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第五章生物技术原理第1页二十一世纪是生命科学与生物技术世纪，生物技术被世界各国视为一项高新技术，广泛应用于农业、工业、医药卫生、食品、化工能源等各行各业，正在对人类社会生活产生深远影响。第2页传统生物技术:酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶当代生物技术:20世纪70年代末80年代初,基因工程{生物技术生物技术也称为生物工程，是指以当代生命科学为基础，结合其它基础学科科学原理，采取先进工程技术伎俩，改造或重新设计细胞遗传物质，按照预先设计改造生物体，取得优良品质动物、植物和微生物品系，或加工生物原料，为人类生产出所需产品，到达提升社会生产力和生活质量目标。基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程生物技术第3页第一节基因工程操作原理第二节细胞工程操作原理第三节酶工程第四节发酵工程第五节蛋白质工程第六节分子杂交与遗传标识生物技术发展日新月异，新结果层出不穷，了解生物技术原理有利于了解和利用生物技术为社会服务。意在经过本章学习，到达了解生物技术基本原理目标。第4页第一节基因工程操作原理（P133）一、什么是基因工程二、基因工程操作技术及原理第5页一、什么是基因工程

概念：也叫基因操作遗传工程重组DNA技术基因工程主要原理基因工程四个步骤用人工方法，把生物遗传物质分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表达技术。克隆目标基因，取得所需要DNA特异片段。与DNA载体连接成重组DNA。引入细菌或动植物细胞并使其增殖。挑选出受体细胞，指导合成蛋白质或优良新品种。第一节基因工程操作原理

第6页（一）核酸分子提取技术（二）电泳技术（三）各种酶使用（四）基因克隆（五）体外重组（六）载体构建（七）转化（八）重组体筛选与判定（九）培育新型品种二、基因工程操作技术及原理第一节基因工程操作原理

第7页分类：方法：（一）核酸分子提取技术RNA提取总DNA提取质粒DNA提取首先，粉碎组织细胞；其次，DNA用乙醇等进行沉淀；最终，用苯酚、氯仿等洗涤纯化。第一节基因工程操作原理

第8页（二）电泳技术带电物质在电场中向相反电极移动现象称为电泳。各种生物大分子在一定pH值条件下，能够解离成带电荷离子，在电场中会向相反电极移动。分类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。概念：第一节基因工程操作原理

第9页总RNA总DNA质粒DNA第一节基因工程操作原理

第10页第一节基因工程操作原理

（三）各种酶使用1、限制性内切酶使用分类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。

概念：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在适当条件下使每一条链一定位点上磷酸二酯键断开，产生含有3′-OH基团和5′-P基团DNA片段内切脱氧核糖核酸酶。

第11页用质粒构建第一节基因工程操作原理

重组DNA分子第12页用噬菌体DNA构建第一节基因工程操作原理

重组DNA分子第13页限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA分子构建第一节基因工程操作原理

第14页2、DNA连接酶使用DNA连接酶能够催化含有3′-OH基团和5′-P基团DNA片段之间形成磷酸二酯键。在基因克隆中用来连接载体与目标基因。第一节基因工程操作原理

第15页DNA聚合酶能够使单核苷酸经过磷酸二酯键加在寡核苷酸3′-OH端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是含有耐热性质DNA聚合酶分离极大促进了基因等DNA片段体外合成与扩增技术发展。3、DNA聚合酶使用第一节基因工程操作原理

第16页4、逆转录酶使用逆转录酶能够RNA为模板合成DNA，即cDNA（互补DNA）。在基因克隆中惯用来构建cDNA文库。

第一节基因工程操作原理

第17页（四）基因克隆第一节基因工程操作原理

第18页5′3′3′5′5′3′3′5′+变性(94℃)复性(55℃)5′3′P13′5′+P2+P1P2合成（72℃）PCR普通用PCR扩增方法，依据已知基因序列设计引物来克隆基因。1、克隆已知基因序列基因

