药物研究与发展全册完整备考资料

－PAGE1－－PAGE24－药物研究与发展全册完整备考资料第一章总论医药是人类战胜疾病的重要手段，它为人类的生命健康提供了重要保障,在漫长的人类发展历史长河中曾经起过并将继续发挥重要的作用。随着生活水平的提高，人们对药物的需求也日益增加。迄今为止，人类还有很多疾病未能得到有效治疗。从当今科技发展的方向看，药物仍然是治疗疾病的主要方式。因此，不断发展新的、更为有效的药物在今后相当长的一段时间内都是世界范围内的重要课题。新药发展策略广泛筛选药物的发现是药物研究最初始的步骤，是寻找和认识各种物质药用价值的过程。由于药物的作用是具体物质的固有属性，药物发现的过程是对未知世界的探索过程，发现药物，不仅需要获得这些物质，更重要的是发现这些物质的内在药用属性。药物发现的最基本方式是偶然发现和通过筛选来发现。药物的偶然发现主要是在生活和医疗实践过程中偶然遇到的发现。如：①从食物中发现药物。人们出于生存的目的，将大量的天然产物用作食物，在应用过程中发现某种物质具有防治疾病的作用，从而发展成为药物。这类药物的发现，在医药起源过程中有重要的地位；②药物新适应症的发现。许多药物在临床应用过程中，由于使用者身体状况和疾病的基础不同，表现出对某些药物的非预期的作用，从而发现了新的适应症，如近年来上市的Viagra就是典型的例子；③非常规过程发现药物。无论是在医疗实践还是在研究过程中，由于采用非常规的操作过程，(有些甚至是偶然的失误)而发现了新的药物，如青霉素就是在实验室偶然发现的。通过偶然机会发现新的药物，虽然成功的例子非常多，但其过程一般是不可控的，因此不可能成为人们主动寻找药物的途径。显然，广泛筛选便成为药物发现的主要方式。药物筛选是主动寻找药物的过程。所谓筛选，就是对可能作为药用的物质，采用适当的方法进行实验，发现其药用价值。筛选的对象是可能作为药用的物质，因此，收集被筛选的物质(样品)越多，发现新药的可能性越大。筛选的方法就是能反映药物作用的技术手段，这些技术手段越灵敏越可靠，漏筛的可能性就越小。筛选药物的策略多种多样，下面是几种常见的方式。定向筛选所谓定向筛选,就是采用特定的方法,专门筛选防治某种疾病的药物。这种方法是现代医学研究过程中长期使用的方法,并在药学研究中取得了巨大的成就,如治疗心血管系统疾病的药物,抗肿瘤药物等等。但对于被筛选的物质来讲,却不能全面反映出其内在的作用。因此,理想的方法是在定向筛选的同时能够实现一药多筛,从多方面发现这些物质的作用。筛选特定样品这种筛选方法的特点在于利用了已有信息,在特定的样品范围内进行筛选。例如抗生素类药物的筛选,就是根据青霉素的来源作为借鉴,以多种细菌的产物作为样品,筛选其抗菌活性,从而发现了大量新的抗生素药物。我国目前对中药的研究也是采取这种方法,根据中药已有的相关信息,选取对某类疾病可能有效的物质,筛选其有效成分。采用这种方式筛选,具有较高的成功率,但由于筛选范围受到限定,特别是所依据的信息资料不可能都有代表性,也可能产生误导。比较筛选比较筛选是根据对现有药物的认识,获得结构或性质相似的样品,采用确定的模型进行筛选,由此发现同类型而作用更好的新药物。这种方法主要用于模仿（me-too）创新药的研究,成功率也较高,但是难以产生原始创新药物。随机筛选所谓随机筛选,就是采用不同的方法,对可能作为药用物质样品进行药理活性的广泛筛选。这种筛选方法是新药发现的最基本方式,也是在医药发展过程中实际存在的方式。从原始阶段人类寻找药物到目前对新化合物的各种生物活性测试,实际上都是随机筛选。随机筛选的特点是能够发现全新的药物,但同时其成功率是不可预测的。要提高药物随机筛选的成功率,就要保证足够的筛选样品量和广泛的筛选方法。先导化合物的结构改造先导化合物是指已具有初步活性的化合物分子，它可以是已经上市的现有药物，也可以是业已被发现具有明显药理活性或作用特点的合成或天然化合物，其中有些是经过广泛筛选后得到的。运用现代药物设计方法可以对先导化合物进行优化，以便进一步提高活性、降低毒性、增加特异性或改善药代动力学特性等。这种方法是新药研究与开发的经典方法，通常称为“间接合理药物设计”，即在不清楚药物作用靶结构的情况下，通过对分子三维结构与生物活性之间构效关系的研究，来指导药物设计的方向。这是一个多轮次重复的过程，而每一轮都将会提供一些有用的信息给下一轮药物设计使用。这种研究方法，结合综合活性筛选，有时还会发现意料之外的新活性，从而成为另一种治疗领域的药物或先导化合物。合理药物设计合理药物设计(rationaldrugdesign)是依据生物化学、酶学、分子生物学及遗传学等生命学科的研究成果，针对这些基础研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道及核酸等潜在药物作用靶位，再参考其内源性配体或天然底物的化学结构特征设计药物分子，以发现选择性作用于靶位的新药，这些药物往往具有活性强、作用专一，且副作用较低的特点。而传统新药多是经偶然观察或对大量天然物质和合成物质进行系统筛选后发现的，这种方法发现的药物由于缺乏对药物作用靶特征的了解及作用环节多，选择性不是很高，因此往往活性很低，毒副作用较大。合理药物设计分为直接设计和间接设计(模拟)。直接设计是指在已知靶物质三维结构的情况下进行的药物分子设计。一般的方法是测定酶和受体的蛋白质晶体结构，常用的方法是X衍射晶体测定法和高精度的核磁共振法，然后将亲和力和活性最强的底物与酶或受体嵌合形成复合物后，再测定复合物的晶体结构或在溶液中的三维结构，这样即可了解到药物和靶相互作用的三维模式，在此基础上再进行先导物分子结构修饰，也可进行所谓的全新药物分子设计(denovodrugdesign)，即设计出与先导物结构完全不同的新化合物分子。间接设计方法是在未知靶物质结构的情况下，利用药物分子与靶物质间的互补性，探索一系列药物的三维结构与生物活性的定量关系，即根据已知生物活性化合物的结构，反推未知靶物质的结构和性质，或利用结构已知的同族类似靶物质推测其活性部位的空间结构，然后再利用所推测的靶物质结构和性质设计新化合物。模仿创新采用模仿(me-too)方法寻找新药就是在别人专利药物的基础上，对化学结构加以修饰和改造，研究出自己的专利药物，新药研究开发的模仿方法，是当今世界各国广泛采用的战略，即使是实力很强的大公司也不例外，因为这种方法投资少，周期短，成功率高，其市场实际上还是很可观的。模仿方法研究开发新药已经取得了巨大的成功。例如SmithKline根据H2-受体拮抗剂理论，成功开发出西咪替丁(cimitidine)，于1976年投放市场。Glaxo的科学家们得知关于H2-受体拮抗剂有研制成功新药的可能性后，于是他们决定参与竞争。终于在1981年推出了他们稍加改造的类似物雷尼替丁，成为世界最畅销的药品，年销售量达30多亿美元。之后，Merk又推出了疗效更高的法莫替丁(famotidine)。又如，血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的开发，大量的早期工作是在各大学完成的，当时并没有引起人们的商业追求。后来，Squibb逐渐发生了兴趣，直到70年代后期才开发成功了卡托普利(captopril)。紧跟着，Merk就推出了依那普利(enalapril)，该品种由于去掉了分子中的巯基，增强了与酶结合的强度，故毒性小，作用持久。依那普利在1995年全球销售额达23亿美元。这两个药物成为80年代高血压和充血性心力衰竭治疗的主药。90年代初，B-MSauibb又上市了福辛普利(fosinopril)，成为第三代血管紧张素转化酶抑制剂的代表。手性均一体创新手性药物是指只含单一旋光异构体的药物。由于许多药物作用过程涉及药物与机体生物大分子之间的手性匹配，近十年来手性药物的研究开发引起了人们的极大兴趣，并成为医药工业研究开发的新领域。美国、英国、瑞士、瑞典等国相继颁布了关于手性药物的法规，要求凡带有手性中心的新药物分子，必须要进行不同对映体之间的活性对比研究，以确定其最终药用形式。手性药物在药效学性质上存在以下四种情形：(1)异构体具有完全不同的药理作用。