微生物工程教案

《微生物工程》教案授課教師：张愛梅西北師范大學生命科學學院2013年4月

課程名称微生物工程課程代码74022718學分2总學時36理论學時36課程性质基础課（）专业必修課（）专业限选課（√）专业任选課（）教學手段多媒体任課教師张愛梅职称副教授授課時间2012~2013學年第壹學期授課對象2010级生物技术1班教學目的与要求通過系统地讲授微生物工程的原理、方法、生产设备、应用及进展，使生物技术专业类的學生對微生物工程的最新成就、原理和生产方法等有较全面地了解，扩大學生眼界，使其能够更加适应市場經济的需要。通過本課程的學习使學生将理科的有关知识与必要的工程技术有机的結合起来，使學生既能掌握比较专业的理论知识，又能掌握工程技术方面的基本计算和设计工艺流程的原理和方法。教學基本要求掌握微生物工程的基本原理及规律，熟悉微生物工程生产的常用设备，使學生既學到比较专业的微生物學理论知识，又掌握工程技术方面的基本计算和设计工艺流程的原理和方法。教材曹軍卫主编《微生物工程》（第二版）主要参考资料《微生物工程》(吴松刚）科學出版社2004《微生物工程工艺原理》(姚汝华)华南理工大學出版社2005《新编生物工艺學》（俞俊棠）化學工业出版社2003《发酵工艺原理》（熊宗贵）中国药科大學出版社2000《发酵工程与设备》（邱立友）中国农业出版社2007《現代生物工艺學》（储炬）华東理工大學出版社2008《微生物发酵過程多尺度研究与优化》（张嗣良）化學工业出版社2003《FermentationMicrobiologyandBiotechnology》(E.M.T.El-Mansi,C.F.A.Bryce,ArnoldL.Demain)Taylor&Francis2011院系审阅意見系主任签字：年月曰教學内容与學時分配教學時数教學内容讲課实验小计备注绪论2學時2學時实验課單独開设第壹章菌种的来源2學時2學時第二章优良菌种的选育2學時2學時第三章菌种保藏的原理及方法1學時1學時第四章微生物的代謝调节和代謝工程3學時3學時第五章微生物发酵培养基2學時2學時第六章发酵工艺控制8學時8學時第七章发酵過程的参数检测2學時2學時第八章微生物反应动力學3學時3學時第九章培养基灭菌及灭菌设备3學時3學時第拾章发酵设备3學時3學時第拾壹章发酵设备過程的优化与放大概论2學時2學時第拾二章空气除菌设备2學時2學時第拾三章微生物工程展望1學時1學時