第一节基因工程操作原理

第19页第一节基因工程操作原理

在某种植物同源基因被克隆条件下，可先构建cDNA文库或基因组文库，然后以该基因（或部分序列）为探针来筛选目标基因克隆。第20页作图克隆技术是伴随分子标识图谱建立而发展起来基因克隆技术。依据连锁图谱定位基因来克隆目标基因。克隆植物分子连锁图谱定位基因，可采取作图克隆策略。作图克隆是从连锁标识出发，经过大片段克隆（BAC或YAC库）染色体步移抵达靶基因。

第一节基因工程操作原理

3、作图克隆依据基因产物蛋白质克隆基因。首先依据已知生化缺点或特征确认与该功效相关蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备对应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能mRNA序列，依据mRNA序列设计对应核苷酸探针或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库，也可进行PCR扩增。2、功效克隆第21页第一节基因工程操作原理

（1）消减杂交法（2）DNA标签法（3）差异显示技术包含：mRNA差异显示法等。（4）缺点互补和反义mRNA技术（5）cDNA微阵列和基因芯片技术4、表型差异克隆

利用表型差异或组织器官特异表示产生差异来克隆基因。第22页利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因，如酵母双杂交体系能够分离能与已知靶蛋白质相互作用蛋白质编码基因。5、染色体大片段基因克隆第一节基因工程操作原理

第23页第一节基因工程操作原理

是将带有目标基因外源DNA片段连接到能够自我复制并含有选择标识载体分子上，形成重组DNA分子。（五）体外重组第24页理想运载体是质粒，当给它安装一段外来DNA片段后，它依然如故地进行自我复制。（六）载体构建第一节基因工程操作原理

第25页（1）农杆菌介导转化法：将外植体放入农杆菌菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后抗性植株移栽至营养钵培养。（七）转化1、植物转基因技术第一节基因工程操作原理

第26页又称微弹轰击法。其基本原理是将外源DNA包被在微小金粒或钨粒表面，然后在高压作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表示，从而实现基因转化，（2）基因枪法第一节基因工程操作原理

第27页利用植物在开花、受精过程中形成花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并深入地被整合到受体细胞基因组中，伴随受精卵发育而成为带转基因新个体。（3）花粉管通道法第一节基因工程操作原理

80年代早期周光宇转基因抗虫棉不依赖组织培养第28页首先制备植物原生质体，游离出细胞，在倒置显微镜和显微操作器帮助下，将目标基因DNA经过微管注射到受体细胞中。（4）微注射法第一节基因工程操作原理

第29页在短时间高压直流电脉冲冲击下，能够使原生质膜分子疏松，形成暂时性直径为3～4nm小孔，但对原生质体生活力影响不大。这时，存在于原生质体周围溶液中外源DNA，就能够经过这种小孔进入原生质体，实现基因直接转移。（5）电穿孔法第一节基因工程操作原理

原生质体在短时间微束激光照射下，可在质膜表面形成面积约0.25μm2左右小孔，使DNA分子进入细胞。（6）微束激光打孔法第30页世界上主要有4类已报道方法：1）融正当，包含精子融介法，微细胞介导融合等。2）化学法，包含DNA-磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色体介导法。3）物理法，包含显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等。4）病毒感染法，包含重组DNA病毒感染、重组RNA病毒感染等。真正成熟方法显微注射DNA法精子介导法核移植法2、转基因动物技术

第一节基因工程操作原理

第31页核显微注射法是转基因技术中最惯用方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞原核内，注射外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最终移植到受体母畜子宫内发育，这么分娩动物体内每一个细胞都含有新DNA片段。（1）核显微注射法第一节基因工程操作原理

缺点：效率低表示结果不确定性动物利用率低等在反刍动物：繁殖周期长，较强时间限制、需要大量受体动物。第32页精子介导基因转移是把精子作适当处理后，使其含有携带外源基因能力。然后，用携带有外源基因精子给母畜授精。优点：成本很低，只有显微注射法成本1／10。因为它不包括对动物进行手术处理，所以，能够用生产牛群或羊群进行试验。（2）精子介导基因转移第一节基因工程操作原理

第33页先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞细胞核移植到受体细胞—去核卵母细胞，组成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因克隆动物。（3）核移植转基因法第一节基因工程操作原理