例如，反应停(thalidomide)的S―构型为镇静剂，R―构型无镇静作用而有致畸作用；乙胺丁醇(ethambutol)的S，S―构型具有抗结核菌作用，而R，R―构型则可导致失明；喘速宁(trimethoquinol)其S―构型为支气管扩张剂，R―构型则具有抑制血小板凝聚作用。(2)异构体中一个具有药理活性，另一个没有药理活性。例如：甲基多巴(methyldopa)只有S―构型具有抗高血压作用。(3)两个异构体虽药理作用类型相同但作用强度不同。例如，心血管系统药物普萘洛尔(propranolol)，其S―异构体的β―受体阻断作用比R―异构体强约100倍；抗炎镇痛药萘普生(neproxen)，其S一异构体疗效为R一异构体的28倍。(4)两个异构体的药理作用类型和作用强度完全相同。这种情况一般是手性中心不参与受体结合或仅存在非特异性作用的情况。例如，异丙嗪(promethazine)的两个异构体具有相同的抗组织胺活性和毒性。对手性药物的评价研究，可以发现不同对映体的药理学特性，为开发疗效好、副作用小、治疗成本低的手性药物提供依据，也将对阐明药物作用机理、预测药物疗效和毒性、发现新的作用类型和适应症提供帮助。据统计，目前世界药品市场共约1,700种药物(原料药)中，含有手性的药物占57％，但目前仅有20％以单一对映体作为药用，其余80％仍以外消旋体用于临床。不过开发单一异构体药物的机会越来越少了，首要的原因就是自1990年代初期开始，美国食品药物管理局（FDA）就鼓励大制药公司开发单一异构体药物，代替消旋体上市。因此，今后对于手性化合物的开发机会在于从现有药物中分离母体药物的活性代谢物。当然，从长远观点来看，最根本的战略还是发现新化学实体。新药研究技术组合化学技术组合化学(combinatorialchemistry)是由Furka等于1988年首先提出的，但直至1991年在一次专门的讨论会上才正式应用这一名词。组合化学是一种合成策略，目的是建立大型化合物库，因此组合化学可定义为在不同结构的构建块之间以共价键系统、反复地进行连结，从而产生一批不同的分子实体的方法。组合化学概念的提出是对传统有机合成以及活性物质筛选观念的挑战。长期以来，化学家们认为化合物要逐一合成、纯化、鉴定其结构，然后进行生物活性的测定，但这种方法效率低、速度慢，使得新药开发成本越来越高，周期越来越长；而组合合成方法可以利用有限的反应，同时合成大量的化合物，一个组合库可以包括从几十到几百万甚至上千万或更多个化合物，生物活性测定可以对一种化合物进行，更多情况下是对未经纯化的混合组分进行筛选。有人作过这样的比喻，如果把包括1024个化合物库中的每一个化合物放入微孔板的一个小孔中，结果是，这个库将覆盖整个美国，并且其厚度是30个帝国大厦高。如果我们真的得到了这样一个库，进行逐一筛选也是没有意义的。那么如何快速筛选出活性成分，就成为组合化学家必须面对的问题。组合化学打破了传统合成化合物的模式，是用固相合成法合成许多化合物或者它们的混合物，先进行药理筛选，再证明活性化合物的结构，此法用于新药研究不仅快速、有效，而且节约人力、物力，因此，组合化学的产生被认为是合成领域的一次“工业革命”，世界上几乎所有的大制药公司和大学都开展了此项研究，并在短短的几年中，取得了许多令人瞩目的成就。根据这种趋势，有理由相信，组合化学必将成为下个世纪寻找新药的最主要的途径之一。反义技术反义核酸包括反义DNA、反义RNA和酶性核酸三种，它们可特异性地作用于靶基因或其相应的mRNA，从基因复制、转录、剪接、转运和翻译等各个环节上调控基因的表达，从而实现疾病的治疗。药物的研究与开发取决于两个重要的参数：首先是要确定疾病发展过程中的合适靶点；其次是发现能特异性识别并能结合于该靶点上的化合物，从而干预疾病的发展过程。以往使用的靶点绝大多数是蛋白质、酶和激素。反义核酸作为药物与常规药物相比有两个优点：①有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，设计、合成特异性的反义核酸比较容易；②反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特异和有效的结合，从而调节基因的表达。它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入又易于被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。为此人们采用药物化学的原理和方法，对天然寡核苷酸进行化学修饰，以达到治疗药物的要求。福米韦森(fomivirsen，Vitravene)1998年已由美国FDA批准上市，用于二线治疗艾滋病所致细胞病毒(CMV)视网膜炎，这是全球获准上市的第一个反义药物。随着福米韦森的上市，以及包括ribozym类的新一代反义药物进入临床，反义药物的研究与开发将会取得飞速的发展。高通量筛选技术高通量药物筛选(Highthroughputscreening，HTS)是使用机器人和自动化系统,从大量的样本中鉴别出对确定的分子靶标有相互作用的少量活性化合物的一种技术。被筛选出来的化合物可作为先导化合物,进一步研究开发成为新一代安全、有效的新型药物。药物高通量筛选分析技术是在长期药物研究经验的积累和科学技术的进步，如分子生物学、分子病理学、分子药理学、微电子技术等学科发展的基础上，形成的发现药物的新方法，每天可以对数千至数万样品的药物活性进行检测分析。分析对象除药理活性外，还涉及药代动力学性质、不良反应等。相当多的高通量筛选分析方法是以微孔板(如96孔板)为基础的，加上高度自动化的操作设备(细胞采集设备、样品转移、冲洗、孵育、离心等设备、信号检测及数据处理设备等)。具体方法因检测对象不同而不同，但都是建立在对检测对象分子或细胞水平的生物学机制有一定把握的基础之上。所使用的技术包括基于放射性的检测技术，基于荧光、发光或比色的检测技术，以及ＥＬＩＳＡ、报告基因、双杂交技术等自动化技术，不经过滤分离直接测定信号的“同质”技术，闪烁亲近测定法(scintillationproximityassay,SPA),以及报告基因技术等,是实现高通量筛选分析的重要手段之一。(一)高通量药物筛选的自动操作系统高通量药物筛选每天要对数千化合物样品进行检测，工作枯燥、步骤单一，人工操作容易疲劳、出错。自动化操作系统采用微孔板作为反应容器，具有固定的阵列(format);不同的微孔板通过条形码加以标记。自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作，并将操作结果及相关数据存贮在计算机内，使筛选结果准确，实验过程快速。自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。编程过程简洁明了，可操作性强。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组成部分，根据需要可配置加样、冲洗、温孵、离心等设备以进行相应的工作。除了实验步骤的需要以外，自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。目前主要有单孔、8孔、96孔、384孔等几种方式。单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。96孔、384孔在酶活性检测以及需同时开始、同时终止反应的筛选模型中是必需的。自动化操作系统的一个重要组成部分是堆栈(hotel)。所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。因此，高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。由此可见，高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈4个部分组成。研究者可根据主要筛选模型类型、筛选规模选购不同的部分整合成为一个完整的操作系统。