绪论1.1发酵及发酵工程壹.发酵的定义1，发酵壹詞的来源“发酵”（Fermentation）壹詞是拉丁語“沸腾”（fervere）的派生詞，它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液時产生气泡的現象。产生气泡的現象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。2，狭义“发酵”的定义在生物化學或生理學上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的壹种方式，或者更严格地說，发酵是以有机物作為電子受体的氧化還原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。同時获得能量，丙酮酸被還原為乳酸而获得能量等等。3，广义“发酵”的定义工业上所称的发酵是泛指利用生物(微生物或动植物)细胞制造或生产某些产品的過程，它包括厌氧培养的生产過程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气（有氧）培养的生产過程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品既有细胞代謝产物，也包括菌体细胞、酶等。4，发酵工程的定义1）国际纯粹及应用化學联合會(1981年)将生物化學、生物學、微生物學和化學工程应用于工业生产過程（包括醫药卫生、能源及农业产品）及环境保护的技术2）.国际經济及合作发展组织(1982年)应用自然科學及工程學原理、依靠生物作用剂（Biologicalagents）的作用将物料进行加工以提供产品或為社會服务的技术3）.MurryMoo-Young（1985年）對生物作用和生物物料加以评价和利用，并进行工业产品生产的技术4）.Higgins生物系统或生物過程的工业利用，它很大程度上取决于對生物系统及其催化作用专门知识的认识。发酵工程（FermentationBiotechnology）应用微生物學等相关的自然科學以及工程學原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社會性服务的壹门科學。发酵過程的组成部分1．发酵過程的组成繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份确定；培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；培养出有活性、适量的纯种，接种入生产的容器中；微生物在最适合于产物生長的条件下，在发酵罐中生長；产物提取和精制；過程中排出的废弃物的处理。3．发酵生产的条件某种适宜的微生物保证或控制微生物进行代謝的各种条件（培养基组成，温度，溶氧pH等）进行微生物发酵的设备提取菌体或代謝产物，精制成产品的方法和设备发酵工程的地位1.生物工程重要的组成部分发酵工程(Fermentation)酶工程(蛋白质工程)(Enzymeengineering&Proteinengineering)基因工程(Geneticengineering)细胞工程(Cellengineering)2.生物工程中其他技术产业化表达的重要手段基因工程菌动植物细胞培养3.生命科學研究的對象或载体地位基因工程细胞工程酶工程发酵工程二．发酵工程的特點发酵和其他化學工业的最大区别在于它是生物体所进行的化學反应。其主要特點如下：1．发酵過程壹般来說都是在常温常压下进行的生物化學反应，反应安全，要求条件也比较简單。2．发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品為主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于這—特性，可以利用废水和废物等作為发酵的原料进行生物资源的改造和更新。3．发酵過程是通過生物体的自动调节方式来完成的，反应的专壹性强，因而可以得到较為單—的代謝产物。4．发酵過程中對杂菌污染的防治至关重要。除了必须對设备进行严格消毒处理和空气過滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的經济损失，要是感染了噬菌体，對发酵就會造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。5．由于生物体本身所具有的反应机制，能够专壹性地和高度选择性地對某些较為复杂的化合物进行特定部位地氧化、還原等化學转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。6．微生物菌种是进行发酵的根本因素，通過变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。7．工业发酵与其他工业相比，投资少，見效快，開可以取得显著的經济效益。三、发酵的类型1．按发酵原料来区分糖类物质发酵石油发酵废水发酵2．按发酵形式来区分固态发酵深层液体发酵3．按发酵产物区分氨基酸发酵有机酸发酵抗生素发酵酒精发酵维生素发酵酶制剂发酵4．按发酵工艺流程区分分批发酵连续发酵流加发酵5．按发酵過程中對氧的不同需求来分厌氧发酵通風发酵发酵产品的类型工业上的发酵，有四個主要类别：壹、菌体工业生产的微生物体，可分為二种：1．供制备面包用的酵母；2．作為人类或动物的食物的微生物细胞（單细胞蛋白质）。二、微生物的酶工业上，曾由植物、动物和微生物生产酶。微生物的酶可以用发酵技术大量生产，是其最大的优點。而且与植物或动物相比，改进微生物的生产能力也方便得多。酶的生产是受到微生物本身严格控制。為改进酶的生产能力可以改变這些控制，如在培养基中加入诱导物和采用菌株的诱变和筛选技术，以消除反馈阻遏作用。三、微生物代謝产物1．代謝产物的类别初级代謝产物：氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。次级代謝产物：有些微生物的稳定期培养物中所含有的化合物，并不在营养期時出現，而且未見到對细胞代謝功能有明显的影响。例如，抗生素。2．初级代謝产物及其在工业上的应用（1）第壹個阶段（19世纪以前）产品只限于含酒精饮料和醋古埃及已經能酿造啤酒（2）第二個阶段（1900年~1940年）主要的新产品是酵母、甘油、柠檬酸、乳酸、丁醇和丙酮在面包酵母的生产中首先采用了分批补料培养技术在壹次大战時，Weizmann開拓了丁醇丙酮发酵，并建立了真正的无杂菌发酵（3）第三個阶段（1940年以後）這以阶段的標志是，在纯种培养技术下，以深层培养生产青霉素解决向培养基中通入大量无菌空气和高粘度培养液的搅拌問題（4）第四個阶段（1960年以後）以烃為碳源生产微生物细胞作為饲料蛋白质的来源出現了不需要机械搅拌的高压喷射和强制循环的发酵罐工业上普遍采用分批培养和分批补料培养法（5）第五個阶段（1979年以後）這個阶段以基因工程产品的生产為標志。目前，世界上已經批准上市的基因工程药物就有几拾种，如：胰岛素、人生長激素等等。3．工业化成功利用催化生产的有机化合物4．微生物酶促转化与化學合成有机結合5，現代生物技术的发展1.2发酵工程的应用壹．发酵工程在食品,轻工业领域的展望高产菌种和特殊环境微生物的遗传育种新酶品种開发和应用食品添加剂新品种開发和应用生物技术产物工业规模的分离和提取二．发酵工业范围1.酿酒工业(啤酒、葡萄酒、白酒等)2.食品工业(酱、酱油、醋、腐乳、面包、酸乳等)3.有机溶剂发酵工业(酒精、丙酮、丁醇等)4.抗生素发酵工业(青霉素、链霉素、土霉素等)5.有机酸发酵工业(柠檬酸、葡萄糖酸等)6.酶制剂发酵工业(淀粉酶、蛋白酶等)7.氨基酸发酵工业(谷氨酸，赖氨酸等)8.核苷酸类物质发酵工业(肌苷酸、肌苷等)9.维生素发酵工业(维生素、维生素等)10.生理活性物质发酵工业(激素、赤霉素等)11.微生物菌体蛋白发酵工业(酵母、單细胞蛋白等)12.微生物环境净化工业(利用微生物处理废水、污水等)13.生物能工业(沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等，能源物质)14.微生物冶金工业(利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等)三．发酵产品的应用领域1，醫药2，食品3，化工4，纺织5，轻工6，环保四．发酵罐等生物反应器规模谷氨酸100~200m3最大660m3啤酒600m3（露天）柠檬酸220m3酶制剂90m3酵母培养罐170m3黄酒200m3酒精5×1500m3五．国外发酵工业的发展趋势1．生物转化（或生物合成）技术成為国外著名化學公司争夺的热點，并逐步從醫药领域逐渐向化工领域转移2．生物催化合成已成為化學品合成的支柱之壹3．利用生物技术生产有特殊功能、性能、用途或环境友好的化工新材料，是化學工业发展的壹個重要趋势。4．传统的发酵工业已由基因重组菌种取代或改良。許多传统的发酵工程产品如柠檬酸、青霉素等都已開始采用基因工程手段进行改造，大大地提高了产量。在以基因工程為主导的現代生物技术产品中，醫药生物技术产品占75％左右。六．国内发酵工业的发展概况我国传统发酵历史悠久，在《黄帝内經素向》、《汤液醪醴论》里，已有酿酒的记载。白酒的起源，當在元朝以前，尚待考证。酱油的酿造，當始自周朝。在汉武帝時代開始有了葡萄酒，距今已有两仟多年的历史。数仟年来由于科學技术进步缓慢，各种微生物工业也未能充分发展。直到20世纪中期才建立了壹系列新的微生物工业。近几年来，由于生物新技术的应用，发酵工业開始进入新的发展時期。1．白酒中国的酿酒业，距今已有数仟年的历史渊源。白酒是我国特有的、具有悠久历史的传统酒种。1949年新中国成立時，我国白酒的产量只有10．8萬t。1996年，我国白酒产量达到历史高峰，总量达到801．30萬t。目前，我国白酒的产量為400余吨。2．黄酒黄酒是我国最古老的酒种，早在夏、商、周三代就已經大量生产了，并流传至今，据史料记载已有6000年左右了。目前年产量為130萬吨左右。3．啤酒1900年我国最早的啤酒厂于哈尔滨建成1915年国人投资的双合盛啤酒厂建成1949年啤酒产量仅七仟余吨1981年啤酒产量增至91萬吨2001年产量达到2200萬吨左右4．葡萄酒1892年华侨张弼士在烟台建立酿酒公司，這是我国第壹個新型的葡萄酒酿造厂目前我国葡萄酒工厂已有近八拾家葡萄酒年产量约30萬吨张裕、王朝、長城三家公司占据50.6％的市場份额，销售收入占整個行业的61.9％5．酱油和醋早在三仟年前便已掌握了酱油和醋发酵的技法，数仟年来壹直沿用自然发酵法，直到20世纪後才開始采用纯种培养培养技术生产，目前设备及酿造方法逐步实現了現代化酱油年产量约為450萬吨，已居世界首位醋年产量约為250萬吨6．酒精二拾世纪初期，外商在東北设立哈尔滨和阿城两個酒精厂1922年山東溥益酒精厂成立，為第壹個由国人设立的酒精厂1934年华侨投资在上海浦東设立中国酒精厂，當時号称远東第壹大型酒精厂酒精年产量解放前仅1萬吨左右。7．酶制剂1964年才在无锡建立了第壹個酶制剂工厂目前有酶制剂生产厂家40家左右，其中萬吨以上，销售额2000萬以上有8家，其余均在萬吨以下目前的年产量為22萬吨左右8．柠檬酸1953年我国曾进行浅盘发酵制柠檬酸的中型生产1965年前後由上海酵母厂首先采用深层发酵法，由薯干直接发酵生产柠檬酸生产能力為35萬t/a，实际产量达25萬t/a左右，出口量居世界第壹位9.微生物制药在上海建立了第壹個抗生素工厂(即後来的上海第三制药厂)，以生产青霉素為主1958年我国最大的抗生素工厂——华北制药厂亦正式投入生产10．味精1964年我国谷氨酸发酵研究成功，首先在上海投入生产味精生产萬吨以上产量的工厂有17家最大规模是周口莲花味精集团公司，年产12萬吨目前年产量60多萬吨11．基因工程产品至1998年，已有14种基因工程药物、3個基因工程疫苗和数拾個重组诊断试剂投放市場12．细胞工程产品紫草、三七等等植物细胞已可在发酵罐种大规模培养。我国的传统中药涉及5000种左右植物，细胞培养是中药资源開发的壹個重要方面。七．我国发酵工业的主要进步1.发酵产品增長快、质量明显提高，在国民經济中起重要作用新型发酵工业：年产量115萬吨；产值150亿；利税50亿。酿酒工业（不包括酒精）：年产量2000萬吨左右；产值450亿；利税120亿。2.科技进步，技术水平提高例如：糖化酶的发酵液酶活力由7000u／ml提高至30000-40000u／ml；味精和柠檬酸三個主要指標：产酸率、转化率和提取率提高5%左右。3.积极開发新产品特鲜味精；无水柠檬酸、柠檬酸盐；高温α-淀粉酶；纤维素酶；β-葡聚糖酶；异淀粉酶等酶制剂；L壹苹果酸；L壹乳酸；衣康酸；黄原胶;功能性发酵制品:r-亚麻酸；冬虫夏草；蘑菇、灵芝多糖;活性肽；紅曲色素,低聚异麦芽糖、果糖、半乳糖、木糖；海藻糖等等。八．与国际先进水平的差距1．多数工厂规模小、效益低2．生产技术水平比较低3．产品品种單壹，結构不合理4．应用的深度和广度不够5．技术装备和检测手段落後，自动化水平低6．综合利用和环境治理差九、加入WTO對我国发酵行业的影响1．有利因素主要表現我国加入WTO後，是世贸组织的壹個成员，可以同等享受最惠国待遇国民待遇也是世贸组织的壹個重要原则加入世贸组织，對企业引进外资和先进技术和先进装备以及管理經验，加速企业改组改造，进行企业結构和产品結构调整，促进企业的进壹步发展有利中国加入WTO後，关税进壹步降低中国加入WTO後，发酵企业對原料的选择性范围宽了2．不利因素主要表現：對原料产区形成卖粮难国外先进国家技术水平高，产品质量好、成本低，對国内同类产品冲击较大我国研究力量薄弱，研究手段相對落後，综合素质较差3．应對措施：加快技术进步步伐，走创新之路，提高水平，降低成本调整企业結构和产品結构提高企业领导經营管理水平，加强产品质量管理和产品標准化工作加强国内国际之间的技术交流和合作，引进入才、引进外资、引进先进技术和装备发挥各行业的优势和特點，摘出本企业有特色的产品，以提高竞争力发酵工程的重大转折點二拾世纪四拾年代初，第二次世界大战爆发，青霉素的发現，迅速形成工业大规摸生产。1928年由Fleming发現青霉素1941年美国和英国合作對青霉素进行生产研究表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基───40u/ml1943年沉浸培养：5m3───200u/ml當今：100m3─200m3───5-7萬u/ml链霉素、金霉素、新霉索、紅霉素大型发酵罐搅拌装置180M3发酵罐車间发酵車间的空气過滤器現代生物技术──分子生物學

