医学仪器分析专家讲座

仪器分析

InstrumentAnalysis

仪器分析教研室医学仪器分析第1页Companyname传统分离方法，如：分离分析篇蒸馏萃取结晶沉淀过滤电解医学仪器分析第2页Companyname当代惯用分离技术：分离分析篇色谱法(chromatography)固相萃取微滤、超滤反渗透离子交换复杂混合物？分析？医学仪器分析第3页Companyname茨维特试验：用石油醚洗脱植物叶子提取物试验存在两相：固定相:

碳酸钙流动相:

石油醚15.1色谱法引论医学仪器分析第4页Companyname固定相:氧化铝流动相:95%乙醇混合物甲基橙、亚甲蓝分离装置图15.1色谱法引论医学仪器分析第5页Companyname薄层色谱法和纸色谱法15.1色谱法引论医学仪器分析第6页Companyname色谱法：

固定相（stationaryphase）：流动相（mobilephase）：色谱柱（chromatographiccolumn）：

15.1色谱法引论保留组分；洗脱组分并携带组分运动流体；一个内有固定相，用以分离混合物柱管适合于复杂混合物一个分离分析技术；医学仪器分析第7页Companyname色谱法分类：依据流动相状态气相色谱法（GC）气－固色谱气－液色谱液相色谱法

(LC)液－固色谱液－液色谱超临界流体色谱法SFC15.1色谱法引论医学仪器分析第8页Companyname平面色谱法色谱法分类：依据固定相状态纸色谱法薄层色谱法柱色谱法填充色谱柱法（LC用）毛细管柱色谱法（GC用）15.1色谱法引论医学仪器分析第9页Companyname载体+固定液+组分溶解作用填充柱色谱法15.1色谱法引论色谱柱截面图医学仪器分析第10页Companyname毛细管柱色谱法固定液溶解作用毛细管色谱柱色谱柱截面图+组分15.1色谱法引论医学仪器分析第11页Companyname色谱法分类：依据分离机理吸附色谱分配色谱尺寸排阻色谱离子交换色谱亲合色谱

15.1色谱法引论医学仪器分析第12页Companyname色谱法特点：分离效率高灵敏度高：能够检测出pg.g-1(10-12)级甚至更低量。分析速度快应用范围广

15.1色谱法引论医学仪器分析第13页Companyname色谱法应用药品开发、药品质量控制临床检验食品安全环境保护军事领域公安、法医、国家安全部门石油、化工体育、娱乐15.1色谱法引论医学仪器分析第14页Companyname中国制药试验室是当前分离技术最大消费群，占据了24%分离技术市场需求份额，在年到达2亿美元消费额。色谱法应用：15.1色谱法引论医学仪器分析第15页Companyname色谱仪基本结构DetectorCarriergasFloworpressurecontrollerInjectionportColumnDatastation(Recorder)气相色谱流程图15.1色谱法引论医学仪器分析第16页CompanynamePUMPDetectorDatastation(Recorder)ColumnMobilephase液相色谱流程图色谱仪基本结构15.1色谱法引论医学仪器分析第17页Companyname15.2色谱流出曲线（chromatogram）：医学仪器分析第18页Companyname基线基线t信号色谱峰15.2色谱流出曲线医学仪器分析第19页Companyname保留值死时间t0

保留时间tr

调整保留时间tr’trtr’=tr-t0基线tr’t0进样空气峰t信号-定性分析15.2色谱流出曲线医学仪器分析第20页Companyname峰高h与峰面积A区域宽度标准偏差σ峰底宽度W半峰宽W1/2信号基线进样hW1/2Wh/2t-柱效-定量分析15.2色谱流出曲线医学仪器分析第21页Companyname依据色谱峰个数，可判断样品所含最少组分数。依据色谱峰保留值，能够进行定性分析。依据色谱峰面积或峰高,能够进行定量分析色谱峰保留值及其区域宽度是评价色谱柱分离效能依据色谱峰两峰间距离，是评价固定相(或流动相)选择是否适当依据。15.2色谱流出曲线医学仪器分析第22页Companyname1.色谱法含有同时能进行