第34页遗传检测法物理检测法菌落或噬菌斑杂交筛选法免疫化学检测法DNA－蛋白质筛选法转译筛选法等（八）重组体筛选与判定技术方法:第一节基因工程操作原理

第35页★草甘磷是一个广谱除草剂，将含有抗草甘磷EP2SP合成酶突变基因引入植物，就可使植物取得抗除草剂特征，使大田作物便于除草，农业操作简便。（九）培育新型品种第一节基因工程操作原理

第36页★在食品工业方面可提升微生物菌种性能，经过基因工程改造面包酵母中麦芽糖透性酶和麦芽糖酶含量比普通面包酵母高，产生二氧化碳气体量也较高，可制作出更松软可口面包。第一节基因工程操作原理

第37页★凝乳酶传统方法是从小牛胃中提取，成本高，产量低，20世纪80年代以来，将凝乳酶原基因导入大肠杆菌，成功地进行了大规模生产。第一节基因工程操作原理

第38页★美国基因重组抗霜菌，洒在植物上可抗霜冻。当前，基因工程作物主要有玉米、大豆、水稻、棉花、马铃薯、番茄、烟草等。第一节基因工程操作原理

第39页第一节基因工程操作原理

第40页“多莉”轰动了世界；“克隆人”让人匪夷所思；将人类干细胞加到动物早期发育胚胎中，造成猪体内流人血，老鼠长着人类脑细胞，小鼠背上长人耳……。

第二节细胞工程操作原理（P139）一、什么是细胞工程二、细胞工程技术与原理第41页细胞工程：按照人们需要和科学设计改变细胞遗传基础，并经过无菌操作，细胞融合，核质移植，染色体移植以及组织和细胞培养等技术，重组细胞结构和内含物，以改变生物结构和功效，快速繁殖和培养出人们所需要新物种生物工程技术。一、什么是细胞工程第二节细胞工程操作原理第42页（一）细胞融合技术

细胞融合，又称细胞杂交：是指在离体条件下用人工方法使两个或两个以上细胞相互接触后，造成细胞合并形成一个新细胞过程。二、细胞工程技术与原理第二节细胞工程操作原理自然融合人工诱导融合通常所说细胞融合指人工诱导融合。第43页1、制备原生质体2、诱导细胞融合

3、筛选杂合细胞

细胞融合技术主要步骤:第二节细胞工程操作原理第44页克隆技术：从同一个亲代细胞形成一组细胞，形成大量子细胞无性繁殖过程，这些子细胞和亲代细胞完全相同，"多莉"诞生意味着人类能够利用动物一个组织细胞“复印”出大量相同生命体，这个过程称为克隆技术。（二）克隆技术第二节细胞工程操作原理第45页生物克隆原理第二节细胞工程操作原理第46页染色体工程是按照预先设计，添加、消除或替换同种或异种染色体全部或一部分，从而到达定向改变生物遗传性状或选育新品种目标。

比如，向小麦中添加黑麦染色体形成小黑麦附加系、代换系等，为染色体研究和育种提供新材料。（三）染色体工程第二节细胞工程操作原理第47页将动物一个早期胚胎如8细胞胚取出并在动物体外进行分割后，把分割胚胎都移植到母体内，结果得到由多个胚胎细胞克隆而成生物。（五）胚胎分割和移植技术第二节细胞工程操作原理细胞质工程又称细胞拆合工程，是经过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不一样细胞间核质重新组合，细胞质置换重建成新细胞。（四）细胞质工程第48页细胞核转移技术就是将一个细胞细胞核取出，移入另外一个除去了细胞核细胞中，组成一个完整细胞。该技术是体细胞克隆技术基础。（六）细胞核转移技术第二节细胞工程操作原理第49页（七）干细胞工程第二节细胞工程操作原理干细胞工程是利用干细胞增殖特征，多分化潜能及其增殖分化高度有序性，经过体外培养干细胞、诱导干细胞定向分化或利用转基因技术处理干细胞以改变其特征方法。第50页（八）大规模细胞组织培养技术第二节细胞工程操作原理第51页第二节细胞工程操作原理第52页第二节细胞工程操作原理第53页生物体——机器——酶——复杂高效化学反应。胃分泌胃蛋白酶胰脏分泌淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶第三节酶工程（P142）