与发酵工程氨基酸发酵工业──谷氨酸、赖氨酸核酸发酵工业──肌苷酸、乌苷酸微生物变异株通過代謝调节──代謝控制发酵技术切断支路代謝转折點:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏)→解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用,突变株的应用,前体、终产物、副产物等发酵工程产业化发展目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约7％～8％的速率增長。我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术給人类社會生产力的发展带来了巨大的潜力21世纪是生物技术世纪未来學家說：21世纪是生物技术世纪；科學家预言：21世纪世界即将在生物技术上取得重大突破，新世纪之初，科學方面的主要将在生物學、遗传學和醫學、新型生物材料、能源、环境保护上有所突破；經济學家则认為：21世纪20年代，生物經济将由目前的形成阶段进入成長阶段，即工业生产与商业開发阶段。1.3发酵工程的生物學与工程學基础发酵工程的主要問題-----過程优化与放大在已提供高产菌株的基础上，如何把這些高产菌种在培养過程中进壹步考察它的生理生化特性，稳定或改进微生物反应工艺過程，這里要求對生物物性的动态有详尽的了解，對生化反应做定量的和动力學方面的考察。发酵工程在生物技术产业发展中的地位21世纪的工业生物技术产业，究竟是壹個什么样的格局？作為工业生物技术核心的发酵工程，在已經開始的生物經济時代，是处于壹种什么状态？能起何种作用？又面临那些課題？這是人們所关注的問題！1.4本課程的學习内容通過《发酵工程》的學习，将技术基础課和专业課与发酵工业的操作原理結合起来，了解发酵工业控制的特性及共性，并且熟悉发酵工业的工艺流程及常用术語，為今後從事生物工程的有关科研和生产打下良好的基础。

第二章菌种的来源及选育第壹节微生物的特性及工业微生物的要求壹.微生物的特性二、发酵工业常用微生物的形态特征1.细菌（Bacterium)（1）形态（2）結构（3）培养特征2.酵母（Yeast)（1）形态（2）結构典型結构:细胞壁；细胞膜；细胞核；液泡；线粒体；内质网；核糖体；微体；微丝；内含物3.霉菌——形态4、微生物的特點体积小；种类多；分布广；繁殖快；便于培养；容易发生变异；在生产中不易受時间、季节、地区的限制5、微生物与发酵发酵工程是以微生物的生命活动為中心的微生物的生物學性状和发酵条件决定了其相应产物的生成工业上用的全部微生物都称為工业微生物，工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌由于发酵工程本身的发展以及基因工程正在进入发酵過程，病毒、藻类等其它微生物也正在逐步地变為工业生产菌。三．工业化菌种的要求能够利用廉价的原料，简單的培养基，大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简單，或者說菌种改造的可操作性要强遗传性能要相對稳定不易感染它种微生物或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类學上最好与致病菌无关）生产特性要符合工艺要求第二节自然界中有目的微生物分离的原则壹、菌种分离的壹般過程二、采样時要注意的問題三、目的微生物富集的壹些基本方法四、菌落的选出第三节已工业化产品生产菌的介绍壹、抗生素生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物三、食品酶制剂生产有关的微生物第四节优良菌种选育壹、自然选育二、诱变育种诱变育种的壹般步骤出发菌株↓纯化、活化、前培养（同步培养）培养液↓离心收集细胞、洗涤，制备均壹的菌悬液（玻璃珠打散、過滤）單细胞或單孢子悬液↓活菌计数，诱变预备试验诱变处理↓活细胞计数，致死率计算後培养（中间培养）↓平板分离↓变异率计算初筛→复筛→保藏及扩大试验诱变育种工作中应注意的問題1.安全問題：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应時刻注意安全問題：個人安全和环境安全。個人安全：操作時注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如γ-射线辐射防护要求较高，uv要求较低，而化學诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触。环境安全：所用物品要經解毒处理；液体經解毒或充分稀释才可以排放。2.要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。3.诱变育种技术要和其他育种手段相結合。4.诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量拾分大，因此要對整個工作进行合理的设计并結合新技术提高其工作效率。第五节营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型是壹种生化突变株，它的出現是由基因突变引起的。遗传信息的载体是壹系列為酶蛋白编码的核酸序列，如果核酸序列中的某碱基发生突变，由该基因所控制的酶合成受阻，该菌株也因此不能合成某种营养因子，使正常代謝失去平衡。在筛选营养缺陷型菌株中，与之有关的培养基有三类：完全培养基：CompleteMedium（CM）含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生長所需营养物质的天然或半合成培养基。基本培养基：MinimalMedium（MM）：不含生長因子仅能满足某微生物的野生型菌株生長需要的最低成分合成培养基。补充培养基：SupplementedMedium(SM)：补充了壹种或数种生長因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生長的培养基，其中的生長因子多是通過直接添加AA、碱基或维生素而提供。

第三章菌种保藏的原理和方法壹．原理使微生物的代謝处于最不活跃或相對静止的状态，才能在壹定的時间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥、寡营养和隔绝空气二．防止菌种衰退的方法控制传代次数选择合适的培养条件利用不同类型的细胞进行传代选择合适的保藏方法三．菌种保藏法斜面保藏法(传代培养保藏法)是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生長充分後，于4～6℃进行保存并间隔壹定時间进行移植培养的菌种保藏方法。液体石蜡保藏法(矿物油保藏法)是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种長出健壮菌落後注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整個斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的壹种菌种保藏方法。穿刺保藏法1%软琼脂小试管和螺口小管沙土管保藏法将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液，注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干後熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室温进行保存的壹种菌种保藏方法。真空冷冻干燥保藏法将微生物冷冻，在減压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，從而長期维持存活状态。液氮超低温保藏液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的氮气中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代謝趋于停止而有效地保藏微生物。-20℃低温冷冻保藏将菌种保藏在-20℃冰箱中以減缓细胞的生理活动进行冷冻的壹种保藏方法。四．菌种保藏机构CCGMC:AS-1,2,3,4,IVACCC:ISFCICC:IFFICMCC:NICPBP,ID,IVCACC