和

特点而区分于其它方法，尤其对

和

分离，色谱法优势更为显著。2.按固定相外形不一样色谱法是怎样分类？3.什么是气相色谱法和液相色谱法？4.保留时间、死时间及调整保留时间关系是怎样？5.从色谱流出曲线能够得到哪些信息？练习医学仪器分析第23页Companyname15.3色谱分离优化医学仪器分析第24页Companyname15.3色谱分离优化医学仪器分析第25页Companyname15.3色谱分离优化医学仪器分析第26页Companyname供试品主成份峰到达最小理论塔板数要求定量峰与其它峰分离度应大于1.5重复性：取各品种项下对照溶液，连续进样5次，其峰面积测量值相对标准偏差应小于2.0%拖尾因子（T）：用于评价色谱峰对称性T应在0.95～1.05间药典要求色谱系统适用性试验:医学仪器分析第27页Companyname分离度（Resolution,R）15.3色谱分离优化医学仪器分析第28页Companyname意义：分离度可作为色谱柱总分离效能指标R=1.0基本分离不一样R值色谱峰分离程度R<1部分重合R=1.5完全分离15.3色谱分离优化医学仪器分析第29页第一个和第二个峰之间分离度计算答案_________医学仪器分析第30页Companyname色谱基本分离方程式n

柱效

选择因子k容量因子15.3色谱分离优化医学仪器分析第31页Companyname选择因子

意义:表示两组分在给定柱子上选择性，值越大说明柱子选择性越好。

=1.1

=1.4

=1.815.3色谱分离优化医学仪器分析第32页Companyname选择因子影响峰间距组分性质越靠近越难分离增大柱选择性是改进分离度最有力伎俩主要受固定相、流动相性质以及柱温影响,改变固定相和流动相性质和组成，可有效增大。选择因子

与分离度R15.3色谱分离优化医学仪器分析第33页Companyname改变固定相对分离选择性影响15.3色谱分离优化医学仪器分析第34页CompanynamemAU保留时间(min.)80%乙腈20%水246810改变流动相对分离选择性影响15.3色谱分离优化医学仪器分析第35页Companyname容量因子可由色谱图测得容量因子是衡量色谱柱对被分离组分保留能力主要参数k=tr’