（二）高通量药物筛选的检测系统快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。1．液闪计数放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(timeresolvedcoincidencecircuit)技术，有效地降低了背景信号的干扰，使测定灵敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析检测中，背景信号可控制在10cpm左右。闪烁亲近测定法(ＳＰＡ)是一种新的液闪分析法。该方法通过亲和结合，将放射配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可以以全自动化的方式进行，在更大程度上适应于高通量药物筛选。2.分光光度术为了适应高通量药物筛选，许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。以MolecularDevice公司的spectra190为例，它采用8条光导纤维同时对8孔进行测定。测定波长以2ｎｍ为间隔，可以在190ｎｍ～850ｎｍ间进行选择。对未知物质，可在该范围内进行扫描以确定其特征吸收光谱。因此，大大增加了建立模型的多样性。检测数据以不同文件格式输出，可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。方便、快速、准确、自动化程度高。分光光度术高灵敏仪器同自动化操作系统的连接，使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。3.化学发光检测化学发光指生色物质在酶促作用下,化学能以光子的形式释放出来。化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型和闪光型发光两种。辉光型化学发光如以ＡＭＰＰＤ、ＣＤＰＳ、ＥＣＬ、Diagoxigein等为基础的发光反应。其发光时间较长且稳定。而以发光蛋白、ＡＴＰ、荧光素酶等为底物的发光反应则是闪光型发光反应,其发光时间较短。由于时间分辨及偶合回路技术的使用,对于背景的去除更为有效，使得化学发光的检测灵敏度达到0.1pg数量级。在单孔多点喷射技术中，用于检测化学发光的光导纤维末端带有一喷头，用来加入反应性底物。反应性底物从100个小孔喷出，使反应性底物加入孔中后即可均匀混合。发光反应同时启动后，可立即进行测定，对于闪光性化学发光的测定更为有利。4.激发荧光检测新型激发荧光检测仪在传统仪器的基础上，用连续的激发光谱和测定光谱取代固定光谱。使模型的建立更具备灵活性。96孔板和384孔板的信号采集和处理模式使之适用于高通量药物筛选中。（三）高通量药物筛选的数据库管理系统高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选。与高通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担4个方面的功能。（1）样品库的管理功能：化合物样品库对进行高通量药物筛选的化合物样品的各种理化性质进行存储管理。对每一个新入库的化合物进行新颖性分析，排除结构雷同的化合物，避免不必要的筛选。由于高度反应性基团增加了假阳性出现的几率，样品库对新入库的化合物进行反应基团检测以去除这类化合物。（2）生物活性信息的管理功能：:生物活性库存贮每一化合物经过不同模型检测后的结果，并根据多个模型的检测结果对化合物的生物活性进行综合评价。（3）对高通量药物筛选的服务功能：高通量药物筛选的工作量大，自动化程度高，也涉及到许多繁琐的工作。高通量药物筛选数据库管理系统对与药物筛选相关的业务往来通讯、档案管理以及各种样品标签的打印进行管理，使高通量药物筛选的各个环节程序化、标准化。（4）药物设计与药物发现功能：高通量药物筛选产生大量的化合物结构信息，随着筛选的进行，生物活性信息也将大幅度提高。高通量药物筛选数据库管理系统通过对同一模型不同的呈现阳性反应的化合物结构进行分析，找出其构效关系，从而为药物设计提供参考。（四）高通量药物筛选的基本过程高通量药物筛选结果虽然多数情况下能够提供样品化合物作用机制的信息，但并不能完全证明它对某种疾病具有防治作用。因此，采用高通量药物筛选方法来发现药物一般采取以下几个步骤。1.初筛和复筛药物的初筛和复筛就是在分子、细胞水平上筛选样品，证明某一样品对该靶点具有药理活性(或亲和力)。初筛以后，选择具有活性的化合物，采用系列浓度，进行同一模型的复筛，阐明其对该靶点的作用特点、作用强度和量效关系，由此发现活性化合物(样品)。2．深入筛选深入筛选是在初筛和复筛的基础上，将得到的活性化合物在与初筛不同但相关的分子、细胞模型作进一步的筛选。其筛选内容包括：活性化合物的选择性、细胞毒性以及其它性质。经过深入筛选，可为比较全面地评价活性化合物的药用价值提供更充分的实验资料。根据这些资料并结合活性化合物的化学结构特点，进行综合分析，确定在结构和作用方面具有新颖性和开发价值的化合物(样品)作为先导化合物。同时，也可以结合组织器官或整体动物模型，证明其药理作用，为活性化合物提供更加充分的实验依据。获得先导化合物以后，根据实际情况进行结构优化(根据资料也可以直接作为药物候选化合物进行开发)，即进行化合物结构的改造，以便得到活性更高、缺点更少的活性物质。普通的结构优化手段是经过分子设计进行多种衍生物的合成。近年发展起来的组合化学技术为结构优化提供了强有力的手段。结构优化后的化合物需要重复筛选过程，以得到高效的新化合物。3．确证筛选确证筛选(confirmatoryscreening)是对深入筛选获得的先导化合物或优化后的被选定的活性最好的化合物进行更深入广泛的研究。其内容包括药理作用、药物代谢过程、一般毒性等多方面的筛选,以确定其开发前景。对符合药物要求的样品,确定为“药物候选化合物(candidatecompounds)”，进入开发研究程序，即临床前研究，为临床研究准备必要的资料。以上过程是对筛选靶点明确的筛选模型而言，在实际工作中，可以采取多种灵活的方式和方法，最终目的是为了高效地发现新药。综上所述，高通量筛选方法作为新药发现的手段具有明显的优势，它具有选择范围广、筛选成本较低、结果可靠等特点，是新药研究的重要技术。基因芯片技术生物芯片(BioChip)是用微加工技术(光刻、光化学合成、激光立体化刻蚀等)并结合分子生物学技术制成的具有一定生物学分析检测功能的微型器件。可用于完成生物样品的分离、制备、生化反应及产物的检测等一系列过程。基因芯片(GeneChip),又称ＤＮＡ芯片(DNAChip),是最重要的一种生物芯片。基因芯片上集成了成千上万的网络状密集排列的基因探针,能够在同一时间内分析大量的基因,迅速读取与生命相关的基因信息。它是受到在固相支持物上合成多肽的启发而发明的。美国Affymetrix公司总裁Fodor为主要的发明者之一。随着ＤＮＡ芯片技术不断完善,已经在基因诊断、基因表达、基因组研究、发现新基因及各种病原体的诊断等生物医学领域中显示出应用价值。基因芯片的研究和应用可以大大推进人类基因组计划和蛋白质组科学的研究。通过比较不同个体或物种之间以及同一个体在不同生长发育阶段，正常和疾病状态下基因表达的差异，寻找和发现新的基因，研究基因的功能以及生物体在进化、发育、遗传等过程中的规律。基因芯片可为探索不同层次多基因协同作用的生命过程提供手段，将在研究人类重大疾病如癌症、心血管病等相关基因及作用机理方面发挥巨大的作用。一些著名的医药公司已将基因芯片技术用于新药筛选。以期从天然产物和合成物中筛选基因相关药物。(一)基因芯片用于药靶的研究据推测,人类约有3万种疾病,许多疾病由遗传因素引起。一些慢性疾病如高血压、Ⅱ型糖尿病等为多种基因相关疾病,每种这类疾病可能涉及5～10个基因。这些疾病相关基因都有可能成为药靶(药物作用靶点)。每一基因产物及与其发生作用的蛋白质也有可能成为药靶。