第四章微生物的代謝调节与代謝工程第壹节代謝调节的方式1，细胞透性的调节 细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代謝产物的分泌， 從而 影响到细胞内代謝的变化。 细胞质膜的透性的调节是微生物代謝调节的重要方式， 由它控制著营养物质的吸收。2，代謝途径区域化 原核微生物细胞結构虽然简單， 但也划分出不同 的区域， 對于某壹代謝途径有关的酶系则集中在某壹区域， 以保证這壹代謝途径的酶促反应顺利进行， 避免了其他途径的干扰。› 例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上；而› 与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋白体上；分解大分子的水解酶，› 在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中，而› 革兰氏阳性菌则将這些水解酶类，› 分泌于胞外。 在真核微生物细胞里， 各种酶系被细胞器隔离分布。 如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA合成的某些酶位于细胞核里。 细胞具有复 杂的結构使其代謝活动只能在特定的部位上进行， 即代謝活动是区域化的， 其实质是控制酶与底物接触， 使各個反应有序地进行。3，代謝流向的调控 微生物在不同 条件下可以通過控制各代謝途径中某個酶促反应的速率来控制代謝物的流向， 從而 保持机体代謝的平衡。它包括两种形式: 由壹個关键酶控制的可逆反应 由两种酶控制的逆單向反应由壹個关键酶控制的可逆反应:同壹個酶可以通過不同辅基(或辅酶)控制代謝物的流向。› 例如，› 谷氨酸脱氢酶以NADP+為辅酶時，› 主要是催化谷氨酸的合成，› 當以NAD+為辅酶時，› 则催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通過不同› 的辅基来控制代謝物的流向。由两种酶控制的逆單向反应:逆單向反应是在生物体代謝的关键部位的某些反应，它是由两种各自不同的酶来催化的。即在壹個“可逆”反应中，其中壹种酶催化正反应，而另壹种酶则催化逆反应。 例如，› 葡萄糖转化為6-磷酸葡萄糖是由已糖激酶催化的，而› 其逆反应则是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖转化為1，› 6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，› 逆反应则由1，› 6-二磷酸果糖酯酶催化。4，代謝速度的调控 在不 可逆反应中， 微生物通過调节酶的活性和酶量来控制代謝物的流量。 微生物在不同 条件下能按照需要， 通過激活或抑制原有酶的活性或通過诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代謝速度， 使之高度經济有效地利用能量和原料进行生長繁殖。二、酶活性的调节1.概念 酶活性调节是指 壹定数量的酶， 通過其分子构象或分子結构的改变来调节其催化反应的速率。2.酶活性调节的影响因素 底物和产物的性质和浓度 环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等) 其他酶的存在3.酶活性调节的调节方式 激活已有酶的活性-----激活剂 抑制已有酶的活性-----抑制剂4.酶活性的调节机制改变酶分子的活性来调节微生物代謝速度的办法称為酶活性的调节。其活性发生改变的酶称為调节酶（Regulatoryenzyme）。调节酶也称关键酶，包括变构酶、同功酶和多功能酶，通常為变构酶，壹般具有多個亚基，包括催化亚基和调节亚基。微生物体内代謝過程的各种生物化學反应，都是由各种酶来催化的。按各种酶在代謝调节中作用的不同，又可将酶分為：①调节酶(常称关键酶，与代謝调节关系密切)：包括以下3种：1)变构酶：壹般是具有多亚基四级結构的蛋白质。2)同功酶：具有同壹种酶的底物专壹性，但分子結构不同的壹类酶。3)多功能酶：能够催化两种以上不同反应的酶。②静态酶：壹般与代謝调节关系不大。③潜在酶：指酶原、非活性型或与抑制剂結合的酶。（壹）激活 激活：在激活剂的作用下， 使原来无活性的酶变成有活性， 或使原来活性低的酶提高了活性的現象。 代謝调节的激活作用：主要是指 代謝物對酶的激活。 前体激活， 指 代謝途径中後面的酶促反应， 可被该途径中较前面的壹個中间产物所促进。 代謝中间产物的反馈激活， 指 代謝中间产物對该代謝途径的前面的酶起激活作用。（二）抑制 抑制：由于某些物质的存在，降低酶活性的現象。 反馈抑制：反馈抑制是指代謝的末端产物對酶(往往是代謝途径中的第壹個酶)活性的抑制。1，无分支代謝途径的调节 通常是在线形的代謝途径中末端产物對催化第壹步反应的酶活性有抑制作用。2，有分支代謝途径的调节 在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代謝途径中，调节方式较复 杂， 其共同 特點是每個分支途径的末端产物控制分支點後的第壹個酶，同 時每個末端产物又對整個途径的第壹個酶有部分的抑制作用， 分支代謝的反馈调节方式有多种:酶的顺序反馈抑制同工酶的反馈抑制 协同反馈抑制 累积反馈抑制 超相加反馈抑制（1）酶的顺序反馈抑制 分支代謝途径中的两個末端产物， 不 能直接抑制途径中的第壹個酶， 只有當两個末端产物都過量時， 才能對途径中的第壹個酶有抑制作用。（2）同工酶的反馈抑制同功酶是指能催化同壹生化反应，但它們的結构稍 有不同， 可分别被相应的末端产物抑制的壹类酶。其特點是：途径中第壹個反应被两個不同 的酶所催化， 壹個酶被Y抑制， 另壹個酶被Z抑制。只有當Y和Z同 時過量才能完全阻止A转变為B。（3）协同反馈抑制 在分支代謝系统中， 几种末端产物同 時都過量， 才對途径中的第壹個酶具有抑制作用， 如果末端产物單独過量则對途径中的第壹個酶无抑制作用。（4）累积反馈抑制 在分支代謝途径中各种末端产物單独過量時， 它們各自能對途径中的第壹個反应的酶仅产生较小的抑制作用。壹种末端产物單独過量并不 影响其它末端产物的形成， 只有當几种末端产物同 時過量時， 才對途径中的第壹個酶产生较大的抑制。（5）超相加反馈抑制 超相加反馈抑制是壹种既不同 于协同 反馈抑制又不同 于累积反馈抑制的作用。對壹個分支代謝途径中， 几种末端产物單独過量時， 仅产生對共同 途径的第壹個酶部分的抑制。如果每种末端产物都過量時， 其抑制作用则超過各种末端产物單独過量時抑制的总和。5，酶活性调节的分子机制 解释酶活性调节机制的理论： 别构调节理论(其核心是酶分子构象的改变) 酶分子的化學修饰理论(其核心是酶分子結构的改变)。三、酶合成的调节 1.酶合成的诱导：促进酶的合成. 2.酶合成的阻遏：抑制酶的合成.包括：1)终产物阻遏。2)分解代謝物阻遏。1.酶合成的诱导1).诱导酶:當环境中存在诱导剂時才产生的酶。而這种环境物质促使微生物细胞中酶合成的現象称為酶的诱导。2).组成酶:(p26)----EMP2，酶合成诱导的机制 诱导机制:操纵子學說可以较好的說明酶的诱导产生的机制， 操纵子指 壹组功能上相关的基因， 它們由启动基因、操纵基因和結构基因构成。3，酶合成的阻遏1).末端代謝产物阻遏（End-productrepression）這是酶合成阻遏中的壹种。它是指由于末端产物的過量积累而引起代謝途径中酶合成的阻遏，是壹种反馈阻遏，末端代謝产物阻遏的特點是同時阻遏合成途径中所有酶的合成。對于分支代謝途径的末端代謝产物阻遏，每种末端产物只专壹地阻遏合成它自身那条分支途径的酶，而分支點的酶则受所有分支途径末端产物的共同阻遏。這种几個终产物，共同协调阻遏某壹個酶的生物合成称為多价阻遏（multivalentrepression）。對于直线式代謝途径，末端产物阻遏情况较為简單。末端产物将引起代謝途径中各种酶的合成终止。末端代謝产物阻遏的机制可以用操纵子學說解释。如大肠杆菌色氨酸操纵子模型。2).酶合成的分解代謝物阻遏（Cataboliterepression）所谓分解代謝阻遏，是當细胞中具有壹优先利用的底物時，很多其他分解反应途径往往受到最容易利用的底物阻遏的現象。由于這种阻遏并不是优先利用底物及作用的結果，而是有底物分解過程中产生的中间代謝物引起的，所以称為分解代謝物阻遏。這种阻遏效应最早在1942年由Monod在研究大肠杆菌混合碳源生長時发現。經研究发現，在微生物的生長体系中，外加CAMP（环腺苷酸）可解除分解代謝物阻遏，這表明分解代謝物阻遏的实质是由于细胞内缺少CAMP。分解代謝物阻遏作用是发生在转录水平上的，因而属于转录水平的调节。Monod提出的乳糖操纵子模型可以较好地解释分解代謝物的阻遏机制。葡萄糖效应又称葡萄糖阻遏或分解代謝产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代謝产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的現象。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就壹直被阻遏，乳糖不能被利用，這是因為葡萄糖的分解物引起细胞内cAMP（环腺苷酸）含量降低，启动子释放cAMP-CAP蛋白，RNA聚合酶不能与乳糖的启动基因結合，以至转录不能发生，直到葡萄糖被利用完後，乳糖操纵子才进行转录，形成利用乳糖的酶，這种現象称葡萄糖效应。 CAP：降解物激活蛋白又叫分解代謝基因活化蛋白cataboliteactivatorprotein，简称CAP。在分解代謝阻遏中调节基因的产物是降解物基因活化蛋白（CAP），它能与环腺苷酸（cAMP）結合而被活化，幫助RNA聚合酶与启动子結合，促进转录进行。4，酶合成阻遏的机制四、能荷调节