t0

容量因子-分离度15.3色谱分离优化医学仪器分析第36页容量因子对分离度影响Rk0246810理想k

范围改变k对分离度几乎没有影响改变k对分离度影响最大12141615.3色谱分离优化医学仪器分析第37页容量因子对分离度影响:当k在0到5范围内时，利用保留作用来提升分离度是最有效.15.3色谱分离优化影响峰位，主要受固定相与流动相性质及固定相用量、流动相组成（LC)、柱温(GC)和流动相流速影响医学仪器分析第38页Companyname柱效与分离度15.3色谱分离优化医学仪器分析第39页Companyname色谱分离过程示意图重复分配15.3色谱分离优化医学仪器分析第40页Companyname理论塔板数和理论塔板高度计算H=n=16trW2=5.54trW1/22Ln理论塔板数和理论塔板高度是衡量柱效指标。在说明柱效时，需说明是对什么物质而言。tRWWi/2保留时间B进样15.3色谱分离优化医学仪器分析第41页计算柱效医学仪器分析第42页CompanynameVanDeemter（范第姆特）方程简式μ：流动相线速A：涡流扩散系数B：分子扩散系数C：传质阻力项系数速率理论15.3色谱分离优化医学仪器分析第43页Companyname初始谱带最终谱带宽度宽度涡流扩散使用细而均匀颗粒并填充均匀是降低涡流扩散和提升柱效有效路径。空心毛细管柱没有涡流扩散。15.3色谱分离优化医学仪器分析第44页Companyname降低分子扩散：分子扩散浓度梯度造成纵向扩散。flash1.可采取相对分子质量较大流动相3.短柱、低温2.较高流动相流速4.在LC中作用小15.3色谱分离优化医学仪器分析第45页Companyname传质阻力15.3色谱分离优化医学仪器分析第46页Companyname传质阻力15.3色谱分离优化产生原因：样品在两相分配，样品未及进入固定相就被带走，或在固定相中延迟重入流动相从而造成峰扩张。降低传质阻力：减小固定液液膜厚度，用分子量小流动相，较低流速。医学仪器分析第47页CompanynameH–u关系曲线u最正确uHB/uC·uH最小扩散-各项贡献：A15.3色谱分离优化医学仪器分析第48页续前柱效和分离度小结：15.3色谱分离优化柱效影响色谱峰宽窄依据速率理论，降低板高主要取决于色谱柱性能、固定液液膜厚度、流动相性质和流速，柱温等。提升柱效、改进分离路径：增加柱长；降低板高。医学仪器分析第49页Companyname拖尾因子：评价峰形参数，目标是为了确保色谱分离效果和测量精度。15.3色谱分离优化医学仪器分析第50页Companyname拖尾因子：5%峰高处峰宽与峰顶点至前沿距离比，惯用T来表示。T=W0.05h/2f15.3色谱分离优化《中国药典》要求定量时T应该在0.95-1.05之间，低于0.95为前延峰，高于1.05为拖尾峰。医学仪器分析第51页AnalyticalEducationCenterBLC2-10TimeinMinutes增大k'增加选择性提升柱效分离优化小结：对于常规分析工作，普通选取：选择因子α来评价固定液有效塔板数N有效来评价色谱柱与分离条件以分离度R作为柱总分离效能指标医学仪器分析第52页t0初始改变?增加?增加?t练习请指出每种情况改变了分离度公式中哪个参数:n,k,or.医学仪器分析第53页练习1.列出提升样品组分保留作用三种方法.2.列出减小色谱峰宽四种方法.3.下面参数中哪些影响柱效?

洗脱强度

流动相黏度

固定相颗粒度

柱长

色谱柱温度医学仪器分析第54页练习例：已知物质A和B在一根30.0cm长柱上保留时间分别为

16.40和17.63min，不被保留组分经过该柱时间为1.30min，峰底宽为1.11和1.21min，试计算（1）柱分离度（2）柱平均塔板数（3）塔板高度（4）达1.5分离所需柱长解：医学仪器分析第55页练习解：例：已知物质A和B在一根30.0cm长柱上保留时间分别为

16.40和17.63min，不被保留组分经过该柱时间为1.30min，峰底宽为1.11和1.21min，试计算（1）柱分离度（2）柱平均塔板数（3）塔板高度（4）达1.5分离所需柱长医学仪器分析第56页续前例：已知物质A和B在一根30.0cm长柱上保留时间分别为

16.40和17.63min，不被保留组分经过该柱时间为1.30min，峰底宽为1.11和1.21min，试计算（1）柱分离度（2）柱平均塔板数（3）塔板高度（4）达1.5分离所需柱长医学仪器分析第57页Companyname1.什么是选择因子？它表征意义是什么？2.什么是分配比（即容量因子）？它表征意义是什么？3.

是衡量柱效指标，色谱柱柱效随

增加而增加，随

增大而减小。4.板高、柱效及柱长三者关系（公式）？5.利用色谱图怎样计算理论塔板数（公式）？思索题医学仪器分析第58页Companyname6.同一色谱柱对不一样物质柱效能是否一样7.塔板理论对色谱理论主要贡献是怎样？8.速率理论简式,影响板高是哪些原因?9.