一、酶工程概念和内容二、酶分析技术三、酶生产四、酶提取和分离纯化五、酶固定化方法六、酶应用

第54页酶是一个在生物体内含有新陈代谢催化剂作用蛋白质。含有反应效率高、条件温和、反应产物污染小、能耗低和反应易控制等特点。酶工程又称酶工艺学，就是利用酶催化作用，利用酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等，经过工程学伎俩，在一定生物反应器中，将对应原料转化成所需要产品。一、酶工程概念和内容第三节酶工程第55页酶工程应用主要集中于食品工业、轻工业、医药工业和临床诊疗等方面。对传统化学工业改造和“三废”处理等含有很大潜力。第三节酶工程第56页酶工作效率很高，α-淀粉酶在60℃15分钟可使两吨淀粉转化为糊精，若用酸水解须在14O～15O℃高温耐酸设备中最少进行2小时。当前，人们把酶工程分为生物酶工程和化学酶工程。第三节酶工程第57页主要任务是：(1)采取基因重组技术，利用微生物、动植物细胞作为生物反应器大量生产酶。当前已成功地生产了lOO各种酶。(2)经过基因工程技术，使酶基因发生定位突变，产生遗传性修饰酶(突变酶)。(3)设计新酶基因，合成自然界不曾有新酶。即使生物酶工程技术发展尚处于幼年时代，但它将开创从分子水平依据遗传设计蓝图，创造出超自然生物机器新时代。1、生物酶工程第三节酶工程第58页2、化学酶工程(1)自然酶，是指由生物材料中分离出来酶。(2)化学修饰酶又称“生物分子工程”，是经过对酶分子实施“手术”以到达改构和改性目标。(3)固定化酶，是将酶分子经过吸附、交联、包埋及共价键结合束缚于某种特定支持物上而发挥酶作用。含有能重复使用、产物易纯化、可用微电脑控制，实施自动化连续化生产等优点。(4)人工合成酶，模拟酶催化功效，用化学方法合成含有专一性催化剂。第三节酶工程第59页包含酶试剂盒、酶联免疫、酶标基因探针、酶传感器等等，已经在临床诊疗、生物工艺过程分析与监控、环境监测、检疫、生命科学研究等方面逐步取代传统化学分析法。二、酶分析技术第三节酶工程酶在分析生物技术领域应用也很广。第60页提取法、发酵法和化学合成法1、提取法：直接从动植物或微生物细胞或组织中将酶提取出来。2、发酵法：经过微生物发酵来取得人们所需要酶。3、化学合成法：采取化学合成方法取得酶。不过，成本比较高，而且只能合成已知化学结构酶。三、酶生产

第三节酶工程第61页1、细胞破碎处理

机械破碎法：利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎。物理破碎法：利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎。化学破碎法：利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜，使细胞膜结构遭到破坏或透性发生改变。酶学破碎法：选取适当酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎。四、酶提取和分离纯化

第三节酶工程2、酶提取过柱法盐溶液提取法碱溶液提取法有机溶剂提取法等3、分离酶分离纯化方法很多，可利用酶相对分子质量大小进行分离纯化，如经过透析方法分离酶等。第62页1、载体结正当载体结正当是指将酶固定到非水溶性载体上方法。物理吸附法、离子结正当、共价结正当。2、交联法：经过双功效试剂，将酶和酶联结成网状结构方法。交联法使用交联剂是戊二醛等水溶性化合物。3、包埋法：将酶包裹在多孔载体中。五、酶固定化方法

第三节酶工程酶固定化方法不下百种，归纳起来大致能够分为三类：第63页（1）高果糖浆

葡萄糖——经过异构化——果糖。生产上实际上只有42%～45%，其余依然是葡萄糖。把果葡糖浆中果糖和葡萄糖分离，将分离出来葡萄糖再次进行异构化，如此重复屡次，最终混合物中果糖含量能够到达70%～90%，形成高果糖浆。六、酶应用第三节酶工程第64页加酶洗衣粉中添加了各种酶制剂，如碱性蛋白酶制剂和碱性脂肪酶制剂等。对人体没有毒害作用不会污染环境。（2）加酶洗衣粉