能荷:指细胞中ATP,ADP,AMP系统中可為代謝反应供能的高能磷酸键的量度。能荷=(【ATP】+0.5【ADP】)／(【ATP】+【ADP】+【AMP】)×100％能荷=100％全部是ATP能荷=0％全部是AMP能荷=50％全部是ADP(三)、次级代謝的调节 初级代謝對次级代謝的调节 碳代謝物的调节作用 氮代謝物的调节作用 磷酸盐的调节作用 次级代謝中的诱导作用及产物的反馈作用 次级代謝中细胞膜透性调节(四)、次级代謝物合成的特點 次级代謝物合成過程远较初级代謝产物复杂； 次级代謝产物则需要复 杂的营养条件； 在分批培养条件下， 次级代謝产物壹般都是在菌体生長的峰值出現後才大量合成。(五)、常用的提高次级代謝产物产量的方法(1)补加前体类似物• 前体：指• 某些化合物加入到发酵培养基中，• 能直接被微生物在生物合成過程中合成到产物物分子中去，而• 其自身的結构并没有多大变化，• 但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 在合成途径已基本清楚的条件下， 向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。› 如青霉素G的生产中，› 苯乙酰-CoA是限速性因子，› 补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。 次级代謝产物形成中并不 是所有前体类似物都是限制性因子。加入前体提高产量的效果更取决于总体代謝的调节水平。前体物质本身是否易于得到等。這都是在生产应用中需综合考虑的。(2)加入诱导物 把壹些對次级代謝产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中會增加产量。› 如加蛋氨酸或硫脲可使顶頭孢霉增产頭孢霉素C，› 加入巴比妥可提高利福霉素产量等。但在工业生产中還未普遍应用此技术，而› 只是在选择培养基组成時給以考虑。 目前工业用微生物酶多数為诱导酶， 如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。 诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。 酶的正常底物或底物的类似物都可作為诱导物。(3)防止碳分解代謝阻遏或抑制的发生 青霉素发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以減少碳分解阻遏的发生， 是壹项很有效的提高产量的方法。 使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源， 葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用， 也都能減少碳分解阻遏的发生。 加入影响糖代謝的硫氰酸苄酯可使金霉菌對葡萄糖的利用速度減缓， 可增加金霉素的产量。(4)防止氮代謝阻遏的发生 避免使用高浓度的铵盐做氮源以防止氮代謝阻遏的发生， 是抗生素发酵工业生产中比较成熟的經验。在抗生素产生期如补加氮源则會造成发酵逆转， 返回生長期， 抗生素的产量會大為減少。 使用亚适量(對菌体生長)的磷酸盐， 亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之壹。 為防止碳、氮、磷分解阻遏的发生， 应选用黄豆饼粉、蛋白胨类、淀粉类物质為主要原料，而 尽量少用易被迅速利用的葡萄糖等。(5)筛选耐前体或前体类似物的突变株 加入前体有提高次级产物产量的效果；但過量對菌体又會有毒。筛选對前体有抗性的突变株以減少或消除前体的反馈阻遏， 從而 可获得高产。› 如抗苯乙酸的青霉突变株，› 其青霉素的产量會增加。› 半胱氨酸、缬氨酸是β-内酰胺类抗生素的前体，› 筛选上述氨基酸的类似物，› 三氟亮氨酸、DL—缬氨酸的抗性菌株，› 其β-内酰胺类抗生索产量會提高。(6)选育抗抗生素突变株 链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。壹株高产抗生索产生菌， 必然应具备 對自身所分泌的抗生索的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株产量有数倍 增加的实验室結果已有不 少报道。(7)筛选营养缺陷型的回复突变株 次级代謝产物都来自初级代謝产物， 因此其营养缺陷型的产量壹般都很低， 但其回复 突变型中却有不 少获得高产的例子， 其机制尚不 清楚， 估计是次生产物或其前体合成的反馈抑制被解除。在金霉素产生菌选育中， 运用此方法曾获得高产菌株。(8)抗毒性突变株的选育 重金属离子、羟胺类物质對β-内酰胺类抗生素产生菌有毒， 但与抗生素相結合可解毒。选择适當浓度的此类毒性物质使其恰好抑制产生菌生長， 在此条件下能生長的菌株， 应為抗生素类物质過量产生的突变株。曾由頭孢霉素C對重金属离子的抗性突变株中选育到高产菌株。 有些种类的发酵生产對金属离子相當敏感，因為有些金属离子是中间代謝酶的抑制剂或激活剂。 因此對于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子對细菌淀粉酶的生产有促进作用，而钴离子對葡萄糖异构酶的发酵是必需的，這些在培养基配制時都必须予以注意。小結： 以上主要是從微生物的代謝调节机制出发探讨获得代謝产物過量生产的方法。但是， 微生物代謝产物特别是次级产物形成的途径和调节控制机制是相當复杂的，研究得比较清楚的只是少数。因此，上述方法的应用往往也是經验性的。 在生产实践中為提高微生物产品产量和品质經常使用的方法是诱变後随机筛选和发酵条件的优化。近年来运用遗传工程的方法以获得代謝产物的過量生产是很活跃的研究领域。

