survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡研究TheeffectofsurvivinantisenseoligonucleotideonapoptosisofHL-60cells研究生

:

陈艳萍

导师

:

毕富勇副教授汪萌芽教授

学科专业

:

生理学

研究方向

:

肿瘤生化

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第1页

前言

1997年耶鲁大学Altieri博士用EPR-1cDNA在人类基因组库杂交筛选试验中发觉了一段15kb大小基因片段，它编码了142个氨基酸组成Survivin蛋白；Survivin编码基因位于染色体17q25，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族新组员survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第2页

StructureofhumanIAPproteinfamily17q25BIR:baculoviralIAPrepeatRZF:ringzinc-fingleCARD:caspaserecruitmentdomainInhibitorofApoptosisLocationinhumanchromosomesurvivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第3页

Survivin分子结构长α螺旋BIR区survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第4页

Survivin分子结构长α螺旋BIR区survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第5页

Survivin分子结构Survivin形成二聚体survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第6页

Survivin表示肺癌肝癌膀胱癌皮肤癌神经母细胞瘤乳腺癌食管癌胃癌白血病survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第7页Survivin表示SURVIVIN选择性表示于绝大多数肿瘤组织在正常成人分化组织中不表示（包含癌旁组织）普遍性独特征

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第8页Survivin作用!survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第9页

Survivin作用Survivin抗凋亡肿瘤细胞分裂增加凋亡降低survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第10页研究内容survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第11页反义Survivinsurvivin表示受抑活化细胞凋亡survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第12页技术路线survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第13页HL-60细胞体外悬浮培养掺入反义寡核苷酸48h

后分别于24h、48h形态学观察、死活细胞计数

收获细胞、检测指标RT-PCRTUNELFCMsurvivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第14页材料

细胞株HL-60细胞株（急性早幼粒细胞系）由中国科学院上海细胞所提供

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第15页RNAgentsTotalRNAIsolationSystemPromega企业AccessQuickTMRT-PCRSystemPromega企业PropidumIodide(PI,碘化丙啶)Sigma企业主要药品与试剂材料survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第16页研究方法

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第17页反义寡核苷酸序列

survivin反义硫代寡聚脱氧核苷酸(Aspo)序列

5’GGCAACGTCGGGGCACCCAT3’[9]

非特异性对照硫代寡聚脱氧核苷酸(Nspo)序列

5’GCCATCGTAGGGGATCGCTT3’[9]

上海SANGON企业合成与纯化

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第18页

培养箱

20%新生小牛血清

RPMI-1640液

100U/ml青霉素

100ug/ml链霉素

37oC5%CO2饱和湿度

倒置显微镜观察

2~3天传代一次

细胞系培养和传代

HL-60细胞survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第19页Photo1.HL-60cells（×100）survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第20页Tab1.Theexperimentgrouping

groupfactorconcentrationControl RPMI-1640mixtureNspo Nspo15.0umol/LAspo5.0 Aspo 5.0umol/LAspo10.0Aspo 10.0umol/LAspo15.0 Aspo 15.0umol/Lsurvivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第21页试验分组及寡核苷酸掺入1000r/min离心5minRPMI-1640洗1次细胞起始浓度4×106/ml取细胞悬液1000ul接种至24孔板核酸100ul置CO2培养箱中孵育HL-60细胞survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第22页细胞增殖能力及活力观察

HL-60细胞于24、48h取50ul细胞悬液0.4%台盼蓝染色计数死活细胞着色为死细胞拒染为活细胞计算细胞存活率survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第23页细胞增殖能力及活力观察survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第24页HL-60细胞survivinmRNA表示总RNA提取

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第25页细胞沉淀加入300ulD液

加入30ulSodiumAcetate

加入苯酚:氯仿:异戊醇300ul

冰浴15min10000g4℃离心20min

转移上清

加入等量异丙醇

20℃放置10min

10000g4℃离心10min

75%冷乙醇洗涤RNA10000g4℃离心10min

以无RNase纯水溶解沉淀

RNA纯度检验和定量

RNAsurvivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第26页HL-60细胞survivinmRNA表示