第三节酶工程第65页肌肉组织中含有胶原蛋白，因为存在着交联键而使肌肉含有很强机械强度。用嫩肉粉处理年老畜禽肌肉，能够使这类肌肉中胶原蛋白水解，使肌肉变软而且易于烹调。第三节酶工程（3）嫩肉粉

木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或米曲霉蛋白酶制成。第66页传感器又叫变送器，是一类能将某一个被测物理量变换成便于传送和处理另一个物理量（通常为电量）器件或装置。比如，验钞器就是一个比较简单传感器。第三节酶工程（4）酶传感器第67页★菠萝蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、胃蛋白酶等----胃分泌功效障碍。★

L-天冬酰胺酶、白喉毒素----抗肿瘤，★胰凝乳蛋白酶----治疗炎症，★激肽释放酶----降血压，★尿激酶----溶解血凝块。第三节酶工程（5）医药医疗第68页1857年，法国微生物学家巴斯德发觉了发酵原理，人们才认识到发酵是微生物活动结果。第四节发酵工程（P147）一、发酵工程概念和内容二、发酵工程操作技术三、发酵工程应用四、发酵工程产品——氨基酸第69页发酵工程：是指利用微生物特定性状，经过当代化工程技术，在生物反应器中生产有用物质一个技术系统，或直接把微生物应用于工业生产过程一个新技术。发酵工程内容包含菌种选育、培养基配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品分离提纯等方面。一、发酵工程概念和内容第四节发酵工程第70页2、发酵工艺：:主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物工艺技术。3、下游工程：:指从发酵液中分离和纯化产品技术。第四节发酵工程发酵工程由三部分组成：1、上游工程:包含利用常规方法、基因工程方法、细胞工程方法等选育优良种株，最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）确实定，营养物准备等。第71页(一)菌种选育：自然选育、诱变育种，比如，在1943年刚开始生产青霉素时，青霉素产量只有20μg/mL左右，经过长久诱变育种，如今青霉素产量已到达85000μg/mL以上。（二）培养基配制适当培养基对细菌生长非常主要。（三）灭菌发酵工程中所用菌种大多是单一纯种。（四）扩大培养和接种在大规模发酵生产中，需要屡次扩大培养。二、发酵工程操作技术第四节发酵工程第72页这是发酵工程中心阶段和生产过程。在这个阶段，除了要随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度等，以了解发酵进程外，还要及时添加必需培养基组分，以满足菌种营养需要。同时，要严格控制温度、pH值、溶氧、通气量与转速等发酵条件。第四节发酵工程（五）发酵过程20世纪60年代，生物学家将计算机应用到发酵工程中，实现了对温度、pH值、通气量、转速等自动统计和自动控制。

第73页未转基因酵母转基因酵母第四节发酵工程第74页转基因高产β－胡萝卜素

可食酵母体系中试生产转基因酵母430-1290ug/g胡萝卜31ug/g第四节发酵工程第75页胰岛素1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液10克胰岛素干扰素1200升人血1升发酵液2－3万美元/病人200－300美元/病人第四节发酵工程第76页

（1）温度

温度影响酶活性。金色链霉菌——在30℃以下时，合成金霉素能力较强，但当温度超出35℃时，则只合成四环素而不合成金霉素。灰色链霉菌——最适生长温度是37℃，产生抗生素最适温度是28℃。第四节发酵工程（六）影响发酵过程原因（2）pH值

pH值能够影响酶活性，以及细胞膜带电荷情况，从而有可能影响微生物对营养物质吸收及代谢产物分泌。另外，pH值还会影响培养基中营养物质分解等。第77页（3）溶解氧

氧供给对需氧发酵来说，是一个关键原因。从葡萄糖氧化需氧量来看，1mol葡萄糖彻底氧化分解，需6mol氧。所以，必须向发酵液中连续补充大量氧，并要不停地进行搅拌，以提升氧在发酵液中溶解度。（4）泡沫