利用基因芯片可以比较正常组织(细胞)及病变组织(细胞)中大量(可达数千)相关基因表达的变化,从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶,这种方法尤其适于病因复杂或尚未定论的情况。ＤＮＡ芯片技术可直接检测ｍＲＮＡ的种类及丰度,所以它是研究基因表达的有力工具。用于检测基因表达水平的ＤＮＡ芯片已研究完成。ＤＮＡ芯片中包含了几万种人工合成的寡核苷酸探针。可对几个数量级细胞到单个细胞几个拷贝数的转录产物进行检测,而且是定量研究。基因功能克隆是利用基因的表达产物如蛋白质、ＲＮＡ等达到搜寻和克隆相关基因的方法。目前常用差异表达法或消减杂交法：依靠两种基因组(如肿瘤组织与正常组织)在ＤＮＡ(如缺失)或ｍＲＮＡ表达上的不同,通过进行ＤＮＡ片段或ｃＤＮＡ的杂交来筛选确定与疾病有关的基因。将已知的ｃＤＮＡ或其探针按一定方法在硅片或玻璃上列阵排布,用两种荧光进行待检测组与对照组的ｃＤＮＡ或其ＥＳＴ(表达序列标记,expressedsequencetag)探针的标记。两种材料一起与芯片杂交后,每一种单独表达的基因位点就会显示单独的颜色,而两种基因组同时表达的基因位点则显示其混合色,通过颜色在亮度上的差别还可鉴定每一种基因表达的相对丰度。Affymetrix公司应用此方法成功地检测到了Ｔ细胞激活后基因的表达。他们的研究表明,对每一个基因只需要20个左右的探针对即可对其表达进行准确分析。而通常一块芯片可以进行10,000个以上基因的检测。有人在载玻片上固定排布了ｃＤＮＡ的微列阵(microarray),用以比较肿瘤细胞与正常细胞在基因表达图式上的差别,并准确地检测到了与肿瘤发生相关的下调和上调表达的基因,由此可以确定与肿瘤发生相关的基因。这些基因序列可能成为治疗和诊断的药物作用靶。分子生物学将会提供丰富多彩的分子靶,以致超出制药公司应用开发的能力。因此选择确定新颖的药靶是当前新药研究的首要任务和目标。运用基因芯片可以有效地发现与疾病相关的基因,寻找新药靶。如临床虽有多种抗结核药物,但由于结核分枝杆菌的抗药性越来越严重,全球每年有700万的新结核病例产生,开发新的抗结核菌药成为当务之急。目前,结核分支杆菌的整套基因组已被探明,Wilson首次将分子生物学基因组的方法应用于新药的开发,并用ｃＤＮＡ芯片用于检测抗结核药物异烟肼作用后基因表达的变化。他们发现异烟肼作用后,所诱导基因表达的蛋白质与药物作用模型有关,此基因包括五个编码脂肪酸Ⅱ型合成酶及fbpc的操纵子。另外,还有几个不影响生物合成途径的基因,这些基因可能与药物的副作用有关。通过此方法可以确定新的药物靶点。炎症是一类由于受伤部位毛细血管扩胀、血流量的减少和白细胞积聚所致的疾病,是机体对受伤的一种反应。与炎症相关的基因很多,如ＣＯＸ,ＮＯＳ等。迄今为止已开发出各类抗炎药物,筛选模型也多种多样。Scott等使用含有10,000个基因的芯片,检测了在炎症情况下ＴＨＰ1(一种单细胞系)分别由ＰＭＡ(Phorbol12-myristate13-acetate)和脂多糖作用后的基因表达情况。他发现其中有几个ＥＳＴｓ明显上调,而这几个基因以前并无报道,且其功能也未知。这几个基因与炎症有关,有可能成为一个新的药靶。肿瘤细胞在发生、发展过程中基因的表达调控有一个复杂变化的表达模式。ＤＮＡ芯片为研究肿瘤发生发展中的基因开关及表达程度提供了强有力的工具。利用它可随时获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式。黑色素瘤细胞系UACC903的裸鼠致瘤性及生长特性能被引入人类正常6号染色体而趋于正常。用含有1161个基因片段的芯片与来源于UACC903的ｃＤＮＡ探针(标记绿色荧光素)及来源于UACC903(+6)的ｃＤＮＡ探针(标记红色荧光素)杂交,杂交谱中绿色荧光斑点显示是UACC903优势表达基因,红色荧光斑点是UACC903(+6)优势表达基因。黄色或棕色则代表两细胞系共表达的基因。这样两种细胞系的基因表达性情况可被杂交谱直接表现出来。在包含有870个特异基因中,正常细胞系与黑色素细胞系相比,1.7%下调,7.3%上调。并且用ＤＮＡ芯片的结果与Northern杂交结果是一致的,说明了这种方法的可靠性。这些能改变自身表达并能使肿瘤抑制的基因可作为治疗靶。(二)ＤＮＡ芯片用于新药筛选对已确定的药靶基因进行标记分析,以便于采用ＤＮＡ芯片技术分析药物作用后的基因表达变化。ＤＮＡ芯片技术可直接检测ｍＲＮＡ的种类及数量。早在1995年,Schena等就报道了用双荧光杂交显色法,利用cDNA微芯片检测基因差异表达。1998年在美国举行的题为“基因组与药物开发”的会议上,提出了发展快速检测不同基因表达和检测与疾病相关基因的方法。近年微芯片技术得到越来越多的应用,有大量文献报道ＤＮＡ芯片用于检测酵母和人体细胞的基因表达。用基因芯片筛选抗炎、抗肿瘤的药物的报道也相继出现。1997年Heller等首次使用96cDNA的微矩阵检测炎症条件下基因的表达情况,该芯片包括文献报道部分与炎症有关的基因。在此炎症模型中,细胞因子和化学因子都上调,这与预期的一样。通过培养关节炎病人软骨细胞和滑膜细胞,发现在ＴＮＦ和IL-1的刺激下有相似的表达图谱,从而可以建立以细胞培养为基础的人类炎症的模型。通过比较关节炎和肠炎的表达结果发现这两种疾病的本质一样,只是抑制水平有区别。对在抗炎药物作用下表达情况的检测,发现氟轻松(fluocinolone)、地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)、氢化可的松(hydrocortisone)作用极其相似。实验结果的重现性很好。而且,在临床上对几个关节炎病人的作用结果相似,说明了该方法的可靠性。周期蛋白依赖性激酶2(Cyclindependentkinase2,CDK2)可与周期蛋白Ｅ结合成复合物,并与ＲＢ蛋白结合(肿瘤抑制基因Ｒｂ产物)或一个与RB相关蛋白ｐ107及转录因子F2F结合成复合物,通过作用于增殖有关的基因转录,在细胞增殖周期Ｓ期启动中发挥作用。在癌细胞中CDKs通常活性高或该酶抑制剂比正常细胞下调,这说明CDKs是一个抑癌药物的作用靶点。Gray等从化学库中筛选得到的嘌呤类似物抑制周期蛋白依赖的激酶2,用高密度微芯片(含整套酵母基因)检测发现,其中Flavopiridol与另两种2,6,9三取代化合物能使将近一半的基因表达受影响,其中2%～3%的细胞循环、代谢、表达产物增加2倍之多。令人感兴趣的是当两种化合物作用时,基因表达结果是不同的,即两种化合物作用机制不同,作用的靶基也不同。另外,通过使无关基因灭活的方法,如:缺失、活性位点置换等,可以使得待测药品与对照品之间的区别更易于观察。为了找到最合适的药物,Gray等人还比较了正常酵母细胞在药物作用下的表达图谱与cdc28p激酶(与ＣＤＫ2同源)突变的细胞的区别,他们希望两者基本相同,但事实上,只有极少数基因在两种情况都改变,但这也说明选择合适的药靶是一个基本问题。药物筛选要求平行、快速,生物芯片这种高通量、多参数而又近乎实时的筛选方式无疑具有巨大的优越性。对于以将化合物处理细胞后一群特定基因表达变化为靶标的筛选方式,使用ｃＤＮＡ芯片自然是较为合适的。cDNA芯片尚可用于反义寡核苷酸类药物的筛选。基因芯片可提供一个高通量的药物筛选方法,怎样进行数据处理是科学家所面临的一个问题。计算机软件及数据库的开发显得尤为重要。在研究当中,Scott等提出建立完整的微芯片数据库的重要性,他们建议将已知毒物与所有的ＦＤＡ药物建立基因表达的数据库。人类基因组多样性的数据库将在Internet上发布。其目的就是使鉴定人类自身基因组的变化更加快速容易。如:用ＳＮＰｓ为分析工具,检测某些遗传病及药物的异常反应更加容易。并使ＳＮＰｓ可作为标记物检测人体30多亿碱基中单个碱基的变化。当小分子作用于细胞时会激发特异的基因表达,由于临床诊断费用昂贵,微芯片能提供一个相对比较便宜的药物筛选方法。