第五章培养基培养基（medium）是人工配制的,适合微生物生長繁殖或产生代謝产物的营养基质。无论是以微生物為材料的研究,還是利用微生物生产生物制品,都必须进行培养基的配制，它是微生物學研究和微生物发酵工业的基础。壹、配制培养基的原则1.选择适宜的营养物质总体而言,所有微生物生長繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生長因子、水及能源,但由于微生物营养类型复杂,不同微生物對营养物质的需求是不壹样的,因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针對性强的培养基。自养型微生物能從简單的无机物合成自身需要的糖、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物,因此培养自养型微生物的培养基完全可以(或应该)由简單的无机物组成。例如,培养化能自养型的氧化硫硫杆菌(Thiobacillusthiooxidans)的培养基组成見表4-10。在该培养基配制過程中并未专门加入其他碳源物质,而是依靠空气中和溶于水中的CO2為氧化硫硫杆菌提供碳源。表4-10几种类型培养基组成成份氧化硫硫杆菌培养基大肠杆菌培养基牛肉膏蛋白胨培养基高氏壹号合成培养基查氏合成培养基LB培养基主要作用牛肉膏

5

碳源（能源）、氮源、无机盐、生長因子蛋白胨

10

10氮源、碳源（能源）、生長因子酵母浸膏

5生長因子、氮源、碳源（能源）葡萄糖

5

碳源（能源）蔗糖

30

碳源（能源）可溶性淀粉

20

碳源（能源）CO2（来自空气）

碳源（NH4）2SO40.4

氮源、无机盐NH4H2PO4

1

氮源、无机盐KNO3

1

氮源、无机盐NaNO3

3

氮源、无机盐MgSO4·7H2O0.50.2

0.50.5

无机盐FeSO40.01

0.010.01

无机盐KH2PO44

无机盐K2HPO41

0.51

无机盐NaCl

550.5

10无机盐KCl

0.5

无机盐CaCl20.25

无机盐S10

能源H2O100010001000100010001000溶剂pH7.0自然7.0

灭菌条件121℃20分112℃30分121℃20分121℃20分121℃20分121℃20分

*表中培养基各组份含量均為每升培养基中该成份的克数。培养其他化能自养型微生物与上述培养基成分基本类似,只是能源物质有所改变。對光能自养型微生物而言,除需要各类营养物质外,還需光照提供能源。培养异养型微生物需要在培养基中添加有机物,而且不同类型异养型微生物的营养要求差别很大,因此其培养基组成也相差很远。例如,培养大肠杆菌的培养基组成比较简單(表4-10),而有些异养型微生物的培养基的成份非常复杂,如肠膜明串珠菌需要生長因子,若配制培养它的合成培养基時,需要在培养基中添加的生長因子多达33种,因此通常采用天然有机物来為它提供生長所需的生長因子。就微生物主要类型而言,有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分,培养它們所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）培养细菌(表4-10);用高氏1号合成培养基培养放线菌(表4-10);培养酵母菌壹般用麦芽汁培养基,它是将麦芽粉与4倍水混匀,在58~65℃条件下保温3~4小時至完全糖化,调整糖液浓度為10о巴林,煮沸後用纱布過滤,调pH為6.0配制而成。麦芽粉组成复杂,能為酵母菌提供足够的营养物质;培养霉菌则壹般用查氏合成培养基(表4-10)。原生动物也可用培养基培养,有的原生动物需要较多的营养物质,例如梨型四膜虫(Tetrahymenapyriformis)的培养基含有10种氨基酸、7种维生素、鳥嘌呤、尿嘧啶及壹些无机盐等,而有些变形虫可在较简單的蛋白胨肉汤(peptonebroth)中生長。大多数藻类可以利用光能,只需要CO2、水和壹些无机盐就可生長,而某些藻类如眼虫藻(Euglena)中的壹些种可在黑暗条件下利用有机物质生長。有些藻类需要在培养基中补加土壤浸液,培养海洋藻类時可直接利用海水,但如果在特殊情况下需要用合成培养基培养海洋藻类時,则必需在培养基中加入海水中含有的各种盐。2.营养物质浓度及配比合适培养基中营养物质浓度合适時微生物才能生長良好,营养物质浓度過低時不能满足微生物正常生長所需,浓度過高時则可能對微生物生長起抑制作用,例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生長,反而起到抑制或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生長繁殖和(或)代謝产物的形成和积累,其中碳氮比(C/N)的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的摩尔数比值,有時也指培养基中還原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的過程中,培养基碳氮比為4/1時,菌体大量繁殖,谷氨酸积累少;當培养基碳氮比為3/1時,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加。再如,在抗生素发酵生产過程中,可以通過控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生長与抗生素的合成。3.控制pH条件培养基的pH必须控制在壹定的范围内,以满足不同类型微生物的生長繁殖或产生代謝产物。各类微生物生長繁殖或产生代謝产物的最适pH条件各不相同,壹般来讲,细菌与放线菌适于在pH7~7.5范围内生長,酵母菌和霉菌通常在pH4.5~6范围内生長。值得注意的是,在微生物生長繁殖和代謝過程中,由于营养物质被分解利用和代謝产物的形成与积累,會导致培养基pH发生变化,若不對培养基pH条件进行控制,往往导致微生物生長速度或(和)代謝产物产量降低。因此,為了维持培养基pH的相對恒定,通常在培养基中加入pH缓冲剂,常用的缓冲剂是壹氢和二氢磷酸盐(如K2HPO4和KH2PO4)组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性,KH2PO4溶液呈酸性,两种物质的等克分子混合溶液的pH值為6.8。當培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加時,H+与弱碱性盐結合形成弱酸性化合物,培养基pH不會過度降低;如果培养基中OH-浓度增加,OH-则与弱酸性盐結合形成弱碱性化合物,培养基pH也不會過度升高。但K2HPO4/KH2PO4缓冲系统只能在壹定的pH范围（pH6.4~7.2）内起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸,上述缓冲系统就难以起到缓冲作用,此時可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进行调节,CaCO3难溶于水,不會使培养基pH過度升高,但它可以不断中和微生物产生的酸,同時释放出CO2,将培养基pH控制在壹定范围内。在培养基中還存在壹些天然的缓冲系统,如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性電解质,也可起到缓冲剂的作用。

