GB/T 41234-2022 水生动物RNA病毒核酸检测参考物质质量控制规范 假病毒（正式版）

ICSCCS65.020.30B41GB/T41234—2022水生动物RNA病毒核酸检测参考物质质量控制规范假病毒国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T41234—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。1GB/T41234—2022水生动物RNA病毒核酸检测参考物质质量控制规范假病毒本文件给出了作为水生动物RNA病毒核酸检测参考物质的假病毒，其质量控制规范的术语和定假病毒质量评价方法。本文件适用于水生动物RNA病毒核酸检测中假病毒(装甲RNA)类参考物质的质量控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法变异系数coefficientofvariation初始样frontsample按照制备先后顺序，最先制备的1/3批次产品。假病毒armoredRNA外膜蛋白包裹病毒RNA片段形成的病毒样粒子。溯源性traceability假病毒中目的基因序列与病原参考毒株序列的一致性。稳定性stability2GB/T41234—2022按照制备先后顺序，中间制备的1/3批次产品。终止样finalsample按照制备先后顺序，最后制备的1/3批次产品。4缩略语Amp:氨苄青霉素(ampicillin)cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dATP:三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(deoxyadenosinetriphosphate)dCTP:三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(deoxycytidinetriphosphate)dGTP:三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(deoxyguanosinetriphosphate)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)dTTP:三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(deoxythymidinetriphosphate)EB:溴化乙锭(ethidiumbromide)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)RT-qPCR:逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reversetranscription-quantitativereal-timepol-5原理假病毒为一种病毒样粒子，外膜蛋白为MS2噬菌体蛋白，包裹用于检测病毒的目的RNA片段。3GB/T41234—2022假病毒表达载体含有MS2噬菌体的成熟蛋白编码基因、衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构(见附录A);在多克隆位点中插入病毒目的cDNA片段后形成重组假病毒表达载体；该载体在蛋白表达系统中能够将插入的外源片段转录成RNA,同时合作为RNA病毒检测参考物质的假病毒，应具备以下特征：包含qPCR等核酸检测方法特异性检测到病毒RNA;具有良好的核酸酶耐受性，保护病毒目的RNA不被核6试剂或材料6.4RT-PCR试剂和RT-qPCR试剂：商品化试剂。6.6Trizol:商品化试剂。6.7RNase:商品化试剂。6.10制备假病毒所需的其他试剂：按照附录C配制。7仪器设备7.1超净工作台。7.2冷冻高速离心机。7.4高压灭菌锅。7.7荧光定量PCR仪。7.8紫外分光光度计。7.9凝胶成像系统。7.10移液器。8假病毒的质量控制8.1假病毒中病毒目的RNA片段的检测和溯源性8.1.1病毒目的RNA片段的RT-PCR检测以所制备的假病毒溶液作为待测样品，定性检测样品中是否含有病毒目的RNA片段。a)提取假病毒的RNA。b)以RNA为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行RT-PCR扩增。设置以4GB/T41234—2022c)反应产物进行电泳观察。将8.1.1的扩增产物回收、测序。测序结果与相应病毒参考毒株的序列进行比对。a)假病毒RNA的RT-PCR结果为阳性；b)扩增产物序列比对结果显示与相应病毒的参考毒株序列同源性不低于99%。