用芯片进行表达产物的检测与其他用途相比有两个优点:①信息量丰富,含10,000个人特异的cDNA序列的芯片含有全部人类基因组的表达信息,而同样的用于测序的芯片只能测25,000bp,相当于人类基因组的百万分之八。②数据直接与功能相联系,稳定的转录水平提供了一个敏感、全面、可读的细胞或组织样本的生理状况。当生理状况变化时则基因表达产物变化,因此生物芯片提供了一个研究生物学进程内部机制的方法。分子生物学家预测,21世纪的药物是为每个人设计的。因为随着基因芯片技术的普及和基因科学研究的深入,人们将会发现每个人对药物敏感的基因、耐药基因以及各种抗病基因等表达各不相同,为达到最佳疗效,药学家的任务之一是开发更具个体特异性的药物。以单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)为标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。在人类基因组中大约1,000个碱基SNPs出现一次。因此可作为基因特异性的标记。若能将所有SNPs全部信息装入ＤＮＡ芯片则可检测到与之关联的基因间的差异。美国麻省的Whitehead研究所已确定了450个ＳＮＰｓ。据该机构的负责人Lander宣称,如果他们得到2,000个这种ＳＮＰｓ标志,就可以制造“基因组扫描仪”(genomicscanner),即将所有ＳＮＰｓ收入单个ＤＮＡ芯片,用来扫描各个个体基因组成上的差异。目前,ＰＣＲ技术,尤其是ＲＴ-ＰＣＲ技术飞速发展,如DD-PCC,SSH等技术相继出现,辅以微芯片检测技术,将会使新药研究进入一个新阶段。生物工程技术生物工程亦称生物技术或生物工艺学，是利用生物学及工程学原理为人类制造有用产品及提供服务的技术。其发展可分3个阶段：上古时期，用非纯种微生物自然发酵工艺称为原始生物工程，本世纪40年代以纯种微生物发酵工艺称为近代生物工程，而本世纪70年代以基因工程为标志的生物工艺称为现代生物工程。今时三者共存构成复杂的生物工程体系，为世人提供众多治病药物及服务，改善了人类生存条件，促进了人类社会繁荣昌盛。在精密控制条件下，根据生物学及工程学原理创制新药的技术谓之现代医药生物工程，其内容有基因工程、微生物工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程及生物反应工程等。理论上任何有机物皆可由现代生物工程制造，足见现代生物工程在产业革命中拥有巨大潜力及发展前景。（一）基因工程基因工程是在分子水平上定向改造生物遗传性的技术。其主要特点是打破生物种间界限，克服远缘杂交不亲和性，获得特异功能细胞，生产名贵药品。其主要环节是制备目的基因、基因重组、重组基因转移、基因工程细胞筛选、鉴定、培养、表达及产物纯化等。据统计，美国1987年颁布的2096项基因工程专利中有1992项为医药产品专利，占96％。迄今已有数十种名贵药品问市，如人胰岛素、人生长激素、人促红细胞生成素(EPO)、人尿激酶(UK)、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、乙肝疫苗、干扰素(IFN)、IL-2，3，6及60多种单克隆抗体(McAb)等。其中EPO对肾性贫血、化疗及其它贫血均有良好疗效，誉为“药品皇冠之明珠”，有极好发展前景，美国1990年销售额达4亿美元。近年来由于高表达昆虫宿主之应用，α及β-IFN、IL-2，3、乙肝疫苗、艾滋病毒抗原基因及肿瘤坏死因子基因在昆虫体内均获得高表达，其中α-IFN基因在家蚕体内表达浓度为107U／ml，2～3条家蚕表达之产物相当于4.5L人血液或1L基因工程菌发酵液之产物；此外，人α-心房肽(α-hANP)基因在酵母细胞中得到充分表达，且有95％产物分泌至细胞外，α-hANP是有希望成为充血性心力衰竭和高血压等疾病最佳治疗药物之一。上述成果表明真核生物之间基因转移技术亦获得重大进展。此外，遗传性疾病、恶性肿瘤、艾滋病及糖尿病的发生与发展，皆与基因突变及其异常表达有关，迄今尚无有效治疗手段。基因工程的诞生为根治上述疾病奠定了理论与技术基础，有可能用正常基因补充缺失基因，取代异常基因或调节基因表达功能，并有可能产生一系列基因药物，导致药物治疗产生重大变革，推动医学领域产生第三次革命。（二）细胞工程定向改变细胞遗传性，创造特异功能细胞，用于生产名贵药品及提供服务的技术称为细胞工程。其主要内容有细胞融合，细胞大规模培养、细胞生物反应器及细胞反应工程等，并涉及动植物及微生物细胞，后者已形成规模性产业，生产抗生素、维生素、氨基酸及核酸类药品。细胞大规模培养系指人工控制条件下，高密度大量培养细胞的技术。动物细胞具有群体效应及功能全能性，除肿瘤细胞及传代细胞外，尚有锚地依赖性及接触抑制性；细胞生长缓慢，需氧量较微生物低，不耐受强烈搅拌和高速通风，培养基成分复杂，需要小牛血清，为产品分离纯化造成困难，目前已研制出无血清培养基。细胞培养方式有悬浮法及固定化法两种类型，有多种反应器可供选用。悬浮法多用气升式反应器。固定化培养法有转瓶或平板式培养器。目前动物细胞生产的tPA、UK、IL-2、EPO、IFN及100多种单克隆抗体等昂贵药品均已商品化，另有多种激素、酶及疫苗等亦取得重大研究进展。细胞融合是将两个不同种属细胞合并成表达二亲本性状杂种细胞的技术，包括植物及微生物原生质体融合及杂交瘤技术，后者已十分成熟，并已研制出5万多种杂交瘤细胞，其基本过程是使骨髓瘤细胞与免疫淋巴细胞融合，经培养、分离及筛选获得针对单一抗原决定族的克隆系，以生产单克隆抗体，目前已有100多种单克隆抗体用于诊断及治疗各种癌症及传染病。植物细胞培养具有结构和功能全能性及群体效应，培养过程生长缓慢，细胞易于成团，不耐受强烈搅拌与通风，产物往往滞留细胞内，可通过融合及诱变获得有益性状细胞生产名贵药品。细胞培养方式亦分为悬浮培养及固定化培养两类。悬浮培养法多采用气升式连续培养罐，固定化培养多用纤维素细胞固着法填充床式反应器。植物细胞培养已获得众多研究成果，如烟草、黄连、熏衣草、紫草、人参、洋地黄、长春花、海巴戟及红花等细胞培养，已分别获得CoQ10、小檗碱、生物素、紫草素、人参皂甙、地高辛、蛇根碱、阿玛碱、蒽醌及α-维生素E等重要药物，其它尚有利血平、异喹啉碱及哈尔满碱等。其中烟草细胞连续培养规模为20m3，人参细胞为2m3，紫草细胞为750L，紫草素已商品化。此外，秋海棠与黄连两种细胞原生质体融合后杂种细胞既产生花色素，亦产生黄连素，同时植物细胞培养时有时能获得其外植体不产生的药用成分，如芸香及穿心莲细胞培养时，可分别获得芸香培素及倍半帖内酯。此外植物细胞尚具有催化有机物产生酯化、皂化、水解、羟化、异构化、甲基化、去甲基化、羧基化、双键还原、缩合及氧化等化学反应，如希腊毛地黄细胞可将β－甲基毛地黄毒甙转化为β－甲基地高辛，已实现4m3中试生产规模，而胡萝卜细胞可使毛地黄毒配基及菱毒配基分别转化为杠柳配质及5－羟菱毒配质。由此可知，在现代医药生物工程中，植物细胞培养技术应用范围十分广泛，且不受气候及地理环境影响，前景诱人。（三）酶工程酶或细胞经适当加工处理后用于药品生产与疾病治疗技术称为酶工程，为当今竞争最为激烈的高新技术领域之一。目前酶或细胞固定化、生物传感器及酶反应器为其核心内容。固定化系指通过物理或化学方法将酶或细胞限制或定位于特定空间范围内的技术，以期反复使用。其方法有吸附、包埋、分子交联、共价结合及热处理等，所用载体或基质有硅胶、活性炭、氧化铝、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、卡拉胶、聚氨酯、纤维素酯、离子交换剂、琼酯糖、海藻胶、纤维蛋白及胶原蛋白等。用于酶转化反应的核心设备称为酶反应器，目前主要有搅拌罐、填充床及介于二者之间的流化床式3类，其规格型号很多，可根据生物催化剂性能及形状、底物及产物理化性质、转化方式及反应条件选择适当反应器。此外，将酶或细胞作为分子识别元件与相应电子器件构成的设备称为生物传感器，用于控制发酵及生物转化过程，或用于检测体液中某些物质的变化以判断相关疾病发生与发展进程。