羊乳房炎诊断与防控技术规范标准征求意见稿

ICS11.220CCSB4151Technicalspecificationfordiagnosisandcontrolofsheepmastitis在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。IDBXX/TXXXX—XXXX 42规范性引用文件 43术语和定义 44临床诊断 44.1流行病学 44.2临床症状 45实验室诊断 55.1样本采集与处理 55.2乳汁中体细胞数的检测方法及结果判定 55.3乳房炎试验（CMT法）检测隐性乳房炎 55.4细菌种属鉴定 55.5PCR鉴定 56处置 56.1临床型乳房炎 56.1.1隔离 5对病牛实施隔离，接触过的用具及环境进行彻底消毒。 56.1.2治疗 56.1.2.1抗感染治疗 56.1.2.2对症治疗 6.1.2.3辅助性治疗 6.1.3病乳的处理 6.2隐性乳房炎 6.2.1病羊的处置 6.2.2病乳的处置 应严格执行休药期和弃奶规定。 7预防 7.1良好的卫生环境 7.2加强饲养管理 8治疗 8.1原则 8.2方法 8.2.1临床型乳房炎 8.2.2隐性乳房炎 8.3休药期 9无害化处理 7 A.1金黄色葡萄球菌的检验 DBXX/TXXXX—XXXXA1.1主要试剂和检验方法 A1.2乳样的采集 A1.3病原菌的分离培养 A1.4生化鉴定 9A1.5毒力试验 9A1.6病原菌的重分离试验 9A2.链球菌的检验 9A2.1主要试剂和试验方法 9A2.2乳样的采集 9A2.3病原菌的分离培养 A2.4生化鉴定 A2.5动物试验 B.1主要试剂盒材料 B.2操作方法 B.3加州乳房炎检测法（CMT） DBXX/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件由四川省市场监督管理局批准发布。本文件起草单位：西南民族大学本文件主要起草人：杨发龙、封海波、张焕容。4DBXX/TXXXX—XXXX羊乳房炎诊断与防控技术规范本文件规定了羊乳房炎临床诊断、病原微生物分离鉴定等诊断依据，治疗、无害化处理等防控技术规范。本文件适用于羊乳房炎的诊断、疫情处理、预防与控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范NY/T2962-2016奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定方法NY/T5030-2016无公害农产品兽药使用准则病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发〔2017〕25号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1羊乳房炎又称乳腺炎（Mastitis），指乳腺组织的各类型炎症。主要由病原微生物引起。临床上又可分为隐性乳房炎（SubclinicalMastitis）和临床型乳房炎（ClinicalMastitis）两种。4临床诊断4.1流行病学羊乳房炎致病菌主要有链球菌、葡萄球菌、大肠埃希氏菌，占乳房炎致病菌总数的80%~90%，病原种类有地域性特点。病原体可通过挤奶器具、污染的环境，或泌尿生殖道、消化道、乳房以及皮肤黏膜损伤传播。隐性乳房炎发病率在15%~70%，临床型乳房炎发病率在1%~15%，一年四季均可发病。4.2临床症状临床型乳房炎：乳房肿胀、发硬、发热，乳房皮肤发红，触诊有疼痛；乳腺患部组织弹性降低，硬结；各乳区大小不一，乳房上淋巴结肿大，坚硬，触之有痛感；乳汁排出不畅或困难，泌乳减少或停止；乳汁变性变色，呈黄色，粘稠、有絮状物、乳凝块、血块或乳汁稀薄。隐性乳房炎：泌乳量减少，肉眼观察无明显临床症状。5DBXX/TXXXX—XXXX5实验室诊断实验室生物安全要求按照GB19489执行。5.1样本采集与处理乳的采集根据NY/T541-2016的规定进行，及细菌的分离详见附录A。5.2乳汁中体细胞数的检测方法及结果判定可采用乳成分分析仪，也可采用体细胞计数法（详见附录B）。5.3乳房炎试验（CMT法）检测隐性乳房炎详见附录B。5.4细菌种属鉴定按照《伯杰细菌鉴定手册》进行生化鉴定，或使用全自动微生物鉴定系统，或16SrRNA基因序列测序分析法，任选一种进行细菌种属鉴定。对疑似金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌及无乳链球菌也可按照NY/T2962-2016进行。5.5PCR鉴定通过CTAB/NaCl法提取乳汁中致病菌的DNA，具体方法为：取1mL羊乳，10000r/min离心5min，弃上清，沉淀中加入500μLSTE、20μL100g/LSDS、20μL10mg/mL蛋白酶K，混匀后置于56℃水浴消化3h。加入500μL酚/氯仿/异戊醇（25:24:1混匀后10000r/min离心4min。吸上清，加入500μL氯仿：异戊醇（24:110000r/min离心3min后取上清，加入30μL5mol/L的NaCl，1000μL预冷乙醇，10000r/min离心2min，弃乙醇，晾干后向沉淀中加入100μLTE溶解，置-20℃保存。引物、PCR反应体系和反应条件见附录C。6处置6.1临床型乳房炎6.1.1隔离对病牛实施隔离，接触过的用具及环境进行彻底消毒。6.1.2治疗按照对症治疗、局部治疗、抗感染和辅助性治疗相结合的原则对确诊的病羊进行有效的治疗，防止病原扩散。6.1.2.1抗感染治疗选用抗感染药物治疗。