可作为色谱柱总分离效能指标.10.怎样依据分离度分析色谱分离情况?思索题医学仪器分析第59页Companyname定义：采取气体作为流动相一个色谱法。§16.1气相色谱法概述分为气固吸附色谱和气液分配色谱气体做流动相对分离所起作用较小，主要基于溶质和固定相作用。气体黏度小，在色谱柱内流动阻力小，同时气体扩散系数大，组分在两相间传质速率快，有利于快速高效分离。医学仪器分析第60页Companyname§16.1气相色谱法概述局限：定性困难；不能分析分子量大、极性强或热不稳定化合物。适合用于沸点较低,较易挥发而且热稳定性好化合物特点：高选择性、高柱效、高灵敏度、快速。医学仪器分析第61页Companyname16.2气相色谱仪包含：载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、温控和数据处理系统医学仪器分析第62页Companyname固定液要求普通为高沸点有机化合物。对试样各组分有适当溶解能力,选择性好;挥发性小，热稳定性好;化学稳定性好。16.3分离系统医学仪器分析第63页Companyname烃类硅氧烷类

醇类和醚类酯类和聚酯腈和腈醚等固定液分类弱极性弱极性到强极性强极性中强极性强极性16.3分离系统医学仪器分析第64页Companyname聚硅氧烷类16.3分离系统医学仪器分析第65页Companyname聚硅氧烷类是当前应用最广泛通用型固定液。聚硅氧烷类硅氧烷类经不一样基团修饰可得到不一样极性固定相。含有很高热稳定性和液态温度范围(50～350℃)，16.3分离系统医学仪器分析第66页固定相组成J&WSGE极性100%甲基聚硅氧烷DB-1BP-1非极性5%苯基甲基聚硅氧烷DB-5BP-5弱极性

聚乙二醇DB-WaxBP-20强极性50%苯基甲基聚硅氧烷DB-17BP-17中极性

惯用固定相医学仪器分析第67页Companyname固定液选择：固定液选择普通规律—相同相溶标准非极性和极性混合物试样：选择极性固定液。复杂混合物：使用两种或以上固定液。完全分离前提下，优先选择非极性柱。16.3分离系统医学仪器分析第68页Companyname柱温应低于固定液最高使用温度柱温是影响色谱分离效能和分析时间主要参数柱温选择标准是，在确保难分离物质有良好分离前提下（分离度满足要求），尽可能采取较高柱温，以缩短分析时间，确保峰型对称。组分复杂，沸程宽试样，采取程序升温。柱温选择：16.3分离系统医学仪器分析第69页Companyname恒温：45oC程序升温：30-180oC恒温：145oC温度低，分离效果很好，但分析时间长程序升温，分离效果好，且分析时间短温度高，分析时间短，但分离效果差程序升温医学仪器分析第70页Companyname16.4气相色谱检测器医学仪器分析第71页Companyname原理：含碳物质在氢火焰（以氢气-空气燃烧为能源）中离子化，外电场作用形成电流，电流与待测物质量成正比氢火焰离子化检测器（hydrogenflameionizationdetector）FID医学仪器分析第72页Companyname小结：气相色谱分离条件选择固定液选择柱长和内径及液膜厚度选择载气及流速选择柱温选择检测器及温度选择进样口温度选择进样量选择医学仪器分析第73页Companyname人体排泄物中胆汁酸分析图

色谱峰：1甾醇2胆固醇3粪甾醇4谷甾醇5降胆酸（内标）6石胆酸7异去氧胆酸8去氧胆酸9熊去氧胆酸色谱柱:

CP-Sil19

CB（14%腈丙基-苯基，86%二甲基聚硅氧烷固定相，中等极性）25m

x

0.32mm，0.25μm

，

柱温:

140

℃（1min）→270

℃（10

℃

/min）

载气:氢气（H2），70

KPa

进样器:140

℃

检测器：FID进样量：1μL

毛细管柱用于胆汁酸分离测定

医学仪器分析第74页练习例：两组分在1m长柱子上分离度为0.75，问使用多长柱子能够使它们完全分离？解：练习医学仪器分析第75页Companyname1.利用已知标准物质对照定性一、定性分析15-4色谱法定性和定量分析保留时间峰高增加法双柱比较法(Qualitativeanalysis)条件：严格控制色谱条件医学仪器分析第76页Companyname4.与其它仪器联用，将结构分析仪器作为色谱检测器2.利用相对保留值定性(p303）气相色谱-质谱联用仪15-4色谱法定性和定量分析3.利用保留指数定性（自学）液相色谱-质谱联用仪医学仪器分析第77页Companyname二、定量分析原理:当操作条件一致时，被测组分质量（或浓度）与检测器给出响应信号(峰面积A或峰高h)成正比。（QuantitativeAnalysis