酶工程诞生仅20余年，但已有polyⅠ：C、ATP、FDP、L-Met、L-Phe、L-Trp、L-ASP、L-Ala，L-苹果酸、γ-氨基丁酸、短杆菌肽及葡萄糖酸等重要药物实现工业化生产，其它尚有6-APA、7-ACA、苯乙酰甲醇及间羟苯乙酰甲醇等制药工业原料。同时该技术已延伸至细胞工程领域，近年来动植物细胞固定化培养已生产出多种名贵药物。如人胰岛素，IL-2、CoQ10、生物素、紫草素、小檗碱、可待因、甙类、生物碱及McAb，且细胞固定化后产物量较悬浮培养为高，如固定化长春甙花细胞阿玛碱产率较悬浮细胞高40％，罂粟细胞固定化后可待因产率较悬浮细胞培养高10％，足见酶工程技术在医药工业中拥有巨大潜力。其次有人将脲酶固定化后用于血液体外循环，将血中尿素分解为氨，经吸附剂除氨以解毒，此称为第一代人工肾；亦有将脲酶、谷氨酸脱氢酶、转氨酶及NAD+共固定化，用于完成尿素体外循环，称为第二代人工肾；亦有人考虑用固定化天冬酰胺酶进行体外血液循环治疗白血病。此外固定化生物催化剂体内应用的研究亦取得重要进展，如固定化胰岛细胞植入患糖尿病大鼠体内，即释放出胰岛素并可调节血糖正常代谢水平，且不产生排异反应。近年来亦有人将多种McAb同时吸附于一种载体上，制备预防多种疾病的疫苗已取得重要进展。由此可知，酶工程技术在临床上亦有极其广泛应用前景。（四）蛋白质工程采用物理化学或生物学方法制造非天然蛋白质类药物及制药工业用工具酶的技术称为蛋白质工程。其内容主要有蛋白质分子主链切割、连接、分子内及分子间再组合、主链的部分或全部人工设计、合成与组装及侧链修饰，或者人工定向设计非天然基因及基因定点突变技术制造特定基因，通过宿主细胞表达制造非天然蛋白质及酶类新药或制药用工具酶，后者亦称为第二代基因工程。蛋白质工程研究目的在于克服天然蛋白质和酶类药物的热不稳定性、高免疫原性及其它缺陷，以获得高效治疗药物及高效率制药工具酶，推动医药工业发展。蛋白质工程虽处于初期发展阶段，但因其在医药工业中具有无可估量的发展前景，故美、日及西欧诸国均已投入巨资，建立数十个专门研究机构，已有许多重要研究成果获得成功。如日本人用微生物发酵获得的胆红素氧化酶经PEG修饰后，活性大为提高，正准备开发，用于治疗新生儿黄胆及肝炎；此外，经苯乙烯及马来酸酐共聚物修饰的SOD可优先在炎症部位累积，提高了抗炎效果。目前，还趋向于采用两种药物进行相互修饰研究，以期获得双重及多重性药效的药物。如美国Genetech公司将γ-IFN及β-FEN基因重组后，经宿主表达的杂种蛋白质γ-IFN—β-FEN在低剂量时，抗肿瘤作用大于两种因子混合物。又如牛血清白蛋白、禽丙种球蛋白及促黄体激素释放素分别与维生素B12共价结合的产物经小鼠口服后，发现产物通过维生素B12天然吸收机制自肠道转移至循环系统，并保持原蛋白质的生物活性及免疫原性。干扰素在-70℃短时间保存即失去活性，用DNA重组技术将其分子中两个半胱氨酸用丝氨酸取代，则产物在低温下保存半年仍不失活。制药工业中应用的T4溶菌酶67℃处理3h，其活力可丧失99．8％，通过DNA重组技术用Cys取代其N-端第3位ILe，所获得的非天然溶菌酶于67℃处理3h活力不减退。α1-抗胰蛋白酶第358位Met残基易被自由氧化，通过DNA重组技术用Val取代其Met，获得了活性稳定的非天然药用酶，乃保持治疗肺气肿的疗效。另外有人将IFN与相应McAb偶联，注射后由McAb导向靶器官，使病变部位IFN浓度增大，既达到治疗作用又降低了毒性。美国Cetus公司用蓖麻蛋白与相应McAb结合物对20名乳癌患者实施导向疗法，已取得一定疗效。由此可知，尽管蛋白质工程乃处于初期孕育阶段，但因具有极高理论价值及无限灿烂应用前景，故世界各国不惜投入巨资，竞相研究与开发。总之，现代医药生物工程为生产及创制新药开辟了新途径，对传统医药工业既构成严重挑战，亦为其技术的更新换代提供了良机。六、基因转移技术基因转移系指将外源基因导入某种细胞或组织，并使其得以表达。它不仅是研究特定基因结构、功能及表达调控的重要手段，而且也是基因治疗的关键。基因转移除了确定特异的靶基因和适当的靶细胞(组织)外，选择有效的基因转移方法或基因运载系统(genedeliverysystem)是至关重要的。理想的基因转移方法应该是安全、高效、特异、稳定、简便，并具有可控性。现有的基因转移方法虽然很多，它们各有优缺点，但均不够理想，因此，发展更好的基因转移方法是当前基因治疗研究的重要课题。目前，基因转移方法可大体分为非病毒介导和病毒介导两大类。前者包括物理法、化学法、受体介导法等，后者有逆转录病毒、腺病毒、腺病毒辅助病毒、其它病毒等。近年来，将上述两类方法结合起来，又发展了病毒－受体介导、病毒－脂质体介导等新方法。（一）非病毒介导的基因转移1.脂质体介导的基因转移非病毒的基因转移主要依据细胞对外源大分子摄取和细胞内转运的正常机制。人工阳离子脂质体(cationicliposome)是其中最常用的方法之一，这类脂质体由表面带正电荷的双层脂质分子组成，它与带负电荷的DNA、RNA或反义寡聚核苷酸等多阴离子物质(polyanions)自发而迅速结合形成复合体，通过细胞膜融合或受体介导的胞饮作用(endocytosis)将外源核酸转移入细胞。在胞浆中释放的质粒DNA转移入核内，一般以非整合方式(unintegratedform)存在。多种阳离子脂质体可用于基因转移，包括心血管的基因转移，例如：DOTM／DOPE(1ipofectin)、DC－胆固醇、DOSPA／DOPE(lipofectamine)，以及DMRIE／DOPE等。中性或阴离子脂质体的基因转运效率均低于阳性脂质体。在大鼠、兔、狗、猪等动物中进行整体情况下脂质体介导的重组基因转移均有报道。例如，血管和心肌内注射脂质体-基因复合物，可以转染内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞，表达出相应的蛋白质，并可持续2周至一个月。脂质体介导的基因转移方法的优点是简便、可以携带较大的DNA分子、比较安全、能转染的细胞类型也较多，而且靶细胞不需要处于分裂状态(增殖细胞的感染率较高)。主要缺点是转染效率均较低，一般小于1％，缺乏细胞选择性；静脉注射时易被网状内皮系统吞噬，不能有效地到达靶组织，进入细胞后，易被溶酶体中核酸酶降解等，此外，脂质体本身亦不稳定。这些因素限制了脂质体的应用。为此，应加强脂质体稳定性、靶向性和提高其转染效率。例如，降低脂质体的pH可以抑制溶酶体的降解作用；应用抗原／抗体或配体／受体的特异性结合反应，制备带有“归巢装置”的脂质体，可以提高细胞的靶向性。2．受体介导的基因转移细胞表面受体与特异性配基结合后，发生内化(internalization)或胞饮，使配基转移入细胞。因此，将外源DNA与配基结合，形成配基-DNA复合体，通过与相应受体结合，也可以达到向细胞转移基因的目的。例如，大多数细胞膜上有转铁蛋白(transferrin)受体和膜凝集素(membranelectin)，前者可与转铁蛋白结合；后者可以识别糖分子，与不同类型的糖或糖蛋白结合。由此，利用转铁蛋白或糖蛋白可以作为基因的携带体，进行基因转移。一般用多聚赖氨酸(polylysine)作为配基与DNA的交联剂。最近，有人应用糖化的组蛋白代替一般的糖蛋白作为基因载体，可以获得更高的转基因效率。这可能与组蛋白是一种内源性的核DNA结合蛋白，能携带基因向核内转移有关。受体介导的基因转移方法比较简便、安全，有些配基还有一定的细胞靶向性或其本身就有一定的治疗作用。但持续时间较短。现已证明，内皮素(endothelin)受体有A、B两种亚型，它们在血管内皮细胞和平滑肌细胞上具有选择性分布。A型受体主要分布于平滑肌细胞，其特异性阻断剂为一种环五肽－BQl23；B型受体主要分布于内皮细胞，其特异性类似物是一种16肽的BQ2030。汤健等分别构建了BQl23和BQ2030-多聚赖氨酸-LacZ质粒DNA的复合载体，应用这些复合体转染培养的内皮细胞和平滑肌细胞，发现前者可以转染平滑肌细胞，后者则可转染内皮细胞，具有高度的靶向性，其转染效率可分别高达60％。应用动脉内带孔球囊导管注射上述复合体，亦具有同样效应。