4.控制氧化還原電位(redoxpotential)不同类型微生物生長對氧化還原電位(Ф)的要求不壹样,壹般好氧性微生物在Ф值為+0.1伏以上時可正常生長,壹般以+0.3～+0.4伏為宜,厌氧性微生物只能在Ф值低于+0.1伏条件下生長,兼性厌氧微生物在Ф值為+0.1伏以上時进行好氧呼吸,在+0.1伏以下時进行发酵。Ф值与氧分压和pH有关,也受某些微生物代謝产物的影响。在pH相對稳定的条件下,可通過增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压,或加入氧化剂,從而增加Ф值;在培养基中加入抗壞血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等還原性物质可降低Ф值。5.原料来源的选择在配制培养基時应尽量利用廉价且易于获得的原料作為培养基成份,特别是在发酵工业中,培养基用量很大,利用低成本的原料更体現出其經济价值。例如，在微生物單细胞蛋白的工业生产過程中,常常利用糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造紙工业中含有戊糖和已糖的亚硫酸紙浆)等都可作為培养基的原料。再如,工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,而在我国农村，已推广利用人畜粪便及禾草為原料发酵生产甲烷作為燃料。另外,大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。6.灭菌处理要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此對所用器材及工作場所进行消毒与灭菌。對培养基而言，更是要进行严格的灭菌。對培养基壹般采取高压蒸汽灭菌，壹般培养基用1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌過程中，長時间高温會使某些不耐热物质遭到破壞，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常用0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟进行灭菌，對某些對糖要求较高的培养基，可先将糖进行過滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成份混合；長時间高温還會引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)結合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此,在配制用于观察和定量测定微生物生長状况的合成培养基時,常需在培养基中加入少量螯合剂,避免培养基中产生沉淀而影响O.D.值的测定,常用的螯合剂為乙二胺四乙酸(EDTA)。還可以将含钙、镁、铁等离子的成份与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然後再混合，避免形成沉淀；高压蒸汽灭菌後，培养基pH會发生改变（壹般使pH降低），可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前後加以调整。在配制培养基過程中,泡沫的存在對灭菌处理极不利,因為泡沫中的空气形成隔热层,使泡沫中微生物难以被杀死。因而有時需要在培养基中加入消泡沫剂以減少泡沫的产生，或适當提高灭菌温度，延長灭菌時间。二、培养基的类型及应用培养基种类繁多,根据其成份、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。1．按成份不同划分(1)天然培养基(complexmedium)這类培养基主要以化學成分還不清楚或化學成分不恒定的天然有机物组成,牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的LB(Luria-Bertani)培养基也是壹种复合培养基,其组成見表4-10。常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(表4-11)、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡罗卜汁、椰子汁等,嗜粪微生物(coprophilousmicroorganisms)可以利用粪水作為营养物质。复合培养基成本较低,除在实验室經常使用外,也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。表4-11牛肉浸膏、蛋白胨及酵母浸膏的来源及主要成份营养物质来源主要成份牛肉浸膏瘦牛肉组织浸出汁浓缩而成的膏状物质富含水溶性碳水化合物、有机氮化合物、维生素、盐等蛋白胨将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解後干燥而成的粉末状物质富含有机氮化合物、也含有壹些维生素和碳水化合物酵母浸膏酵母细胞的水溶性提取物浓缩而成的膏状物质富含B类维生素,也含有有机氮化合物和碳水化合物(2)合成培养基(syntheticmedium)合成培养基是由化學成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化學限定培养基(chemicallydefinedmedium),高氏1号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基時重复性强,但与天然培养基相比其成本较高,微生物在其中生長速度较慢,壹般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代謝、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。2．根据物理状态划分根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少,可将培养基划分為固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。(1)固体培养基(solidmedium)在液体培养基中加入壹定量凝固剂即為固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件:1.不被所培养的微生物分解利用;2.在微生物生長的温度范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌時,由于高温容易引起培养基液化,通常在培养基中适當增加凝固剂来解决這壹問題;3.凝固剂凝固點温度不能太低,否则将不利于微生物的生長;4.凝固剂對所培养的微生物无毒害作用;5.凝固剂在灭菌過程中不會被破壞;6.透明度好,粘著力强;7.配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂(agar)、明胶(gelatin)和硅胶(silicagel)。表4-12列出琼脂和明胶的壹些主要特征。對绝大多数微生物而言,琼脂是最理想的凝固剂,琼脂是由藻类(海产石花菜)中提取的壹种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物,是最早用来作為凝固剂的物质,但由于其凝固點太低,而且某些细菌和許多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶,目前已较少作為凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠(Na2SiO3)及硅酸钾(K2SiO3)被盐酸及硫酸中和時凝聚而成的胶体,它不含有机物,适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。表4-12琼脂与明胶主要特征比较内容琼脂明胶常用浓度(%)1.5~25~12溶點(℃)9625凝固點(℃)4020pH微酸酸性灰份(%)1614~15氧化钙(%)1.150氧化镁(%)0.770氮(%)0.418.3微生物利用能力绝大多数微生物不能利用許多微生物能利用除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外,壹些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。例如,由馬铃薯块、胡罗卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。在实验室中,固体培养基壹般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基為微生物提供壹個营养表面,單個微生物细胞在這個营养表面进行生長繁殖,可以形成單個菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。(2)半固体培养基(semisolidmedium)半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少,培养基中琼脂量壹般為0.2~0.7%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。(3)液体培养基(liquidmedium)液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物時,通過振荡或搅拌可以增加培养基的通气量,同時使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。3．按用途划分(1)基础培养基(minimummedium)尽管不同微生物的营养需求各不相同,但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有壹般微生物生長繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作為壹些特殊培养基的基础成份,再根据某种微生物的特殊营养需求,在基础培养基中加入所需营养物质。(2)加富培养基(enrichmentmedium)加富培养基也称营养培养基,即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的壹类营养丰富的培养基,這些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基壹般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物,如培养百曰咳博德氏菌(Bordetellapertussis)需要含有血液的加富培养基。加富培养基還可以用来富集和分离某种微生物,這是因為加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质,该种微生物在這种培养基中较其他微生物生長速度快,并逐渐富集而占优势,逐步淘汰其他微生物,從而容易达到分离该种微生物的目的。從某种意义上讲,加富培养基类似选择培养基,两者区别在于，加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生長优势，從而分离到该种微生物；选择培养基则壹般是抑制不需要的微生物的生長，使所需要的微生物增殖，從而达到分离所需微生物的目的。(3)鉴别培养基(differentialmedium)鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化學物质,某种微生物在培养基中生長後能产生某种代謝产物,而這种代謝产物可以与培养基中的特殊化學物质发生特定的化學反应,产生明显的特征性变化,根据這种特征性变化,可将该种微生物与其他微生物区分開来。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代謝产物的微生物菌种。常用的壹些鉴别培养基見表4-13。表4-13壹些鉴别培养基培养基名称加入化學物质微生物代謝产物培养基特征性变化主要用途酪素培养基酪素胞外蛋白酶蛋白水解圈鉴别产蛋白酶菌株明胶培养基明胶胞外蛋白酶明胶液化鉴别产蛋白酶菌株油脂培养基食用油、土温、中性紅指示剂胞外脂肪酶由淡紅色变成深紅色鉴别产脂肪酶菌株淀粉培养基可溶性淀粉胞外淀粉酶淀粉水解圈鉴别产淀粉酶菌株H2S试验培养基醋酸铅H2S产生黑色沉淀鉴别产H2S菌株糖发酵培养基溴甲酚紫乳酸、醋酸、丙酸等由紫色变成黄色鉴别肠道细菌远藤氏培养基碱性复紅、亚硫酸钠酸、乙醛带金属光泽深紅色菌落鉴别水中大肠菌群伊紅美藍培养基伊紅、美藍酸带金属光泽深紫色菌落鉴别水中大肠菌群(4)选择培养基(selectivemedium)选择培养基是用来将某种或某类微生物從混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或對某种化學物质的敏感性不同,在培养基中加入相应的特殊营养物质或化學物质,抑制不需要的微生物的生長,有利于所需微生物的生長。壹种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的,例如，利用以纤维素或石蜡油作為唯壹碳源的选择培养基，可以從混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物;利用以蛋白质作為唯壹氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生物;缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。另壹类选择培养基是在培养基中加入某种化學物质,這种化學物质没有营养作用,對所需分离的微生物无害,但可以抑制或杀死其他微生物,例如,在培养基中加入数滴10%酚可以抑制细菌和霉菌的生長,從而由混杂的微生物群体中分离出放线菌;在培养基中加入亚硫酸铋,可以抑制革兰氏阳性细菌和绝大多数革兰氏阴性细菌的生長,而革兰氏阴性的伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)可以在這种培养基上生長;在培养基中加入染料亮绿(brilliantgreen)或結晶紫(crystalviolet),可以抑制革兰氏阳性细菌的生長,從而达到分离革兰氏阴性细菌的目的;在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素,可以抑制细菌和放线菌生長,而将酵母菌和霉菌分离出来。現代基因克隆技术中也常用选择培养基,在筛选含有重组质粒的基因工程菌株過程中,利用质粒上具有的對某种(些)抗生素的抗性选择標记,在培养基中加入相应抗生素,就能比较方便地淘汰非重组菌株,以減少筛选目標菌株的工作量。在实际应用中,有時需要配制既有选择作用又有鉴别作用的培养基。例如，當要分离金黄色葡萄球菌時,在培养基中加入7.5%NaCl、甘露糖醇和酸碱指示剂,金黄色葡萄球菌可耐高浓度NaCl,且能利用甘露糖醇产酸。因此，能在上述培养基生長，而且菌落周围培养基颜色发生变化，则该菌落有可能是金黄色葡萄球菌,再通過进壹步鉴定加以确定。