RT-PCR

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第27页反应体系50µl48℃延伸45min

95℃预变性

2minPCR循环95℃45sec61℃1min72℃1min共30个循环

72℃延伸

5min模板RNA1ulAMV逆转录酶

1ul上游引物

3ul下游引物

3ulAccessQuickTMMasterMix25ulsurvivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第28页Tdt酶介导缺口末端标识法

详细操作按试剂盒说明书进行结果与判定：细胞核为棕褐色者为阳性细胞，即凋亡细胞凋亡细胞指数=凋亡细胞数

细胞总数×100%survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第29页DNA倍体分析及凋亡率检测

试验流程survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第30页单细胞悬液不含Ca2+或Mg2+PBS洗细胞

2次

1000g离心5min弃上清

计数细胞总数

500μlPBS重悬

5ml冷乙醇

4℃过夜

离心洗细胞2次含1%小牛血清800μlPBS重悬避光孵育1h100μl煮沸过RNA酶A

37℃

30分钟

FCM分析

加入100μlPIsurvivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第31页统计分析

结果均以“均数±标准差”表示，组间比较用单原因方差分析，以P＜0.05确定有显著性意义。survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第32页结果(1)细胞增殖能力及活力观察survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第33页Tab2.EffectofAspoonHL-60cellssurvivalrate(x±s,n=3)*p<0.05,**p<0.01vsCcontrol,△p<0.05,△△p<0.01vsNspo

GroupSurvivalrate(%) 24h48hControl98.70±0.70 98.28±0.45Nspo 98.59±0.60 97.47±0.47Aspo5.096.77±0.47*△ 95.05±0.24*△Aspo10.0 92.63±1.16**△△89.08±1.20*△Aspo15.0 82.61±0.85**△△77.71±0.77**△△

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第34页Fig1.EffectofAspoonHL-60cellssurvivalrate(x±s)survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第35页结果(2)TUNEL法检测HL-60凋亡细胞及其凋亡指数survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第36页Photo2.controlgroup(DAB×400)

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第37页Photo3.Nspogroup(DAB×400)

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第38页Photo4.Aspo5.0group(DAB×400)

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第39页Photo5.Aspo10.0group(DAB×400)

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第40页Photo6.Aspo15.0group(DAB×400)survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第41页Group Apoptoticindex(%) P C NControl2.16±0.29Nspo2.21±0.25Aspo5.04.77±0.42*△Aspo10.010.63±0.99*△Aspo15.0 21.67±1.95 *△*p<0.05,**p<0.01vsCcontrol；△p<0.05,△△p<0.01vsNspoTab3.Apoptosis

indexofHL-60cells(x±s,n=3

)survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第42页结果(3)Aspo处理HL-60细胞survivinmRNA表示改变

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第43页Fig2.survivinmRNAexpressionofHL-60cellstreatedbyAspofor48hoursdetectedbyRT-PCR1:100bpDNAladder;2:Control;3:Nspogroup;4:Aspo5.0group;5:Aspo10.0group;6:Aspo15.0group.survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第44页Tab4.effectofAspoonsurvivinmRNAexpressionofHL-60cells(x±s,n=3

)*p<0.05,*

*p<0.01vsCcontrol；△p<0.05,△△p<0.01vsNspoGroupsurvivin/β-actinPCNCNspoAspo5.0Aspo10.0Aspo15.00.812±0.0060.818±0.0050.780±0.0050.598±0.0080.496±0.012△△△△△△******

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第45页结果(4)流式细胞仪凋亡率检测survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第46页Tab.5EffectofdifferentdosesofAspoonHL-60cellsapoptosis

(x±s,n=3

)*p<0.05,**p<0.01vsCcontrol；△p<0.05,△△p<0.01vsNspoGroupApoptosisrate(%)PCNCNspoAspo5.0Aspo10.0Aspo15.01.09±0.491.62±0.342.67±0.565.75±0.9019.80±0.30△△△△△******

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第47页Fig.5ApoptosispeakmeasuredbyflowcytometryofHL-60treatedwithsurvivinAspo