但是，这种方法不能将外源基因整合于宿主细胞染色体，因此只适用于短时间表达的基因转移。3．基因直接注射法裸露DNA(nakedDNA)载体是近年来发展起来的一种新型非病毒载体，正用于基因疫苗和基因治疗的研究。实验证明，将DNA或重组质粒直接注射或埋置于骨骼肌、心肌或血管，也可将外源基因转移至局部组织，并表达出相应蛋白质。据报道，有时一次注射可以维持3－6个月，其机理不十分清楚。应用球囊导管亦可向局部血管壁组织直接转移DNA。这种方法安全、简便，且可选择特定的靶组织，但其转移效率太低，一般小于0.1％，难以达到治疗的目的。朱小君等在此基础上，发展了一种基因缝线的转基因方法。即将质粒-DNA载体结合在手术用缝线上，再将其缝合于肌肉，血管或心肌组织，均可达到转移基因和长效表达的目的。其表达效率可较直接注射法高8－10倍，表达时间可持续2个月以上。应用携带有Pro－UK(尿激酶原)基因的缝线，缝合细小动脉，可以有效防止血管内凝血和管腔阻塞。直接注射DNA转移基因效率可能与转移组织的状态有关。例如，给再生肌肉(re-generatingmuscle)注射DNA，可较正常肌肉组织转基因效率提高80倍，原因不明。非病毒介导的基因转移还有磷酸钙沉淀、电穿孔、基因枪等方法。但这些方法多难以在体内实现基因转移。Riessen等建立了一种水凝胶涂盖DNA于血管成型球囊(Hydrogelcoatedangioplastyballon)的转基因方法，即在球囊外涂盖一层水疑胶状多聚体，它可吸附DNA，插入动脉内，其中的DNA即可浸透入血管壁。应用lacZ和萤光素酶(1uciferase)基因作为标记基因，通过这种方法进行动脉壁基因转移，在所试验的37只家兔中全部实现了基因转移，其基因表达时间可持续14天以上。Simons等采用这种方法在动脉壁转移反义myb和反义PCNA寡聚核苷酸，证明可以成功地抑制球囊损伤后的血管平滑肌细胞增殖。（二）病毒介导的基因转移多种病毒对哺乳类动物细胞具有很强的感染能力，并在宿主细胞内复制和表达。因此，可以选择一些对人体无害的病毒，对其进行基因改造、重组进外源基因，构成病毒载体，实现基因转移。目前常用的病毒载体主要有以下几种。1.逆转录病毒载体(retroviralvector)逆转录病毒是一类RNA病毒。构建逆转录病毒载体时，保留病毒内的LTR(长末端重复序列)和包装信号，切去病毒蛋白的编码结构，插入外源启动子和目的基因。但由于这种载体不含病毒包装蛋白，因而不能形成病毒颗粒，故无转染性。包装细胞内含有编码该蛋白的核酸序列，可以表达包装蛋白。由此，逆转录病毒载体只有转染包装细胞后才能形成病毒颗粒，再行感染靶细胞，发挥转移基因的作用。九十年代初，应用逆转录病毒载体首次成功地治疗了先天性缺失腺苷脱氨酶(ADA)引起的严重免疫缺陷综合征患者。目前美国获准进行临床试验的基因治疗研究课题，相当一部分均采用逆转录病毒载体。这类载体由于不包含病毒蛋白的核酸序列，不能自身合成病毒蛋白，故不具致病性。这类病毒载体可以转染的细胞范围广，例如骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、心血管细胞等；它在体外转染细胞的能力较强，培养细胞的转染率有时可达80％；它可以整合至宿主细胞染色体中，进行复制和转录，因此其转基因效果比较稳定，表达持续时间较长，对遗传性疾病的基因治疗尤为适用。逆转录病毒载体也有一些缺点：它的容量较小，所能携带的外源基因片段较短，一般不超过2.5kb、它在包装细胞中产生的病毒滴度较低，一般不超过lO6，难以满足基因治疗时对大量逆转录病毒载体的需求；它只能转染和整合分裂状态的细胞，而对于体内大量的非分裂的成熟细胞却缺乏转基因能力。例如，在正常整体情况下，通过逆转录病毒载体，只有2％的心血管细胞获得转基因效果。最为重要的是，逆转录病毒载体在染色体上的整合是随机的，这有可能造成插入突变，干扰和影响细胞中某些正常基因的复制和转录(例如抑癌基因)，甚至激活一些癌基因表达，产生严重后果，因而具有潜在的危险性。由于上述这些缺点，逆转录病毒载体的应用受到一定限制。逆转录病毒载体已经应用于心血管系统的基因转移，虽然在体外的转染效率较高，但在整体动脉内的转染效率却很低。因此，目前逆转录病毒载体比较适用于exvivo实验，即先用逆转录病毒载体将外源基因转移至培养的靶细胞，而再将这些经基因修饰的细胞输回体内，达到基因治疗目的。世界上第一例心血管病(遗传性高胆固醇血症)基因治疗成功的病例就是如此进行的。此外，某些血管平滑肌细胞异常增殖的疾病，如血管成形术(PTCA)后的再狭窄，亦可应用逆转录病毒载体进行基因治疗。董薇等利用逆转录病毒载体携带P53抑癌基因和HSV-TK(胸苷激酶)基因，进行局部血管转移，发现可以明显抑制内皮损伤导致的血管平滑肌细胞过度增殖和血管再狭窄。为了克服逆转录病毒载体的低滴度、低转染率等缺点，近年来致力于对该载体进行改造。例如，将VSV病毒G蛋白基因重组于逆转录病毒载体，使其掺入到病毒包膜中。这种“假型载体”(Pseudotypevector)病毒可以得到很高的滴度。2．腺病毒载体(adenoviralvector)腺病毒是一类双链DNA病毒，基因全长约36Kb，包括早期转录单位(El～E4)和晚期转录单位(L1～L5)。常用的腺病毒载体是Adv(5)，其中E1或E3区缺失，可以插入外源性基因。腺病毒载体因为缺失El或E3区，自身不能表达病毒的包装蛋白，只有通过293细胞或HeLa细胞(含有El／E3区)，才能形成腺病毒颗粒，从而感染靶细胞。腺病毒载体的主要优点有:①容量大。携带较大片段的外源基因，可以超过7.5kb；②滴度高。腺病毒载体转染包装细胞产生高滴度病毒，可达1011pfu／ml，较逆转录病毒载体约高5个数量级。③适应广。腺病毒载体既可转染增殖细胞，也可转染非增殖细胞。对体内几乎所有细胞，包括神经细胞、心血管细胞、肝细胞、系膜细胞，以及多种肿瘤细胞都有转染能力。④安全性好。一般来说，腺病毒不能整合到宿主细胞染色体中，因此其潜在危险性小。基于以上原因，腺病毒载体已被广泛应用于转基因和基因治疗研究。腺病毒载体也有一些缺点，主要表现是：①腺病毒载体不能整合于宿主细胞染色体，因此不能在细胞中长期稳定表达，体内应用时一般只持续2～4周，故只适用于一些瞬时转基因的疾病治疗；②腺病毒载体转染宿主细胞后，可以产生免疫反应(包括细胞免疫和体液免疫)。限制其重复应用和转染效率；③腺病毒载体是通过细胞膜表面糖蛋白受体介导途径而转基因的，但多种细胞表面均有这种受体，因此转基因作用缺乏细胞特异性；④应用高滴度腺病毒载体，可以引起间质性炎症或细胞病理改变，但较罕见。由于腺病毒具有高度转染性，有人应用腺病毒与多聚赖氨酸结合，携带外源基因进行基因转移；亦可将转铁蛋白(或抗体)、腺病毒、多聚赖氨酸结合，再与外源基因构成一种复合体，而不必将外源基因重组到腺病毒载体。用此种方式，对心肌细胞的转染效率可达100％。近年提出，腺病毒载体的瞬时表达不仅是由于其不能整合至染色体，而且与载体蛋白，尤其是晚期表达蛋白的免疫原性太强有关。因此对腺病毒载体进行改造，抑制晚期蛋白表达，可以降低免疫原性，提高转基因效率。3．腺病毒辅助病毒载体(adeno-associatedviralvector)腺病毒辅助病毒(AAV)是一种缺陷型单链DNA微小病毒(provirus)，长约4.7kb，两端为末端重复序列，148bp，与病毒的整合、包装、复制和转录功能有关。中间为Rep和Cap蛋白的开放阅读框架。Cap蛋白主要构成病毒包装蛋白，Rep蛋白与病毒复制有关。AAV感染细胞后可以定位整合于宿主细胞第19号染色体(19q13.3)，但必须要有辅助病毒(腺病毒)的协助才能复制产生AAV颗粒。腺病毒是AAV最典型的辅助病毒，它可以提供AAV复制和转染所必须的成分。AAV载体由“构建”和“辅助”两部分组成。前者主要含有AAV中的末端重复序列，但去除Rep和Cap蛋白的编码结构，而置换成插入的外源基因，这种载体虽可整合，但不能转录和形成病毒颗粒。辅助质粒(helperplasmid)主要含有Rep和Cap编码结构，而无LTR序列，它可以合成和提供AAV转录和包装的蛋白质。