医疗器械工程导论5细胞毒性评价

体外细胞培养评价技术细胞形态学的检测方法直接观察光镜电镜检测技术透射电镜扫描电镜组织学染色免疫细胞化学染色免疫荧光染色方法ABC免疫染色方法细胞活力的检测方法细胞遗传学的检测方法有关分子生物学技术生物学评价直接观察相差倒置显微镜无需制样直接将细胞培养瓶、培养板放在载物台上观察由于细胞透明、反差小，因此一般使用相差功能相差显微镜原理利用光在通过不同物质时的折射率和物体的厚度差别，产生衍射而引起的光程变化，光程的变化引起相位差即相差的变化来观察物体的结构。人眼不能分辨相差，但是显微镜利用光的衍射和干涉现象，把相差变为明暗之差，就可以分辨出被检物体的结构要求：培养瓶的上下壁平行、光洁。观察：细胞的附着、贴壁、伸展、移动、有丝分裂等；细胞受损后出现皱缩、变圆、溶解和崩解等现象；Osteoblastcells（MC3T3-E1）UHMWPEWeardebrisUHMWPE-ALNWeardebrisphagocytosis

UHMWPEWeardebirsUHMWPE-ALNWeardebrisMacrophagecells（RAW264.7）体外细胞培养评价技术细胞形态学的检测方法直接观察光镜电镜检测技术透射电镜扫描电镜组织学染色免疫细胞化学染色免疫荧光染色方法ABC免疫染色方法细胞活力的检测方法细胞遗传学的检测方法有关分子生物学技术生物学评价电镜观察扫描电镜（ScanningElectronMicroscopy，SEM）透射电镜（TransmissionElectronMicroscopy，TEM）制样（参考书）注意固定、(梯度)脱水、临界点干燥或冷冻干燥保持细胞的形貌观察的倍数和目标光镜（1000X,1600X,3000X）扫描电镜（20万倍，细胞表面的形貌）透射电镜（50万倍，细胞内部的细胞结构和细胞器）扫描电镜景深长，图像富有立体感；图像的放大倍数可在大范围内连续变化；几十倍~十万倍样品室的体积大可容纳较大试样；在形貌观察的同时，还可测试其它性质元素组成(EDS)。电镜的生物试样制样扫描电镜透射电镜取材固定脱水干燥镀金取材固定脱水包埋切片染色TEM透射电镜的超薄切片的制备过程透射电镜(TEM)观察TEM显示相邻两rMSCs.×5600TEMimageoftwoadjacentrMSCs.×5600TEM显示rMSCs细胞核、核膜、核仁、染色质.×8400TEMimageofnucleus,nuclearmembrane,nucleolus,chromatinofrMSCs.×8400细胞细胞核体外细胞培养评价技术细胞形态学的检测方法直接观察光镜电镜检测技术透射电镜扫描电镜组织学染色免疫细胞化学染色免疫荧光染色方法ABC免疫染色方法细胞活力的检测方法细胞遗传学的检测方法有关分子生物学技术生物学评价组织学染色HE染色（HematoxylinandEosinstaining）原理：

碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞和和细胞质发生作用，是细胞的细微结构通过颜色而改变它的折射率，在光镜下呈现细胞图像。其它染色方法台盼蓝染色：死细胞三色染色：胶原Von-Kossa染色：矿物质……P3rMSCs成骨诱导2w，茜素红染色示钙化斑.×100P3rMSCsOSI2w，Alizarinstain.×100P3rMSCsvonKossa染色示钙化斑.

P3rMSCsvonKossastain.A:OSCB:OSI1wC:OSI3wD:OSI2w体外细胞培养评价技术细胞形态学的检测方法直接观察光镜电镜检测技术透射电镜扫描电镜组织学染色免疫细胞化学染色免疫荧光染色方法ABC免疫染色方法细胞活力的检测方法细胞遗传学的检测方法有关分子生物学技术生物学评价免疫细胞化学染色将细胞培养技术与免疫学技术结合immunocytochemical目的定量和定位分析细胞成分原理方法ABC免疫染色方法免疫荧光法酶联免疫法（Elisa,