A:controlB:survivinNspoC:survivinAspo

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第48页讨论

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第49页细胞凋亡机制研究进展：

细胞凋亡:又称程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）由Caspases（即含半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶）家族组员介导蛋白酶级联反应过程

凋亡机制survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第50页

凋亡提呈:驱动性Caspases

凋亡实施:效应性Caspases凋亡机制survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第51页Survivin与白血病关系

Survivin在各种白血病中都有表示，伴随病情缓解survivin表示也降低。且有研究发觉survivin低表示白血病患者，其完全缓解率及存活率高，而

survivin高表示患者不易缓解，且易复发

survivinmRNA表示与白血病诊疗、治疗转归及预后判断亲密相关survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第52页急性早幼粒细胞白血病介绍白血病是常见恶性肿瘤之一，发病率2.76／10万。

在恶性肿瘤死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下成人中则居第1

位

[26]急性早幼粒细胞白血病（APL）组成比约占急性白血病10~15%

其临床特征之一是严重出血，所以早期病死率高。

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第53页急性早幼粒细胞白血病治疗现实状况联合化疗：缓解率可达60~80%非特异性细胞毒性，抑制患者造血功效和免疫功效其毒副作用不但造成患者治疗相关性死亡，而且影响其“治愈”剂量临床应用。另外，因为白血病细胞对化疗药品耐药，多数病人最终复发。伴随分子生物学技术发展和对白血病发生、发展分子机理认识深入，使白血病研究进入了基因治疗新阶段。survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第54页Survivin作为靶基因思索作为白血病反义治疗理想靶基因必须具备以下两个条件：

①在肿瘤发生过程中起关键作用；

②只有在肿瘤中表示，而在正常组织中不表示。

survivin基因治疗含有良好靶向性、特异性及安全性

Survivin作用于细胞凋亡中关键酶

---Caspase-3Survivin表示普遍性和独特征

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第55页细胞凋亡诱导物病毒感染射线DNA损伤死亡信号survivin活化Caspase-3细胞凋亡Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应必经之路，是细胞凋亡中关键酶，而本试验所选取survivin基因能直接或间接抑制Caspase-3活化，所以含有强大抗凋亡作用因为survivin抑制细胞凋亡功效活性在肿瘤发生、发展中起关键性作用，survivin在白血病细胞重新表示可能是促成白血病发生主要原因，survivin可能是一个新癌基因

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第56页反义核酸序列选定针对survivin基因翻译起始密码子和前几位编码序列设计并合成

磷酸二酯键受核酸酶作用，轻易被降解，虽能用病毒载体将其转入细胞内，但考虑到安全性和临床应用，采取是对磷酸二酯键磷原子进行硫代修饰，硫代磷酸寡核苷酸有好溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导

RnaseH

survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第57页

survivin对HL-60细胞凋亡诱导作用凋亡特征TUNEL法能在3，-OH末端经过产生很强颜色反应（棕褐色）准确定位凋亡细胞；特异性高，敏感性强，可量化凋亡细胞。细胞凋亡时染色体断裂，DNA被裂解，细胞膜通透性增加，在细胞洗染过程中，DNA碎片逸出，胞内DNA含量显著降低，DNA组方图上在G1/G0峰前出现了特征性亚二倍体峰，即凋亡峰。survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第58页凋亡DNA断裂特征性改变是内源性核酸酶激活将DNA双螺旋结构由核小体间连接区断裂，形成以180~210bp或其多聚体组成寡核苷酸片断，从而产生3，-OH末端。survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第59页

经Aspo处理后HL-60细胞经TUNEL染色均可见到阳性凋亡细胞，DNA组方图上在G1/G0峰前出现了特征性亚二倍体峰，表明survivinAspo能够特异性诱导HL-60细胞凋亡,

RT-PCR试验显示本试验所选取这段反义核酸特异性抑制survivin基因表示，提醒可能因为降低了HL-60细胞内survivinmRNA含量，从而诱导HL-60细胞凋亡

survivin对HL-60细胞凋亡诱导作用survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座第60页