这两种质粒共转染至细胞中，只能将外源基因整合于宿主细胞染色体上，但不能复制和形成病毒颗粒，必须有腺病毒的参与。常用的腺病毒是El和／或E3缺陷型Adv(5)，它无致病性，但因缺乏E1和／或E3，所以必须通过包装细胞(293细胞或HeLa细胞)，补充El和E3，才能形成具有转染和复制能力、携带外源基因有AAV病毒颗粒。AAV的包装能力可达109fpu／ml。以往AAV病毒的产生需要整合／辅助质粒和腺病毒的两次转染，现可应用多聚赖氨酸将整合和辅助质粒相连接，又通过Adv(5)单克隆抗体与缺陷型的Adv连接，构成Adv-多聚赖氨酸-整合／辅助AAV质粒的复合体，一次转染包装细胞，不仅发挥了AAV的作用，而且利用了腺病毒的高转染性，从而提高了效率，简化了手续，提高了滴度。采用这种腺病毒-AAV载体，其AAV病毒滴度可达1011。AAV病毒滴度较高、可携带的DNA片段较长(4.7kb)；可以定点整合于染色体中，安全；抗原性差，不易产生抗体，可以反复使用；适用的细胞范围较广。近年来受到人们的关注。除了上述病毒载体外，目前用于基因治疗研究的还有单纯疱疹病毒、痘苗病毒载体等。前者是一种嗜神经的载体，后者是一种大容量的载体。仙台病毒载体也用于心血管系统转基因的研究。综上可见，现在尚缺少一种十分理想的转基因方法用于基因治疗。各种方法均有优、缺点。因此，如何取长补短，构建出一种安全、简便、高效、靶向性的载体，仍是当前基因治疗研究中亟待解决的关键问题。新型载体除了上述特点外，其表达还应该是可被调控的，即可根据需要情况，调节外源基因的表达。例如，将甲状腺素或维甲酸的调节序列插入载体，这样通过甲状腺素或维甲酸可以调节外源基因的表达。新型的转基因方法，还应该考虑到能够携带两种或两种以上的外源基因。因为恶性肿瘤、心血管疾病等均是多基因疾病；即使是同一种疾病，不同发病过程所涉及的关键基因也不尽相同。因此新型的基因载体需要能携带数种基因，以适应不同发病机制和不同病程的治疗要求。近年来报道，将病毒介导与非病毒介导的转基因方法结合起来构建新型载体，是—种有效的尝试。例如，上述的病毒－多聚赖氨酸－受体结合的复合型载体，可以提高转移效率和靶向性。随着人工酵母染色体(YAC)的研究进展，近年应用人工染色体作为转基因载体，这种载体可携带很大的外源基因(300kb)，它不整合于宿主细胞染色体中即可复制、表达。这可能是一种很有前途的新型基因载体。第三节新药发展过程新药发展经历从实验室阶段的体外研究到活体动物的体内研究，然后过度到人体试验，经过疗效与安全性评价后最终成为治疗药物，是一项复杂的系统工程。药物治疗学建立在药理学两个重要理论支柱之上，一是药物必须具有一定的选择性，二是在一定的剂量范围内必须安全。新化合物从被发现到成为新药上市的基本过程见图1-1,包括各研究过程所需的大致时间周期。研究人员在某一目标领域发现新的先导化合物后,进一步的工作就是合成一系列的结构类似物进行构效关系(ＳＡＲ)的研究。合成的目的在于优化化合物的治疗指数。如果在先导化合物的发现过程中未使用计算机辅助药物设计(ＣＡＤＤ)的研究手段,那么这一阶段应用ＣＡＤＤ的方法有助于减少合成结构衍生物的数量。而对先导化合物的衍生物进行生物活性评价有助于了解化合物药代动力学的特点、化合物的作用机制以及最终选择一个最佳的化合物作为临床候选药物。在优化化合物的过程中,申请专利能保证研究人员对新化合物及其用途的必要权利。申请专利的类型有化合物专利、方法专利、生产工艺专利和剂型专利4种。其他用于选择一个临床候选药物的步骤有：制药公司的化学合成研究组合成大量的原料药；制剂研究组对新药进行制剂研究，为新药临床使用提供合适的剂型；药理研究组最初在几种不同的动物上进行毒性的研究，并在动物体内进行新药的代谢分布和药代动力学参数的研究。所有的这些研究工作将需要花费数年的时间来积累足够的临床前的数据，从而为新药进入临床试验打下基础。在这一时期，任何不利的发现，特别是发现意料不到的毒性，将阻碍新药的进一步开发研究合理药物设计化合物的普筛组合化学高通量筛选天然产物（发酵产物，植物或合理药物设计化合物的普筛组合化学高通量筛选天然产物（发酵产物，植物或目标化合物的合成海洋生物的活性提取物）筛选1～2主要生物活性评价1～2主要生物活性评价 鉴定结构先导化合物鉴定结构先导化合物合成结构衍生物生物活性评价体外代谢研究计算机辅助药物设计研究合成结构衍生物生物活性评价体外代谢研究计算机辅助药物设计研究专利申请1～21～2优化先导化合物，确定临床侯选药物优化先导化合物，确定临床侯选药物毒理学、急毒、亚急毒、长毒和生殖毒性研究药物代谢和药代动力学研究合成工艺研究制剂稳定性研究第二次、第三次生物活性评价毒理学、急毒、亚急毒、长毒和生殖毒性研究药物代谢和药代动力学研究合成工艺研究制剂稳定性研究第二次、第三次生物活性评价1～31～3新药临床试验申请新药临床试验申请毒理学研究（长期毒性研究）动物代谢和药代动力学研究人体药代动力学研究Ⅰ期临床试验毒理学研究（长期毒性研究）动物代谢和药代动力学研究人体药代动力学研究Ⅰ期临床试验ⅡⅡ期临床试验ⅢⅢ期临床试验3～63～6注册申请注册申请2～3注册后工作注册审查2～3注册后工作注册审查批准注册批准注册＜1＜18～10上市8～10上市图1－1新药从发现到上市流程图工作。如果一个候选药物通过了上述研究，在美国研究机构的下一步工作就是向食品和药物管理局(ＦＤＡ)提出新药临床研究(ＩＮＤ)的申请。这是一个在人体上进行新药临床研究的正式申请。研究机构必须递交一份所要进行人体研究的计划书，此计划书应包括临床协议的各个细节。为了保证计划书遵从医学伦理的道德规范和保障临床试验人员的安全和利益不受到损害，提交的研究计划必须由一个独立的伦理委员会(ＩＲＢ)来进行仔细的审查，这个独立考察委员会主要由一名医生、一名律师和可能是一名官员或数名其他非专业团体的成员组成。Ｉ期临床试验是在健康志愿者身上进行新药研究的起始期，主要内容是进行初步的临床药理学及人体安全性评价试验，目的是观察人体对于新药的耐受程度和药物代谢动力学，为制定安全有效的给药方案提供依据。如果Ｉ期临床试验未观察到有危害性的不良反应，即可进行Ⅱ期临床试验。Ⅱ期临床试验的目的在于对新药的有效性及安全性做出初步评价，推荐临床给药剂量；Ⅱ期临床试验完毕后便可进行范围更广的Ⅲ期临床试验，其目的在于进一步评价新药的有效性、安全性和监控长期服药后可能出现的不良反应。根据不同的药物以及它们治疗疾病的特点，所有的临床试验可能持续3～6年，甚至更长。如果临床研究的结果证实药物具有良好的疗效和非常小的不良反应，那么该药的临床前和临床研究数据汇编资料就可以作为新药申请资料递交给ＦＤＡ。新药的注册申请平均需要花费3年的时间来进行详细的审查。如果顺利的话，申请的药物即可上市。这里需要强调的是，注册申请规定要求申请注册的新药在某些方面要比现有临床用药具有显著的优点(如疗效更高，起效更快，作用时间长或不良反应少等)。一些同类药品如果在治疗作用上或者安全性方面不能超过已上市的药品，那么这些药品的注册申请是不会被批准的。新药被批准注册上市后即完成了一个新药开发的全过程。在美国，这一过程通常是由制药企业来完成的。制药企业能提供充足的经费和组织足够的人力资源来保证完成这一花费巨大、周期漫长的工作，因此，从这一角度来说制药企业是新药开发的最佳实体。可见，药物发展是一项极其艰苦、需要高科技、高投入、高风险、同时又是高回报的活动。就美国来说，一种新药的研制周期为10年左右。一个有临床应用前景的新药化合物，要从8,000～10,000个化合物中筛选而得，一种新药的开发投资1987年平均1.25亿美元，1991年达2.3亿，开发投资随时间的推进呈上涨的趋势。70年代以来，每5年用于开发研究的费用就翻一番。第四节新药发展前瞻随着生命科学的发展和人民生活水平的提高，人类对药物的要求从以前的有效性、安全性，向高效、专一、低毒性发展，生物制品、天然药物将备受青睐，而传统的合成药物所占的比例将会相对减少。因此下个世纪生物制品、天然药物将会迅速发展，而合成药物及新的制剂也将有新的发展。一、十年内新药