治疗前应进行乳汁的采样，进行病原菌的培养，根据药敏试验结果选用合适的抗菌药物。6DBXX/TXXXX—XXXX6.1.2.2对症治疗解热、镇痛、抗过敏。6.1.2.3辅助性治疗采用乳房基部封闭、乳房按摩、增加挤奶次数、乳房冷敷、外敷药物等缓解乳房的肿胀。6.1.3病羊乳的处理病羊乳用专用容器集中销毁，严格执行休药期和弃奶规定。6.2隐性乳房炎6.2.1病羊的处置对确诊为隐性乳房炎的病羊先采用隔离观察，对连续检测CMT呈阳性、乳汁表现异常、产奶量低、反复发作的病羊进行淘汰。干乳前10天进行隐性乳房炎CMT监测，对阳性反应在“++”以上的羊及时治疗，干乳前3天再监测一次，阴性反应方可停乳。6.2.2病羊乳的处置应严格执行休药期和弃奶规定。7预防7.1良好的卫生环境羊舍、运动场设计合理，空间宽敞，保持阳光充足；羊床保持清洁、干燥，垫草应干、软、清洁、新鲜，需经常更换。定期对羊舍和运动场进行消毒，乳房炎高发季节应加强消毒，为保持乳房清洁,可以采用0.1%新洁尔灭经常擦洗乳房和周边皮肤。7.2加强饲养管理根据营养需要，在各生产阶段精、粗饲料搭配合理，增加青绿、青贮饲料的饲喂量，以乳定料，维持机体最佳生理机能。停乳后要随时检查乳房，发现异常应立即处理；在干奶后期应适当增加精料，适当控制盐和多汁饲料的饲喂量，在饲养管理过程中避免应激。适当增加运动，增强免疫力。8治疗8.1原则早发现、早治疗，抗菌、消炎、消除病因。选取对病原菌敏感的药物，兽药的使用应符合NY/T5030-2016规定，较严重者可以选取中药煎水内服。8.2方法8.2.1临床型乳房炎出现全身症状，体温高于40℃的病羊，用非甾体抗炎药进行镇痛、消肿及退烧，同时选用敏感的抗生素治疗；有脱水症状的病羊应静脉输液补充氯化钠及口服电解质。7DBXX/TXXXX—XXXX8.2.2隐性乳房炎选用敏感抗生素或中兽药等进行治疗。8.3休药期用抗生素治疗，应按照每种抗生素规定的休药期休药，休药期间产奶应全部废弃，休药结束后经奶样检测无抗后方可混群。9无害化处理按照病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发〔2017〕25号）对病死羊及其乳产品进行无害化处理。8DBXX/TXXXX—XXXX乳房炎病原菌分离鉴定方法A.1金黄色葡萄球菌的检验A1.1主要试剂和检验方法A1.1.1革兰氏染色A1.1.1.1涂片、火焰固定。A1.1.1.2草酸铵结晶紫染1min。草酸铵结晶紫染液的配制：溶液A：结晶紫2g，95%酒精20mL，溶液B：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。将A、B溶液混合，用滤纸过滤后方可使用。A1.1.1.3自来水冲洗。A1.1.1.4加碘液覆盖涂面染约1min。A1.1.1.5水洗，用吸水纸吸去水分。A1.1.1.6加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s后水洗，吸去水分。A1.1.1.7沙黄液（稀）染2min后，自来水冲洗。干燥，镜检。革兰氏阳性菌染色为蓝紫色，革兰氏阴性菌染色为红色。A1.1.2触酶试验取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3%过氧化氢数滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。有大量气泡产生者为阳性，无则为阴性。A1.1.3血浆凝固酶试验吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌浸液肉汤24h培养物充分混匀，置36±1℃培养，每隔半小时观察一次，连续观察6h，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。A1.2乳样的采集选取出现临床症状（或者怀疑为隐性乳房炎）乳房炎奶牛，先用温水，再用0.2%新洁尔灭擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头2～3把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样3mL于无菌乳样杯中，待检。A1.3病原菌的分离培养初步诊断：将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为葡萄球菌。9DBXX/TXXXX—XXXX分离培养：将乳样摇匀，分别取适量接种于营养肉汤（10%血清）、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基（平板）后，置于37℃温箱培养24～48h。观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现。普通琼脂平板上，37℃,24～72h培养后，可见到湿润、光滑、隆起的圆形金黄色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、镜检（镜检呈葡萄状排列，无芽孢、荚膜，直径0.5～1µm，革兰氏染色阳性），并挑取单个可疑菌落移植于肉汤和斜面培养基，经37℃培养24～48h。24h后没有长菌的平板，再用相应的增菌肉汤涂划一次，继续培养，24～48h后，再作检查，以防漏检。将剩余的乳样存放于4℃冰箱内备用。营养肉汤中呈浑浊生长，管底有少量灰白色沉淀；血液琼脂平板中菌落较大，呈金黄色、圆形，周围出现明显的β–溶血。A1.4生化鉴定触酶试验：触酶阳性。