若假病毒RNART-PCR产物为阴性，则表明假病毒未包裹病毒目的RNA片段，或假病毒提纯失8.2假病毒中病毒cDNA杂质的检测8.2.1PCR或qPCR检测分别以未抽提的假病毒溶液和抽提的假病毒RNA为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行PCR或qPCR扩增。设置以水为模板的阴性对照，以假病毒重组质粒为模板的阳性在阴性对照和阳性对照都成立的情况下：a)未抽提的假病毒溶液或假病毒RNA,PCR或qPCR结果为阳性，则表明溶液或外膜蛋白中有病毒来源的cDNA杂质，则假病毒不能作为RNA参考物质使用，应重新消化去除cDNA;b)未抽提的假病毒溶液和假病毒RNA,PCR或qPCR结果为阴性，则说明病毒cDNA已全部去除。8.3假病毒中病毒目的RNA片段的定量使用RT-qPCR方法，对假病毒中病毒目的RNA片段进行定量。所使用的RT-qPCR方法应为针对该病毒目的RNA片段设计建立的方法。标准品可以为病毒RNA,或病毒cDNA,或含有病毒目的DNA片段的重组质粒，使用紫外分光光度计测定标准品浓度。将标准品10倍梯度稀释至少5个梯度，分别以每个梯度的标准品溶液为模板，进行RT-qPCR反根据假病毒RNA的Ct值，利用标准曲线和公式计算出假病毒溶液中病毒目的RNA片段的浓度。也可以先计算假病毒RNA和标准品的Ct值的差，再根据公式(1)计算出假病毒RNA和标准品之X=10(△Ct/3.3)………(1)△Ct——标准品Ct值和假病毒RNACt值的差；X——假病毒RNA和标准品之间的浓度比。5GB/T41234—20228.4.1.2分别提取6组假病毒的RNA。在阴性对照和阳性对照都成立的情况下，样品扩增产物可同时满足以下三点要求的最小有效取a)取样量可保证RNA提取过程正常完成；b)RT-PCR扩增出的目的DNA条带亮度不低于分子量标准(上样量5μL,浓度约50ng/μL)的c)RT-qPCR检测结果的Ct值介于25±3.3之间。8.5假病毒均匀性检测8.5.1.2依据同人同机原则，分别提取10份样品的RNA。8.5.1.3分别以10份假病毒RNA为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行RT-PCR或RT-qPCR扩增，每份样品做3个平行对照，取平均Ct值。8.5.2假病毒均匀性判定判定标准如下：a)10份假病毒样品的检测结果全部为阳性，且RT-PCR扩增的10条DNA条带亮度相同；或RT-qPCR得出的10份样品Ct值变异系数≤10%,则表明假病毒样品均匀性良好；b)RT-PCR有样品为弱阳性或阴性；或RT-qPCR10份样品Ct值变异系数>10%,则表明假病设置2组假病毒样品，分别放置于4℃和-20℃保存。分别在第1天、第3天、第5天、第7天、第2周、第3周、第1月和第1年时间段，每组各取3支样品，1个样品应至少设三个重复，取500μL假病毒溶液提取RNA,使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行检测。8.6.2假病毒RNase耐受性检测1h,孵育温度根据RNase说明书设置。取500μL假病毒溶液提取RNA,进行RT-PCR或RT-qPCR6GB/T41234—2022b)—20℃至少保存1年；低于-20℃条件下保存时间不超过1年，避免反复冻融；4℃条件下保存时间不超过7d。假病毒作为水生动物RNA病毒核酸检测参考物质，经过至少5家具备核酸提取和分子生物学检a)外膜蛋白包裹病毒目的RNA片段，扩增片段序列与相应病毒的参考毒株序列同源性不低于99%;c)最小有效取样量能同时满足RNA提取和RT-PCR或RT-qPCR的需求；e)4℃保存7d,-20℃保存1年，检测结果仍为阳性；7GB/T41234—2022(资料性)假病毒载体中插入的MS2基因(GenBankMK213795,成熟蛋白编码基因、衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构),全长1706bp。71AGGGAGAACGAGACCTTCGTCCCCTCCGTTCGCGTTTACGCGGACGGTGAGACTGAAGATAACTCATTCT141CTTTAAAATATCGTTCGAACTGGACTCCCGGTCGTTTTAACTCGACTGGGGCCAAAACGAAACA211CTACCCCTCTCCGTATTCACGGGGGGCGTTAAGTGTCACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGCGAAGT281GGGTCATCGTGGGGTCGCCCGTACGAGGAGAAAGCCGGTTTCGGCTTCTCCCTCGACGCACG351ACAGCCTCTTCCCTGTAAGCCAAAACTTGACTTACATCGAAGTGCCGCAGAACGTTGCGAACCGGGCGTC421GACCGAAGTCCTGCAAAAGGTCACCCAGGGTAATTTTAACCTTGGTGTTGCTTT491ACAGCCTCACAACTCGCGACGCAAACCATTGCGCTCGTGAAGGCGTACACTGCCGCTCGTCGCGGTAATT561GGCGCCAGGCGCTCCGCTACCTTGCCCTAAACGAAGATCGAAAGTTTCGATCAAAACACGTGGCCGGCAG631GTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTACCACTAATGAGTGATATCCAGG701AAGGTTCACCTTCAAGAGTTTCTTCCTATGAGAGCCGTACGTCAGGTCGGTACTAACATCAAGTTAGATG771GCCGTCTGTCGTATCCAGCTGCAAACTTCCAGACAACGTGCAACATATCGCGACGTATCGTGATATGGTT841TTACATAAACGATGCACGTTTGGCATGGTTGTCGTCTCTAGGTATCTTGAACCCACTAGGTATAGTGTGG911GAAAAGGTGCCTTTCTCATTCGT981CCCCCGTGGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATAACGGGTGAGTCCATCATAAGCGT1051TGACGCTCCCTACGGGTGGACAACAACTGGCGCGTACGTAACAACGGCTCTCTAGATAGA1261AACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGGCAGCAACTTCG1331CTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGG1401TCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTT1471GGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACT1541CTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCC1611CTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCAT8GB/T41234—2022(规范性)B.1试剂或材料B.2仪器设备B.2.2恒温摇床。B.2.5电子天平。B.2.7PCR仪。B.2.9荧光定量PCR仪。B.2.12移液器。9GB/T41234—2022B.3假病毒参考物质的制备B.3.1病毒总RNA的提取按照待检目的病毒检测的国家标准或行业标准中推荐的方法，从病毒液中提取总RNA。对于还未B.3.2.2引物设计：根据该病毒检测标准中推荐的引物序列，在2条引物5'端分别加入酶切位点。酶切位点的选择应遵循以下原则：a)应从假病毒载体上的酶切位点中选择；b)2条引物所带的酶切位点不能相同；c)应确保目的DNA不含有该酶切位点；针对传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒和草鱼呼肠孤病毒(I型和Ⅱ型)等重要水生动物RNA病毒，根据OIE水生动物疾病诊断手册和相关国家标准推荐的病B.3.2.3使用Taq酶和反转录酶，以总RNA为模板进行RT-PCR扩增。反应体系和反应条件参照相B.3.3反应产物的上样和电泳将50×TAE电泳缓冲液稀释50倍，再配制1%的琼脂糖(含0.5μg/mLEB)凝胶平板。将全部PCR扩增产物和1/5体积的上样缓冲液混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5V/cm电泳20min～30min,当溴酚蓝到达凝胶平板2/3处时停止。剂盒说明书，提取目的DNA。使用20μL水溶解DNA。规定的目的DNA位置相同，则目的DNA回收成功；若位置不同，或无明显DNA条带出现，则目的使用紫外分光光度计测量目的DNA浓度。B.3.6目的DNA连接入T载体根据分子量计算目的DNA和T载体的浓度，载体连接外源基因体系应符合表B.1要求。GB/T41234—2022表B.1载体连接外源基因体系试剂加入量T4DNA连接酶加水至总体积25μLB.3.7T载体连接产物的转化与蓝白斑筛选B.3.7.1取100μL大肠杆菌DH5α感受态溶液(2%)和7μLIPTG(20%),混匀后，均匀涂布于含B.3.7.4培养结果观察：蓝色菌落携带空质说明培养基中Amp失效，需重新制备平板进行蓝白斑筛选。B.3.7.5将平板置