）15-4色谱法定性和定量分析iAiiAfm=ihiihfm=医学仪器分析第78页色谱定性和定量分析方法QualitativeandQuantitativeAnalysisofChromatography定量校正因子绝对校正因子miiAiAf=miiAiAf=iihihmf=15-4色谱法定性和定量分析与仪器灵敏度相关，不轻易测量准确，无通用性。医学仪器分析第79页色谱定性和定量分析方法QualitativeandQuantitativeAnalysisofChromatography相对校正因子isf基准物：TCD→苯；FID→正庚烷与待测物、基准物和检测器类型相关，与操作条件（进样量）无关同类型检测器，相对校正因子能够通用15-4色谱法定性和定量分析医学仪器分析第80页Companyname惯用定量方法外标法（标准校正法）内标法峰面积归一化法15-4色谱法定性和定量分析医学仪器分析第81页外标法123456SamplemAAimi15-4色谱法定性和定量分析医学仪器分析第82页Companyname外标法（标准校正法）特点：分离、检测条件稳定性对定量结果影响很大。为取得高定量准确性，定量校正曲线必须经常重复校正。应用最广、操作简单，适用大批量样品测定。15-4色谱法定性和定量分析医学仪器分析第83页Companyname不存在试样中内标物是高纯化合物内标物与样品能互溶但无化学反应；分子结构、保留值与检测响应最好与待测组分靠近内标物必须能与样品中各组分完全分离；内标物要求：15-4色谱法定性和定量分析内标法医学仪器分析第84页内标法siSample(i)Standard(内标物）ms15-4色谱法定性和定量分析=ssisiimAfAm标准和内标混合进样样品和内标混合进样医学仪器分析第85页Companyname§16-3气相色谱法定性和定量分析配制一系列浓度标样，其中加有等量内标物医学仪器分析第86页Companyname15-4色谱法定性和定量分析

mi

（或Ci

）∝Ai/AS内标标准曲线采集不一样浓度标样色谱图医学仪器分析第87页Companyname按标样峰面积与内标峰面积之比对浓度建立标准曲线15-4色谱法定性和定量分析

mi

（或Ci

）∝Ai/AS无须测校正因子，消除了一些操作条件影响，定量结果较准确,尤其适合于样品前处理复杂、微量组分样品分析。医学仪器分析第88页15-4色谱法定性和定量分析归一化法[前提：样品中全部组分都有响应（出峰）]100%1

=

=niAisiAisiifAfAm%3124简便，不需要标准品；操作条件变动对测定结果影响不大；适合用于多组分同时定量测定。要求全部组分出峰并已知校正因子，限制了其应用。医学仪器分析第89页Companyname思索题1.气相色谱法适合分析什么类型样品?2.气相色谱仪五大系统分别是什么？3.哪类固定液在气相色谱法中最为惯用?4.气相色谱法固定相选择标准是什么？5.普通试验室通常备用哪三种色谱柱，基本上能应付日常分析需要？6.程序升温适合分离什么样品?为何？7.氢火焰检测器适于分析什么样品?8.气相色谱分离操作条件选择中哪两个原因是对分离影响最大？9.色谱法惯用定量分析方法有哪些？各方法特点医学仪器分析第90页高效液相色谱法(HPLC)

HighPerformanceLiquidChromatography医学仪器分析第91页学习内容（一）高效液相色谱法特点（三）高效液相色谱仪（四）化学键合相色谱法（五）高效液相色谱法应用（二）高效液相色谱法流动相医学仪器分析第92页HPLC