enzyme-linkedimmunosorbentassay）……Immuno－chemistryPrincipleEEECell/TissueSubstr.ColorSubstr.ColorSubstr.ColorP1成骨细胞(6d)免疫细胞化学染色.×40P1成骨细胞(6d)免疫细胞化学染色.×200ImmunofluorescenceStaincytotoxicityofSi-substitutedHAcomposite多光子激光共聚焦显微镜观察结果正常成骨细胞（细胞骨架）HA/TCP材料表面结构体外细胞培养评价技术细胞形态学的检测方法直接观察光镜电镜检测技术透射电镜扫描电镜组织学染色免疫细胞化学染色免疫荧光染色方法ABC免疫染色方法细胞活力的检测方法细胞遗传学的检测方法有关分子生物学技术生物学评价细胞活力检测染料克隆（集落）形成试验四唑盐（MTT）比色试验AlamarBlue比色试验碱性磷酸酶测定（ALP）乳酸脱氢酶测定（LDH）细胞蛋白质含量测定法细胞蛋白质合成测定法细胞活力检测染料排除法台盼蓝死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染。伊红Y排斥试验着红色为死细胞，活细胞拒染。苯胺黑排斥试验黑色细胞为死细胞。参考书《细胞培养》，司徒镇强等编，世界图书出版社，（超星图书）细胞活力检测染料克隆（集落）形成试验四唑盐（MTT）比色试验AlamarBlue比色试验碱性磷酸酶测定（ALP）乳酸脱氢酶测定（LDH）细胞蛋白质含量测定法细胞蛋白质合成测定法克隆（集落）形成试验克隆（集落）单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所形成的细胞群体。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3－1.0mm之间。原理通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性，克隆形成率高者其独立生存能力强。方法平板克隆形成试验软琼脂克隆形成试验克隆（集落）原代rMSCs(7d)培养物中形成集落的贴壁细胞.×100rMSCscoloniesinprimaryculture(7d).

×

100朗伯－比尔定律当用一适当的波长的单色光照射吸收物质的溶液时，其吸光度与溶液浓度和透光液层厚度的乘积成正比A＝kcbA=kck：比例常数，与入射光的波长，溶液的性质、厚度、浓度以及温度有关；c：溶液浓度；b：溶液厚度；

A=log(I0/I),吸光度，又称消光度。TheLambert-Beer‘sLawVerticallightbeamHighthroughputReducedprecision,dependentfrompipettingLowvolumerequired(50-250µl)HorizontallightbeamHighprecisionbyexactpathlenghtHighvolumerequired(1-2ml)HighhandlingtimeAnalyticalmethodsincellculture细胞活力检测染料克隆（集落）形成试验四唑盐（MTT）比色试验AlamarBlue比色试验碱性磷酸酶测定（ALP）乳酸脱氢酶测定（LDH）细胞蛋白质含量测定法细胞蛋白质合成测定法MitochondriaMitochondriaincellPrincipleofMTTmethodMTT(atetrazoliumsalt)iscleavedinactivemitochondriaandsothereactionoccursonlyinlivingcells.Theformazancanbedissolvedinacidicorganicsolventsandabsorptionmeasuredat=570nm.Cleavedbylivingcells(paleyellow)(darkblue)ProcedureofMTTmethodThefinalProcedure:Add0.01ml(5mg/ml)MTTto0.1mlcellsinculturemedium.incubateat37℃for4h.(MTTcleavage)additionofacid-isopropanol,fewminutesatroomtemperature.(dissolvetheformazancrystal)OpticaldesitywasmeasuredbyELISAreadersorUV-visiblespectrum.细胞活力检测染料克隆（集落）形成试验四唑盐（MTT）比色试验AlamarBlue比色试验碱性磷酸酶测定（ALP）乳酸脱氢酶测定（LDH）细胞蛋白质含量测定法细胞蛋白质合成测定法AlamarBlue-TestAnalyticalmethodsincellculture蓝色粉红色620nmCellproliferation---AlamarBluetestcytotoxicityofSi-substitutedHAcomposite细胞活力检测染料克隆（集落）形成试验四唑盐（MTT）比色试验AlamarBlue比色试验碱性磷酸酶测定（ALP）乳酸脱氢酶测定（LDH）细胞蛋白质含量测定法细胞蛋白质合成测定法ALPase活性检测原理ALPase在特定条件下，可以将底物PNPP（对－硝基苯酸盐）分解成PNP（对－硝基苯酚）和磷酸盐，其中PNP呈黄色，根据颜色的深浅来反应活性程度。此反应是一种进行性过程，国际通用标准是以每分钟PNP生成的量来表示，测得的直接数据是PNP的OD（吸光度）值。ALP活性与PNP生成率呈正相关LowSubstrateSpecifity:R-OPO(OH)2（4－NPP）Reaction:

R-O-PO32-+H2O R-OH+PO43-+H+ForAnalysisfrequently4-NitrophenlyPhosphate（对－硝基苯酚）assubstrate:TheProducthasyellowcolor:(Emax)=405nmALP

