胚胎胚胎工程实验技术专家讲座

三、胚胎分割优势:可成倍增加胚胎数量，能够快速繁殖良种畜。概念:将早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，经移植取得同卵双胎或多胎技术。胚胎胚胎工程实验技术第1页一）胚胎分割技术研究概况胚胎分割技术开始于Nicholas（1942）对大鼠2-细胞卵裂球分离和培养。其后,Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球发展规律,得到了世界上首例半胚起源活体动物。20世纪70年代以来,伴随胚胎培养及移植技术发展和提升,哺乳动物胚胎分割技术取得了突破性进展。当前胚胎分割研究方向也正向着简单化和实用化发展。我国1986年张涌等首次利用胚胎分割方法取得同卵双生小鼠,1987年又取得同卵双生山羊。1986年窦忠英等取得分割胚牛犊,1990年又取得奶牛四分胚后代。1987年谭丽玲等取得同卵双生犊。胚胎胚胎工程实验技术第2页胚胎胚胎工程实验技术第3页特点:后代含有相同遗传物质，克隆选择胚胎:发育良好，形态正常桑椹胚或囊胚使用主要仪器:体视显微镜、显微操作仪、切割刀、切割针注意:将内细胞团均等分裂胚胎胚胎工程实验技术第4页二）胚胎分割基本程序切割器具准备；胚胎预处理；胚胎分割；分割胚培养；分割胚移植；胚胎胚胎工程实验技术第5页1.切割器具体视显微镜；显微操作仪；胚胎固定管；胚胎分割针；胚胎胚胎工程实验技术第6页2.胚胎预处理用链霉蛋白酶处理链霉蛋白酶作用:使透明带软化、变薄或去除胚胎胚胎工程实验技术第7页3.胚胎分割方法酶解法:用链霉蛋白酶处理机械法:用分割针切开透明带胚胎胚胎工程实验技术第8页胚胎分割基本操作选择良好桑椹胚或囊胚移入培养皿中,用分割针或分割刀片将其切开,吸出其中半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。胚胎胚胎工程实验技术第9页胚胎胚胎工程实验技术第10页4.分割胚培养；

原因:早期胚胎切割后发育能力低，普通是经包埋后移植到中间受体输卵管中培养几天至囊胚，再从输卵管中回收胚胎，最终移植给受体。方法:体外培养体内培养（需琼脂包埋）胚胎胚胎工程实验技术第11页琼脂包埋作用固定胚胎便于回收胚胎胚胎工程实验技术第12页分割胚移植要求:胚胎分割后能够直接移植给受体,也能够进行超低温冷冻保留。为提升冷冻胚胎移植后受胎率,分割胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段,再进行冷冻。胚胎胚胎工程实验技术第13页三）胚胎分割技术应用应用:在畜牧方面:扩大优良家畜数量在研究方面:培养遗传特征相同试验动物性别判定存在问题:如:早期胚胎细胞分化和定位发育机制不一样阶段胚胎细胞分化时间和发育潜力胚胎胚胎工程实验技术第14页受精卵分裂

早期胚胎胚胎分割基本过程代孕母牛植入植入分割胚胎胚胎工程实验技术第15页胚胎分割基本过程胚胎移入培养液分割胚胎（机械法、酶处理）移植胚胎给受体着床产仔胚胎胚胎工程实验技术第16页四、胚胎干细胞核移植技术1.概念:（胚胎干细胞）:简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺中分离出来一类细胞。胚胎胚胎工程实验技术第17页2.特点:1)形态:体积小、细胞核大、核仁显著。2)功效:含有发育全能性；是一个高度未分化细胞，可分化为成年动物体内任何一个组织和器官。3）应用:在体外培养条件下，能够增殖而不发生分化；对它能够进行冷冻保留，也能够进行遗传改造。3.主要用途:(1)治疗人类一些顽症(2)培育出人造组织器官，用于器官移植(3)是研究体外细胞分化理想材料胚胎胚胎工程实验技术第18页一）胚胎干细胞核移植程序喂养层细胞培养体系建立胚胎干细胞取得胚胎干细胞核移植胚胎胚胎工程实验技术第19页1.喂养层细胞培养体系建立喂养层培养体系组成胚胎成纤维细胞作用:抑制细胞分化成纤维细胞（fibroblast）:是疏松结缔组织主要细胞成份，由胚胎时期间充质细胞(mesenchymalcell)分化而来。细胞较大，轮廓清楚，多为突起纺锤形或星形扁平状结构，细胞核卵圆形，核仁大而显著。细胞功效活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具显著蛋白质合成和分泌活动。成纤维细胞对不一样程度细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤修复有着十分主要作用。喂养层细胞（feederlayer）:在正常机体内，细胞除了取得一些血液来营养外，还在细胞与细胞之间交换特殊物质，用于分裂分化和营养等。因而，在细胞体外培养中，除了正常培养基外，先培养一层特殊细胞，然后再在其上接种要试验细胞，这么更能模拟体内环境。这些特殊细胞就是喂养层细胞，通常是成纤维类细胞，这些细胞能够提供试验细胞更加好营养，有分化研究则是必须有喂养层细胞。胚胎胚胎工程实验技术第20页2.胚胎干细胞取得时期:囊胚或囊胚期以前如小鼠:桑椹胚、囊胚人体:囊胚、原始生殖细胞培养:置于含喂养层培养液中培养方法:原代培养和传代培养传代培养作用:抑制胚胎干细胞分化胚胎胚胎工程实验技术第21页胚胎干细胞培养胚胎胚胎工程实验技术第22页3.胚胎干细胞核移植指把胚胎干细胞核移植到去核卵细胞中,经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物技术。胚胎胚胎工程实验技术第23页胚胎干细胞核移植:

胚胎胚胎工程实验技术第24页二）胚胎干细胞应用培养克隆动物核供体取得基因敲除动物治疗性克隆胚胎胚胎工程实验技术第25页1.以下相关动物胚胎移植叙述中,错误是A.受孕母畜体内受精卵或胚胎均能移植B.受体母畜必须处于与供体母畜同时发情状态C.超数排卵技术要使用一定激素D.试管婴儿只是受精及早期卵裂过程在试管中进行2.以下对于优良种畜胚胎移植说法不正确是A.供体母牛必须是同一物种良种B.受体母牛必须是同一物种良种C.供体公牛必须是同一物种良种D.受体母牛能够是同一物种普通健康牛练习:胚胎胚胎工程实验技术第26页3.供体胚胎移植到受体后,游离胚胎在发育过程中形成胎盘与受体相连,并经过胎盘与受体血液进行物质交换。以下说法正确是A.受体是为供体胚胎提供发育条件B.受体与胚胎血型应相同,不然会发生免疫排斥反应C.受体与胚胎血液混融在一起D.胚胎心肺功效都