在发酵过程中，通气搅拌、微生物代谢过程及培养基中一些成份分解等，都有可能产生泡沫。发酵过程中产生一定数量泡沫是正常现象，但过多持久性泡沫对发酵是不利。惯用消泡沫办法有两类：一类是安装消泡沫挡板，经过强烈机械振荡，促使泡沫破裂；另一类是使用消泡沫剂。（5）营养物质浓度

发酵液中各种营养物质浓度，尤其是碳氮比、无机盐和维生素浓度，会直接影响菌体生长和代谢产物积累。所以，在发酵过程中，也应依据详细情况进行控制。第四节发酵工程第78页应用发酵工程生产产品有两类：一类是代谢产物，另一类是菌体本身，如酵母菌和细菌等。菌体——可采取过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；代谢产物——可采取蒸馏、萃取、离子交换等方法进行提取。第四节发酵工程（七）产物分离提纯第79页发达国家发酵工业总产值占到国民生产总值5％左右。生产出了种类繁多药品，如抗生素、维生素、动物激素、药用氨基酸、核苷酸(如肌苷)等。1、谷氨酸发酵生产2、单细胞蛋白三、发酵工程应用第四节发酵工程第80页氨基酸主要用于食品、医药、农业、化装品生产等方面。在食品工业上应用

甘氨酸、丙氨酸含有甜味，天冬氨酸、谷氨酸含有酸味，谷氨酸钠、天冬氨酸钠含有鲜味，食品添加剂。甘氨酸用于清凉饮料、肉汤、酱菜等加工，不但能增加甜味，还能缓解苦味。赖氨酸、蛋氨酸等人体必需氨基酸常作为食品添加剂，用以提升食品营养价值。四、发酵工程产品——氨基酸第四节发酵工程第81页在医药工业上应用

氨基酸混合液可供病人注射用，氨基酸混合粉剂可作宇航员、飞行员补品。精氨酸药品用于治疗由氨中毒造成肝昏迷；丝氨酸药品用作疲劳回复剂；蛋氨酸、胱氨酸用于治疗脂肪肝；甘氨酸、谷氨酸用于调整胃液；L-谷氨酸与L-谷氨酰胺用于治疗脑出血后记忆力障碍等。第四节发酵工程第82页在化装品生产中应用

氨基酸及其衍生物与皮肤成份相同，含有调整皮肤pH值和保护皮肤功效。比如，胱氨酸用于护发素中，丝氨酸用于面霜中。又如，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸与脂肪酸形成表面活性剂，含有清洗、抗菌等功效，用于护肤品、洗发剂中。第四节发酵工程第83页在农业上应用

苯丙氨酸和丙氨酸可用于治疗苹果疮痂病。美国一家企业用甘氨酸制成了除草剂。不会造成环境污染。赖氨酸、蛋氨酸添加在饲料中，能加速家畜、家禽生长，改进肉质量。第四节发酵工程第84页第五节蛋白质工程（P155）一、什么是蛋白质工程二、蛋白质结构分析第85页蛋白质工程是以蛋白质结构功效关系知识为基础，经过周密分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要新突变蛋白质。一、什么是蛋白质工程第五节蛋白质工程蛋白质工程也被称为第二代基因工程。第86页二、蛋白质结构分析第五节蛋白质工程RNase一些二级结构血红蛋白四级结构（一）蛋白质分子结构第87页基本方法：（1）应用化学裂解法和蛋白酶水解法将多肽链专一性裂解；（2）逐一测定每个纯化小肽段次序；（3）依据肽段氨基酸次序中重合区确定小肽段排列次序；（4）完成整条多肽链次序分析。尽管蛋白质次序分析已经自动化，但依然耗时、复杂而且昂贵。重组DNA技术出现后，人们能够从cDNA或基因序列直接推导出蛋白质氨基酸次序。第五节蛋白质工程（二）蛋白质结构推测与测定1、一级结构测定第88页蛋白质三维结构很大程度上决定了蛋白质功效，当前应用X射线晶体衍射图谱法和核磁共振法已测定出1万各种蛋白质及其复合物结构，但与已测得30多万种蛋白质序列相比，还有很大差距。第五节蛋白质工程2、蛋白质高级结构预测（1）比较建模法（2）反向折叠法（3）从头预测法第89页依据蛋白质状态，测定蛋白质三维结构方法分为两大类：晶体中:应用X射线晶体衍射图谱法和中子衍射法。溶液中:应用核磁共振法、园（圆）二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等。其它方法在应用上存在较大不足。第五节蛋白质工程3、蛋白质三维结构试验测定第90页（三）蛋白质创造和改造一是小范围改造，少数几个残基替换；二是较大程度改造，是对起源于不一样蛋白质结构域进行拼接组装，期望转移对应功效；三是蛋白质从头设计。第五节蛋白质工程1、定点突变2、盒式突变