以液体为流动相，采取高压输液系统，将流动相泵入装有固定相色谱柱，在柱内各成份被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样分析。LC(一)高效液相色谱法特点医学仪器分析第93页1.分离效能高：每米塔板数可达106。液相色谱分离机理类型多，作为分析时选择余地大；(一)高效液相色谱法特点医学仪器分析第94页类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能异构体分离、族分离，制备分配色谱溶解度各种有机化合物分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析手性色谱立体效应手性异构体分离，药品纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离(一)高效液相色谱法特点医学仪器分析第95页96

溶于水——排阻色谱，水为流动相相对分子质量＞

不溶于水——排阻色谱，非水流动相同系物——分配色谱不溶于水异构体——吸附色谱样品分子大小差异——排阻色谱反相液一液色谱相对分子质量溶于水，不离解＜

排阻色谱，水为流动相碱——阳离子交换色谱溶于水，可离解酸——阴离子交换色谱溶于水，离子与非离子—反相离子对色谱

医学仪器分析第96页各种键合相色谱、离子色谱、疏水色谱、亲和色谱、手性色谱、脂质体色谱、生物膜色谱、整体柱色谱、微径柱和毛细管柱色谱及液相色谱-质谱联用、微芯片液相色谱等。分离模式和分离方法不停增加：(一)高效液相色谱法特点医学仪器分析第97页1.分离效能高：

(一)高效液相色谱法特点固定相用小粒径填料填充而成；医学仪器分析第98页(一)高效液相色谱法特点医学仪器分析第99页纵向扩散对色谱峰扩展影响很小，故：液相色谱速率方程H=A+Cu,提升柱效主要路径:(一)高效液相色谱法特点1.分离效能高：固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。选取低粘度流动相（乙腈<甲醇<水），降低传质阻力。低流速。适当升高柱温。医学仪器分析第100页流动相可选取不一样极性液体，选择余地大，

对组分可产生一定亲和力，并参加固定相组分竞争。流动相增加了控制和改进分离条件参数，对分离起很大作用。

(一)高效液相色谱法特点1.分离效能高：医学仪器分析第101页适合高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物分离分析，不受试样挥发性和分子量限制。(一)高效液相色谱法特点近百分之八十以上有机化合物可用高效液相色谱分析。2.应用范围广：医学仪器分析第102页Slide#103HPLC应用化学工业环境保护制药行业消费产品临床诊疗聚苯乙烯染料邻苯二甲酸酯四环素皮质甾类抗抑郁剂巴比妥盐氨基酸维生素高半胱氨酸生命科学蛋白质多肽核酸类脂类抗氧化剂糖多环芳烃无机离子除草剂医学仪器分析第103页(一)高效液相色谱法特点不足1.尚缺乏灵敏度高通用型检测器2.使用有机溶剂做流动相污染环境3.仪器运行成本高4.降低柱外效应比气相色谱更为主要医学仪器分析第104页（二）高效液相色谱法流动相流动相溶剂类型和组成选择常是分离条件优化首要操作液相色谱流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。可供选取流动相种类较多，从非极性、极性有机溶剂到水溶液，可使用单一纯溶剂，也可用二元或多元混合溶剂。医学仪器分析第105页流动相选择普通要求：

化学惰性好。不与固定相和组分发生反应，确保柱稳定性和分离重现性。高纯度，毒性小、价廉，溶剂清洗和更换方便。注意溶剂截止波长。截止波长是指该溶剂能够在紫外检测器中使用最低波长,低于该波长后,溶剂会有很强紫外吸收，从而影响极限稳定性、干扰对所分析物质检测。低粘度，利于提升传质速率和分离速度（二）高效液相色谱法流动相医学仪器分析第106页溶剂极性以极性参数P′表示，p357表17.2列出惯用溶剂P’,其中水极性最大。调整溶剂极性可使样品组分容量因子在适宜范围流动相溶剂强度与极性（二）高效液相色谱法流动相医学仪器分析第107页