血浆凝固酶试验：凝固酶试验阳性。糖发酵试验：能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖。色素产生情况：能产生金黄色色素。A1.5毒力试验将上述经过生化试验鉴定的细菌悬液用灭菌生理盐水作适当稀释，对随机分组的小鼠进行腹腔注射接种，接种量为0.5mL/只（家兔皮下接种1.0mL或者静脉接种0.1～0.5mL），能够致死动物或者内脏出现脓肿可以确定有毒力。A1.6病原菌的重分离试验对接种后发病、死亡小鼠（家兔）的肝脏进行病原菌重分离。进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种菌。如果是则进一步确定病原菌为金黄色葡萄球菌。A2.链球菌的检验引起临床型乳房炎或者隐性乳房炎的链球菌常见的有无乳链球菌、停乳链球菌以及乳房链球菌。A2.1主要试剂和试验方法CAMP试验：在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养物划一条直线，然后将链球菌培养物划一条线，与金黄色葡萄球菌培养物的划线相互垂直，但不要接触，二者相距3～5mm，各链球菌分离菌划线间距10～20mm。置37℃温箱内培养24h后观察结果。在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。A2.2乳样的采集选取出现临床症状（或者怀疑为隐性乳房炎）乳房炎奶牛，先用温水，再用0.2%新洁尔灭擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头2～3把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样3mL于无菌乳样杯中，待检。DBXX/TXXXX—XXXXA2.3病原菌的分离培养初步诊断：将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为链球菌。分离培养：将乳样摇匀，分别取适量接种于营养肉汤（10%血清）、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基（平板）后，置于37℃温箱培养24～48h。观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现。普通琼脂平板上，37℃,24～72h培养后，未见到菌落。鲜血琼脂平板上长有灰白色、半透明表面光滑圆形隆起的小菌落，出现溶血现象，如果是β溶血则疑为无乳链球菌，如果为α溶血，疑为停乳链球菌或者乳房链球菌，如为溶血，则疑为乳房链球菌。血清肉汤中生长初呈均匀浑浊，管底出现絮状沉淀，上清变得透明。挑取典型菌落涂片、染色、镜检，镜检如呈球状，短链状或者长链状排列，无芽孢、荚膜，革兰氏染色阳性则疑为链球菌。A2.4生化鉴定镜检形态符合链球菌特性，且触酶试验阴性细菌，即鉴定为链球菌属细菌。若细菌CAMP试验阳性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为无乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为停乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为乳房链球菌。A2.5动物试验对实验动物，只有停乳链球菌具有致病性，将其18h血清肉汤培养物0.5mL注入小白鼠腹腔，或给家兔静脉接种1～2mL，可使动物在1周内死亡。对接种后发病、死亡小鼠（家兔）的肝脏进行病原菌重分离。进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种菌。如果是则进一步确定病原菌为停乳链球菌。其他两种链球菌并不能使试验动物致死。DBXX/TXXXX—XXXX乳汁体细胞计数法B.1主要试剂盒材料美蓝染色液：美蓝乙醇饱和溶液30mL（美蓝2g，95%乙醇100mL），10%氢氧化钠溶液0.1mL，蒸馏水100mL，将上列溶液混合摇匀，过滤后备用。二甲苯、95%乙醇。生物显微镜、载玻片、10µL微量加样器（或移液枪）等。B.2操作方法B.2.1涂片制备涂布：充分摇匀新鲜乳样，用10µL微量加样器吸取中部乳汁10µL，或用接种环蘸取等量的乳汁，将乳样滴于玻片一端中侧，仔细涂布成约1cm2面积的乳膜（为便于操作，可在玻片下垫衬一张硬纸板，纸板上用毛笔划数个面积为1cm2的方格透视）。干燥、脱脂、固定：涂好乳膜的玻片于37℃温箱中干燥，然后用二甲苯脱脂5min，再置95%乙醇中固定5～10min。染色：玻片干燥后，用美蓝染色液染色5min。水洗，再用95%乙醇脱色数分钟，水洗干燥后镜检。镜检及计数：在生物显微镜油镜下观察（最好用10×目镜，其视野直径要求为0.016cm计数100个视野内的细胞数，然后用下式计算：SCC＝100×N/πr2，视野面积πr2＝3.1416×(0.016/2)2＝0.0002cm2显微镜系数N＝1/0.0002×100＝500，000SCC＝系数×每个视野的细胞平均数（即细胞总数÷100）＝细胞数/mL乳。B.2.2判定标准随着国际和国内乳品行业的接轨，国内标准也在提高，一般以每毫升牛奶中含20万个细胞为亚临床乳房炎的临界值超过该值为阳性，低于该值则正常。B.3加州乳房炎检测法（CMT）CMT是加州乳房炎试验的简称，即首先在美国加利福尼亚州使用的一种乳房炎检测试验。CMT法的判定方法和标准见表1。B.3.1试剂和方法CM