OD/t

OD/t

OD/tAlkalinePhosphatase对－硝基苯酸盐对－硝基苯酚无机磷酸根

AlkalischePhosphatase(ALP)cytotoxicityofSi-substitutedHAcompositeP3rMSCs成骨诱导6天ALP染色,示强阳性黑染和弱阳性棕染细胞.×

100P3rMSCsOSI（6d）ALPstain.Showthestrongpositiveandweakpositivecells.×

100细胞活力检测染料克隆（集落）形成试验四唑盐（MTT）比色试验AlamarBlue比色试验碱性磷酸酶测定（ALP）乳酸脱氢酶测定（LDH）细胞蛋白质含量测定法细胞蛋白质合成测定法ExamplesofEnzymes:LDHLactateDehydrogenase(LDH)NecessaryfortheenergymetabolismVeryconstantactivityinallcellsOnlyinsidethecellPresenceoutsideofacellindicatescelldamage(leakage)乳酸脱氢酶是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶几乎存在于所有组织中。同功酶有五种形式，即LDH－1（H4）、LDH-2（H3M）、LDH－3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（M4）。

ExamplesofEnzymes:LDHReactionLacatate+NAD+ Pyruvate+NADH+H+在反应过程中，乳酸化生成丙酮酸，同时使NAD+还原为NADH。NADH在340nm处有吸收峰，因此反应会引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率与样本中LD活性呈正比关系。反应式如下：L-乳酸+NAD=丙酮酸+NADH+H+LDHAnalyticalmethodsincellculture氧化/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,氧化型辅酶i丙酮酸LDHCellmembranedamage%madebyLiCl-HAmaterialsCellmembranedamage%madebySi-substitutedmaterialscytotoxicityofSi-substitutedHAcomposite细胞活力检测染料克隆（集落）形成试验四唑盐（MTT）比色试验AlamarBlue比色试验碱性磷酸酶测定（ALP）乳酸脱氢酶测定（LDH）细胞蛋白质含量测定法细胞蛋白质合成测定法细胞蛋白质含量测定法考马斯亮蓝测定法更敏感细胞用量少考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈最大吸收，其吸收值与蛋白质成正比ELISA评价试剂盒……细胞蛋白质合成测定法用同位素标记的氨基酸（3H－亮安酸和35S－蛋安酸）掺入细胞蛋白质合成代谢中；通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢状况。本实验系放射性实验，应严格执行放射性实验操作规程，谨防放射性污染体外细胞培养评价技术细胞形态学的检测方法直接观察光镜电镜检测技术透射电镜扫描电镜组织学染色免疫细胞化学染色免疫荧光染色方法ABC免疫染色方法细胞活力的检测方法细胞遗传学的检测方法有关分子生物学技术生物学评价PCR(PolymeraseChainReaction)expressionOrdinaryAnalyticMethodsinCellCultureIntegrityofcellmembrane:LDHtest,台盼蓝染色,伊红,苯胺黑(死细胞),etcProliferationandviabilityofthecell:MTT,AlamarBlue,[3H]thymidine,etcFunctionalsecretionofthecellALP,三色染色(胶原),Von-Kossa染色,

茜素红染色(矿物质),etcMorphologyofthecellonmaterialsurface：SEM,TEM,histologicalstain,Immunofluorescencestain,etcAnalyticalmethodsincellculture体外细胞培养评价生物相容性大量的文献不同的细胞株（cellline）不同的生物学的评价形貌：显微镜、扫描电镜、或染色细胞数量：MTT……细胞内外蛋白质、DNA等的分析：分子生物学GB/T16886.5-细胞毒性试验细胞毒性试验（GB/T16886.5）目的评价医疗器械致细胞毒性反应的潜在可能性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应及其程度。通过采用适当生物学参数来确定哺乳动物细胞的体外生物学反应，判断供试品及浸提液直接或间接接触细胞一定时间后，是否会引起生长抑制、功能改变、溶解、死亡等一系列毒性反应。意义经济、简便的筛选在不同实验室进行重复细胞毒性试验（GB/T16886.5）样品的制备试样、浸提液灭菌，吸收性供试品等？细胞系（株）CCL1(NCTCcolone-929),CCL163(Balb/3T3cloneA31),CCL171(MRC-5),V-79379A,CCL75(WI-38),CCL81(Vero)培养基及培养条件无菌含血清或无血清正常的细胞培养条件一致试验对照细胞毒性试验样品制备：浸提液浸提介质：含血清的培养基、无血清的培养基、生理盐水、植物油、二甲亚枫浸提条件和要求：无菌，参照GB/T16886.12样品的制备和参照样品浸提液的存放：尽快用，不超过24小时直接接触试验材料的制备灭菌：不改变供试样的性质固体：与细胞有一个接触平面液体：直接附着或附着到具有生物惰性和吸收性的基质上（滤膜）吸收性供试样：先用培养基湿化细胞毒性试验（GB/T16886.5）样品的制备试样、浸提液灭菌，吸收性供试品等？细胞系（株）CCL1(NCTCcolone-929),CCL163(Balb/3T3cloneA31),CCL171(MRC-5),V-79379A,CCL75(WI-38),CCL81(Vero)培养基及培养条件无菌含血清或无血清正常的细胞培养条件一致试验对照细胞毒性试验细胞株