正相色谱：以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相色谱反相色谱：以非极性物质为固定相，极性溶剂为流动相色谱（normal-phasechromatography,NPC）（reversed-phasechromatography,RPC）依据固定相和流动相相对极性分类：（二）高效液相色谱法流动相医学仪器分析第108页在正相色谱中，P′越大，洗脱能力越强，溶质保留值降低。在反相色谱中，P′越大，洗脱能力越弱，溶质保留值增大。（二）高效液相色谱法流动相与固定相极性相近组分tR长医学仪器分析第109页反相HPLC

极性:固定相<流动相固定相-极性弱流动相(甲醇,乙腈等)-极性强极性小物质后出峰正相HPLC 极性:固定相>流动相固定相-极性强流动相(己烷,庚烷)-极性弱极性大物质后出峰正相色谱20%反相色谱80%正相色谱20%反相色谱80%第110页/共49页（二）高效液相色谱法流动相医学仪器分析第110页组分在两种类型分离柱上出峰次序相反。溶质极性：A>B>CCBA时间低极性流动相CBA时间中等极性流动相a.正相色谱ABC时间高极性流动相ABC时间中等极性流动相b.反相色谱医学仪器分析第111页美国Agilent美国Waters日本岛津(Shimadzu)

(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第112页流动相脱气装置高压泵进样器色谱柱检测器(三)高效液相色谱仪包含输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统医学仪器分析第113页高压输液泵

提供（50-500）×105Pa柱前压，将流动相以稳定流速或压力输送到色谱系统。输液泵稳定性直接关系到分析结果重复性和准确性。(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第114页如：流动相：甲醇-0.5%醋酸水梯度以下：0min

30%-70%

5min

30%-70%

10min35%-65%

15min40%-60%

18min50%-50%

流动相控制方式分为等度洗脱和梯度洗脱梯度洗脱（Gradientelution）是采取两种或三种极性不一样溶剂为流动相，各溶剂流量百分比按线性或阶梯形程序改变，逐步增加强溶剂体积百分比以提升流动相洗脱强度。(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第115页以反相色谱为例当等度洗脱时：分析时间长分离度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第116页95%30%甲醇浓度当采取梯度洗脱时：(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第117页梯度洗脱实质是经过不停地改变流动相强度，来调整混合样品中各组分k值，使全部组分都以最正确平均k值经过色谱柱。优点：可提升分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提升分离精度梯度洗脱尤其适合组分保留值差异很大复杂混合物分离。(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第118页进样器功效：将待分析样品引入色谱系统；种类：平头注射器：1～10μL微量注射器带定量管Rheodyne手动进样阀(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第119页自动进样器自动进样100样品盘机械手样品盘第120页/共49页(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第120页六通阀进样装置：优点：耐高压，进样准确，重复性好缺点：轻易造成色谱峰扩张(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第121页(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第122页检测器

功效：将被分析组分在柱流出液中浓度改变转化为光学或电学信号；

分类：

1.紫外吸收检测器

2.二极管阵列紫外检测器3.荧光检测器

4.示差折光化学检测器

5.蒸发光散射检测器

6.电化学检测器(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第123页UVdetectorcell内容积：1-10l光路长：2-10mm紫外检测器UVD(ultraviolet-visibledetector)(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第124页定量：朗伯比耳定律：A＝KCL用于测定有紫外吸收组分只能使用无紫外吸收溶剂为流动相无法扫描组分最大吸收波长紫外检测器特点：(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第125页样品池二极管阵列光栅每一组分可在每一波优点得到一吸光度值光电二极管阵列检测器PDAD（photo-diodearraydetector)(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第126页三维：光谱-色谱图医学仪器分析第127页色谱图minA光谱图nmAA-λ曲线(定性)A-t曲线(定量)(三)高效液相色谱仪医学仪器分析第128页将各种不一样基团经过化学反应键合到硅胶（担体）表面游离羟基上。分为非极性、极性和离子型三种主要类型化学键合固定相(四)化学键合相色谱法是当前应用最广、性能最正确固定相医学仪器分析第129页非极性键合相色谱：(reversedphaseHPLC,RP-HPLC),又叫反相键合相色谱（RPBC）：硅胶表面键合了非极性有机基团(烃基硅烷)固定相常见烃基有丙基、己基、辛基、十六烷基、十八烷基和苯基等；其中以十八烷基键合相（简称ODS或C18）应用最广泛。(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第130页

