems™resDNASEQ™质粒DNA-霉素抗性基因(pDNA-KanR)定量试剂盒基于qPCR系统，以检测含有卡那霉素抗性基因的残