L-929,V-79379A,CCL75(WI-38)，CCL81(Vero),CCL163(Balb/3T3cloneA31)等细胞。如果采用其他细胞，只要证明它可产生与所推荐的细胞系相同的结果，也能被使用；如果试验需要具有特殊敏感性的细胞时，可使用从活体组织上获取的原代细胞和细胞系，但是证明其反应重复性好和精确性高；试验前检测是否有支原体污染，保证使用无污染的细胞；冻存细胞时应在-100C或以下的条件下（液氮），培养基中加少量的二甲基亚砜或甘油；细胞毒性试验复苏、传代使用冻存细胞时，应除去细胞保护剂，在使用前至少传代一次才能使用，取出细胞后，用酶分散法或机械分离法制备细胞悬液。培养基无菌1640（L929）细胞毒性试验（GB/T16886.5）样品的制备试样、浸提液灭菌，吸收性供试品等？细胞系（株）CCL1(NCTCcolone-929),CCL163(Balb/3T3cloneA31),CCL171(MRC-5),V-79379A,CCL75(WI-38),CCL81(Vero)培养基及培养条件无菌含血清或无血清正常的细胞培养条件一致试验对照合成培养基199培养液：69种成分，Eagle培养液：MEM(最低必须培养基)BME，

DMEM高糖型：生长较快、附着较差的细胞；低糖型：RPMI1640应用最广泛的培养基Ham培养液适合单细胞和克隆化培养，是无血清培养中常用的基础培养基无血清培养基生物学评价无血清培养基血清的作用提供细胞生长的营养成分，促进细胞的DNA的合成，并含有细胞增殖所必需的生长因子；血清成分非常复杂对一些要求较高的基础性研究的结果影响较大；血清中还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质对细胞有去分化作用，影响某些细胞功能的表达；应用培养细胞进行分离制备细胞生长因子、单克隆抗体等时，含血清培养基也带来很多问题。无血清培养基基础培养液，辅加成分。生物学评价细胞毒性试验（GB/T16886.5）样品的制备试样、浸提液灭菌，吸收性供试品等？细胞系（株）CCL1(NCTCcolone-929),CCL163(Balb/3T3cloneA31),CCL171(MRC-5),V-79379A,CCL75(WI-38),CCL81(Vero)培养基及培养条件无菌含血清或无血清正常的细胞培养条件一致试验对照细胞毒性试验试验对照阴性对照-无毒性反应：高密度聚乙烯，氧化铝陶瓷等。显示试验体系下细胞的背景反应。阳性对照-细胞毒性反应：有机锡作稳定剂的聚氯乙烯，酚的溶液。验证相应实验系统的反应。空白对照：不加任何试剂和材料，只有细胞和培养基。验证细胞培养系统的反应。细胞毒性试验试验对照试剂对照在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。验证浸提介质的反应状况。参照样品市售的同类产品。将样品与同类已证明无细胞毒性的材料进行比较。细胞毒性试验（GB/T16886.5）细胞毒性试验两种评价类型按不同的生物学终点评价细胞形态学评价导致细胞损伤发生形态改变和细胞破坏显微镜直接观察。如：皱缩、变圆、溶解和崩解等细胞膜效应评价以生物膜效应为评价细胞反应的指标，通过染色鉴别死或活细胞，包括中性红染色法、台盼蓝染色法、荧光素染色法等细胞生长能力评价细胞生长速度。细胞增殖度的测定。细胞代谢活力评价检测细胞生物代谢或生物合成功能的改变，如MTT，各种测定蛋白质量、蛋白质合成率和酶活性的方法。按不同接触方式评价细胞毒性试验按不同的接触方式浸提液方式易获取，广泛接触；与实际材料有一定的差异直接接触方式与实际情况相似，但对细胞易产生机械损伤，影响评价的准确性间接接触方式用琼脂或醋酸纤维素膜将试样与细胞分开，在一定程度上模拟了应用情况琼脂扩散滤膜扩散最接近应用状况细胞毒性试验浸提液试验浸提液与细胞的接触时间至少为24h细胞增殖度法细胞生长抑制法（MTT比色法）直接接触试验避免机械损伤可先放入试样，与细胞共培养间接接触试验琼脂扩散：适用于供试样的滤沥物，不与琼脂相互作用滤膜扩散滤膜上培养细胞放试样，培养，染色间接接触试验滤膜扩散在培养皿内放置一张孔径0.45um无表面活性的滤膜，并加入一定量的、密度均匀的细胞悬液移注于细胞培养皿内，并均匀地分散在器皿表面，培养至对数生长末期形成的单层细胞用于试验；弃取培养皿中的原培养基，将滤膜的细胞面向下，移至固化的琼脂层上（培养皿中）轻轻将试样放置于滤膜无细胞面的上面；培养2h+/-10min后，轻轻从琼脂分离滤膜，采用染色程序检测细胞毒性。间接接触试验试样细胞琼脂/培养基培养基滤膜染色间接接触试验滤膜扩散染色：琥珀酸脱氢酶染色Barka和Anderson，1963年活细胞才具有琥珀酸脱氢酶评价定性显微镜观察细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整定量浸提液细胞毒性形态学定性分级级别反应程度全部培养细胞的情况0无胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解，无细胞增殖下降1极轻不超过20%的细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变，偶见细胞溶解，仅观察到极轻微的细胞生长抑制2轻微不超过50%的细胞呈圆缩、无胞浆内颗粒，无大范围细胞溶解，可观察到不超过50%的细胞生长抑制3中度不超过70%的细胞层包含呈圆缩或溶解细胞；细胞层未完全破坏，但可观察到超过50%的细胞生长抑制4重度细胞层几乎或完全破坏琼脂和滤膜扩散试验及直接接触试验反应分级级别反应程度全部培养细胞的情况0无试样周围和试样下面未观察到反应区域1极轻微试样下面有一些畸形细胞或退化细胞2轻微反应区域局限在试样下方范围3中度反应区域超出试样大小一直到1.0cm4重度反应区域超出试样大小1.0cm以上OrdinaryAnalyticMethodsinCellCultureIntegrityofcellmembrane:LDHtest,台盼蓝染色,伊红,苯胺黑(死细胞),etcProliferationandviabilityofthecell:MTT,AlamarBlue,[3H]thymidine,etcFunctionalsecretionofthecellALP,三色染色(胶原),Von-Kossa染色,