第六章发酵工艺控制第壹节温度對发酵的影响与控制壹.温度的影响（壹）温度對生長的影响每种微生物對温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。（二）温度對发酵的影响1、温度影响反应速率2、温度影响发酵方向3、温度影响发酵液的物理性质二.影响发酵温度的因素——发酵热Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射1. 产热因素：①生物热生物热：是生产菌在生長繁殖時产生的大量热量。 用途：合成高能化合物， 供微生物生命代謝活动热能散发 影响生物热的因素：生物热随菌株， 培养基， 发酵時期的不同而 不同 。生物热的大小還与菌体的呼吸强度有對应关系。 培养過程中生物热的产生具有强烈的時间性。生物热的大小与呼吸作用强弱有关在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在對数生長期時，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。培养後期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代謝作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐減弱。如果培养前期温度上升缓慢，說明菌体代謝缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。②搅拌热搅拌热：由于搅拌的机械运动造成液体之间，液体与设备之间的摩擦而产生的热。2. 散热因素：1 蒸发热蒸发热：空气进入发酵罐後，与发酵液广泛接触进行热交换,必然會引起水分的蒸发，蒸发所需的热量。②辐射热辐射热：由于发酵罐内外温度差，通過罐体向外辐射的热量。三.发酵热的测定1.壹种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通過测量冷却水进出口的水温，再從水表上得知每小時冷却水流量来计算发酵热。Q发酵＝GCm(T出－T进)Cm——水的比热G——冷却水流量2.另壹种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某壹温度，然後停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。通過罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置测得温度随時间上升的速率S，按公式可求得发酵热。四.最适温度的确定（壹）最适温度的选择1.根据菌种及生長阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生長温度為37℃，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生長温度為30～32℃，青霉菌生長温度為30℃。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代謝，使菌生長迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延長中期，從而提高产量，因此中期温度要稍低壹些，可以推迟衰老。因為在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。发酵後期，产物合成能力降低，延長发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生長阶段28℃，合成期26℃後期再升温；黑曲霉生長37℃，产糖化酶32～34℃。但也有的菌种产物形成比生長温度高。如谷氨酸产生菌生長30～32℃，产酸34～37℃。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。2.根据培养条件选择温度选择還要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差時可适當降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄時，温度也该低些。因為温度高营养利用快，會使菌過早自溶。3.根据菌生長情况选择菌生長快，维持在较高温度時间要短些；菌生長慢，维持较高温度時间可長些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生長。总的来說，温度的选择根据菌种生長阶段及培养条件综合考虑。要通過反复实践来定出最适温度。（二）温度的控制1.夹套2.盘管（蛇管）第二节pH值對发酵的影响与控制引起pH下降的因素： 碳源過量 消泡油添加過量 生理酸性物质的存在引起pH上升的因素： 氮源過多 生理碱性物质的存在 中间补料， 碱性物质添加過多壹、发酵過程pH变化的原因1、基质代謝（1）糖代謝特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的標志之壹。（2）氮代謝當氨基酸中的-NH2被利用後pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用後pH下降，當碳源不足時氮源充當碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用後pH會上升或下降。2、产物形成某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，紅霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。3、菌体自溶，pH上升，发酵後期，pH上升。二、pH對发酵的影响1、pH對发酵的影响（1）pH影响酶的活性。當pH值抑制菌体某些酶的活性時使菌的新陈代謝受阻（2）pH值影响微生物细胞膜所带電荷的改变，從而改变细胞膜的透性，影响微生物對营养物质的吸收及代謝物的排泄，因此影响新陈代謝的进行（3）pH值影响培养基某些成分和中间代謝物的解离，從而影响微生物對這些物质的利用（4）pH影响代謝方向2、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响3、最佳pH的确定三、pH的控制1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消後pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.8。2、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。3、通過补料调节pH4、當补料与调pH发生矛盾時，加酸碱调pH5、不同调pH方法的影响6、发酵的不同阶段采取不同的pH值生長：控制菌株最适生長pH，不同pH值對菌体的形态影响很大；发酵：采用阶段pH控制模式进行发酵。小結pH控制是壹项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生長阶段考察對pH的要求。在pH控制中還要采用合适的调节方法。第三节氧對发酵的影响溶解氧（DO）浓度 氧是微生物体内壹系列细胞色素氧化酶催化产能反应的最终電子受体， 也是合成某些产物的基质。 利用DO浓度的变化， 可以了解微生物對氧利用的规律， 反映发酵的异常情况， 是壹個重要的控制参数。 氧利用率：抗生素发酵：2%谷氨酸发酵：10~30%（壹）微生物對氧的需求壹、描述微生物需氧的物理量1.比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：單位時间内單位体积重量的细胞所消耗的氧气（mmolO2g菌-1h-1）。2.摄氧率(r)：單位時间内單位体积的发酵液所需要的氧量。（單位：mmolO2L-1h-1）r=QO2.X二、溶解氧浓度對菌体生長和产物形成的影响三、影响需氧的因素1.菌体浓度2.QO2遗传因素菌龄营养的成分与浓度有害物质的积累培养条件（二）反应器中氧的传递发酵過程中，空气中的氧进入细胞的過程有以下几個步骤： 空气泡中的氧转移入发酵液； 溶解的氧通過发酵液进入微生物细胞； 细胞吸收溶氧。气体的溶解過程---双膜理论壹、发酵液中氧的传递方程影响氧传递的因素 溶氧系数Kla 传质推动力(c*-cL)氧的传递途径与传质阻力： 供氧方面：液膜阻力是主要限制因素 耗氧方面：對于菌丝丛或团扩散阻力最显著。 主要与菌种特性有关二、发酵液中氧的平衡发酵液中供氧和需氧始终处于壹個动态的平衡中三、供氧的调节C有壹定的工艺要求，所以可以通過Kla和C*来调节其中C*＝P/H调节Kla是最常用的方法，kla反映了设备的