将硅胶与十八烷基三氯硅烷反应制备。硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第131页C-2orRP-2(Si-CH2CH3)C-8orRP-8(Si-(CH2)7CH3)C-18orRP-18(Si-(CH2)17CH3)(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第132页分离机制：疏溶剂作用理论1）“分子毛”非极性烷基键合相是在硅胶表面覆盖了一层以Si-C键化学键合十八烷基（或其它烃基）“分子毛”。强疏水性(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第133页2）溶质分子（分析物）溶质分子=非极性部分+极性官能团部分(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第134页3）“疏溶剂效应”solvophobicinteraction(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第135页溶质（S）受极性溶剂排斥力，促使溶质与键合非极性烃基配体(L)发生疏溶剂化缔合，形成缔合物。3）“疏溶剂效应”solvophobicinteraction(四)化学键合相色谱法保留：洗脱：溶质分子（S）极性部分受到极性流动相作用，促使其离开固定相，减小保留作用。两种作用力之差决定了被测组分在色谱中保留行为。医学仪器分析第136页溶质保留值影响原因溶质分子结构烷基键合固定相特征流动相性质(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第137页1.溶质分子结构对保留值影响溶质极性越弱，疏水性越强，保留值越大。溶质保留值与其分子非极性部分总面积相关，面积大，保留值大。溶质分子中非极性部分相同，而增加极性基团，则因为增加了溶质分子与洗脱液极性分子间作用力而使ｋ减小。(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第138页OHOHC18(ODS)强弱疏水性Si(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第139页(四)化学键合相色谱法判断以下四个化合物在反相键合相保留次序增加极性基团，使ｋ减小。医学仪器分析第140页伴随烷基碳链增加：增加了键合相非极性作用表面积，增大溶质保留值，增大色谱柱选择性。烷基键合固定相特征对保留值影响：(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第141页例：地西泮分别在C18柱和C8柱上色谱保留流动相：甲醇-水（80︰20）；(四)化学键合相色谱法1.C18柱上色谱图2.C8柱上色谱图医学仪器分析第142页流动相极性对分离影响：惯用流动相：普通以洗脱能力最弱水作为底剂，再加入一定量可与水互溶有机极性调整剂组成；惯用首选极性调整剂为甲醇与乙腈。有机相百分比减小，水相百分比升高：溶剂极性增加，洗脱能力降低，溶质保留时间增加；不一样溶质组分之间分离度增加。(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第143页1:对羟基苯甲酸甲酯2:对羟基苯甲酸乙酯3:对羟基苯甲酸丙酯4:对羟基苯甲酸丁酯有机相:MeOH20%H2O30%H2O40%H2O减小(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第144页流动相PH值对分离影响：分子态溶质具较高疏水性，k值较高；电离成离子态，疏水性降低造成k值下降，电离基团越多，疏水性越弱，k值越小。流动相PH可改变解离溶质离解程度。(四)化学键合相色谱法分离有机弱酸或弱碱，可在流动相中加入0.1～1%甲酸、乙酸、二乙胺、三乙胺或氨水作为调整剂，抑制弱酸解离或弱碱质子化，以取得较高k和α。医学仪器分析第145页正相键合相色谱法：固定相：普通采取极性键合固定相，硅胶表面键合是极性有机基团如氰基、氨基和二醇基键合相。流动相：非极性(惯用环己烷）＋适量极性调整剂（氯仿、醇、乙腈等），以调整流动相洗脱强度。通惯用于分离极性化合物。(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第146页极性键合相极性越大，组分保留值越大。分离机制：分配色谱，依靠溶质分子与固定相之间静电力、诱导力或氢键作用力。组分极性增加,k增大。流动相中极性调整剂极性增大（或浓度增大）,k降低。(四)化学键合相色谱法医学仪器分析第147页相互作用力是什么?非常弱