3、蛋白质融合4、蛋白质从头设计第91页第六节分子杂交与遗传标识（P158）一、分子杂交二、遗传标识三、分子标识技术应用第92页

（1）Southernblot杂交第六节分子杂交与遗传标识一、分子杂交第93页（2）Northernblot杂交（3）Westernblot杂交第六节分子杂交与遗传标识Northernblot杂交Westernblot杂交第94页遗传标识：指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递任何一个遗传特征。遗传标识包含形态标识、细胞学标识、生化标识和分子标识四种类型。第六节分子杂交与遗传标识二、遗传标识（一）形态标识主要包含肉眼可见外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等，也包含色素、生理特征、生殖特征、抗病虫性等相关一些特征。形态标识简单直观、经济方便；但其数量在多数植物中是很有限，且多态性较差，表现易受环境影响。第95页细胞学标识即细胞染色体变异。包含染色体核型（染色体数目、结构、随体有没有、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）改变。第六节分子杂交与遗传标识（二）细胞学标识第96页生化标识主要包含同工酶和等位酶标识。同工酶是指不一样基因座位编码酶不一样形式，而等位酶是指由一个基因座位不一样等位基因编码酶不一样分子形式。分析方法是从动植物组织蛋白粗提物中经过电泳和组织化学染色法将酶各种形式转变成肉眼可辩酶谱带型。（三）生化标识第六节分子杂交与遗传标识第97页分子标识指能反应生物个体或种群间基因组中某种差异特征DNA片段，它直接反应基因组DNA间差异。第六节分子杂交与遗传标识（四）分子标识(1)高多态性(2)共显性遗传(3)能明确区分等位基因(4)遍布整个基因组(5)均匀分布于整个基因组(6)选择中性；(7)检测伎俩简单、快速；(8)成本低廉；(9)重复性好。第98页

限制性片段长度多态性（缩写RFLP）是发展最早分子标识技术。RFLP技术原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成特定DNA片段大小。所以凡是能够引发酶切位点变异突变如点突变和一段DNA插入和缺失造成酶切位点间长度发生改变等均可造成RFLP产生。第六节分子杂交与遗传标识1、RFLP

第99页印迹法内切酶切开DNA电泳印迹转移放射性探针杂交胶片显影第六节分子杂交与遗传标识第100页第六节分子杂交与遗传标识对线粒体和叶绿体DNA进行这种多态性差异检测在1980年之前就已出现，从理论上说，这种多态性也可称为RFLP。第101页

PCR(聚合酶链式反应)由Mullis等于1985年首创。经数小时后，就能将极微量目标基因或某一特定DNA片段扩增数百万倍。第六节分子杂交与遗传标识2、PCR技术及其在分子标识中应用（1）AP-PCR（2）随机扩增多态性DNA(缩写RAPD)：（3）DAF：（4）AFLP（5）STS第102页第六节分子杂交与遗传标识第103页第六节分子杂交与遗传标识简单重复序列(SSR)：即微卫星DNA，是一类由几个碱基组成基序串联重复而成DNA序列，不一样遗传材料重复次数可变性，造成了SSR长度高度变异性。3、SSR（SSLP）第104页染色体原位杂交技