茜素红染色(矿物质),etcMorphologyofthecellonmaterialsurface：SEM,TEM,histologicalstain,Immunofluorescencestain,etcAnalyticalmethodsincellculture细胞毒性试验（GB/T16886.5）目的评价医疗器械致细胞毒性反应的潜在可能性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应及其程度。通过采用适当生物学参数来确定哺乳动物细胞的体外生物学反应，判断供试品及浸提液直接或间接接触细胞一定时间后，是否会引起生长抑制、功能改变、溶解、死亡等一系列毒性反应。意义经济、简便的筛选在不同实验室进行重复细胞毒性试验（GB/T16886.5）细胞毒性试验两种评价类型按不同的生物学终点评价细胞形态学评价导致细胞损伤发生形态改变和细胞破坏显微镜直接观察。如：皱缩、变圆、溶解和崩解等细胞膜效应评价以生物膜效应为评价细胞反应的指标，通过染色鉴别死或活细胞，包括中性红染色法、台盼蓝染色法、荧光素染色法等细胞生长能力评价细胞生长速度。细胞增殖度的测定。细胞代谢活力评价检测细胞生物代谢或生物合成功能的改变，如MTT，各种测定蛋白质量、蛋白质合成率和酶活性的方法。按不同接触方式评价细胞毒性试验按不同的接触方式浸提液方式易获取，广泛接触；与实际材料有一定的差异直接接触方式与实际情况相似，但对细胞易产生机械损伤，影响评价的准确性间接接触方式用琼脂或醋酸纤维素膜将试样与细胞分开，在一定程度上模拟了应用情况琼脂扩散滤膜扩散最接近应用状况细胞毒性试验浸提液试验浸提液与细胞的接触时间至少为24h细胞增殖度法细胞生长抑制法（MTT比色法）直接接触试验避免机械损伤可先放入试样，与细胞共培养间接接触试验琼脂扩散：适用于供试样的滤沥物，不与琼脂相互作用滤膜扩散滤膜上培养细胞放试样，培养，染色间接接触试验滤膜扩散在培养皿内放置一张孔径0.45um无表面活性的滤膜，并加入一定量的、密度均匀的细胞悬液移注于细胞培养皿