临床细菌学检验专家讲座

临床细菌学检验芮勇宇南方医科大学南方医院检验科/检验系1临床细菌学检验第1页医学博士、博士后，主任技师（正高）、副研究员，硕士导师，支部书记；南方医院检验科《临床微生物检验室》主任；南方医院检验系《临床微生物学教研室》主任；办公室61642145，手Email:yongyurui@2临床细菌学检验第2页第一部分：标本分类、每一类标本采集注意事项、涂片及判定结果解读；第二部分：药敏结果解读；第三部分：难判定细菌真菌分子判定新技术。3临床细菌学检验第3页细菌标本类别标本明细容器1静脉血静脉血、骨髓血液培养瓶2中段尿无菌尿杯条码开头203粪便灰色头短管粪便容器4痰液无菌痰盒抽吸痰专用痰盒，手工贴条码条码开头205咽拭子无菌拭子管条码开头204临床细菌学检验第4页细菌标本类别标本明细容器6穿刺液（说明标本部位）6.1胸水、腹水、关节腔液、引流液，脑脊液，深部脓液、腹透液等各部位穿刺液无菌拭子管（胸腹水、关节腔液、引流液等需加肝素抗凝）或直接将注射器送检，手工贴条码条码开头205临床细菌学检验第5页细菌标本类别标本明细容器7分泌物（说明标本部位）7.1前列腺液、尿道、阴道、宫颈口等生殖道分泌物无菌拭子管条码开头207.2伤口分泌物无菌拭子管条码开头207.3各部位组织块无菌拭子管条码开头207.4气管、食道等部位刷片刷片盒6临床细菌学检验第6页细菌标本类别标本明细容器8器械8.1气管插管无菌拭子管条码开头208.2动静脉插管、各部位引流管无菌拭子管条码开头208.3各种输液反应液体，医院感染监测物品无菌试验直接送检对应物品8.4空气监测，物表监测，医护人员手培养到细菌室取培养皿或含培养液无菌试管7临床细菌学检验第7页一、血液标本病原菌检验8临床细菌学检验第8页

当前我国社会老龄化日趋严重，慢性病及恶性肿瘤、器官移植、爱滋病和结核病病人不停增多，侵袭性诊疗技术广泛应用，败血症发病率不停增加。败血症病死率30%以上；早期病原学诊疗和合理抗生素治疗，显著降低败血症病死率。9临床细菌学检验第9页血液培养送检指征：发烧>38℃或低温<36℃；白细胞增多>10×109/L，“核左移”白细胞增多；粒细胞降低，成熟多核白细胞<1×109/L；血小板降低；皮肤粘膜出血；心率>90次/分；呼吸频率>20次/分；二氧化碳分压<32mmHg；昏迷；多器官衰竭。10临床细菌学检验第10页最好在抗生素使用前采集，若已用抗菌药须，则尽可能避开血药浓度高峰期；提议第一次可在病人发烧早期或高峰期采集，依据病人发烧情况，在24h内再取2-3份标本，以提升病原菌检出率。血液标本采集注意事项：11临床细菌学检验第11页12临床细菌学检验第12页标准血培养瓶（蓝色帽）：帽子和标签纸左上方为蓝色，“Standard10Aerobic/F”，用于成人需氧菌和真菌培养，血液量3-10ml，8-10ml最正确。

13临床细菌学检验第13页中和抗生素树脂瓶（灰色帽）：帽子和标签纸左上方为灰色，“PLUS+Aerobic/F”，血液量3-10ml，8-10ml最正确。14临床细菌学检验第14页厌氧瓶（黄色或橘红色帽）：帽子和标签纸左上方为黄色，“StandardAnaerobic/F”，血液量3-7ml，5-7ml最正确。

15临床细菌学检验第15页中和抗生素儿童瓶（粉红色帽）：帽子和标签纸左上方为粉红色，“PEDSPLUS/F”,血液量1-3ml。16临床细菌学检验第16页采集标本前先开申请单，到检验科细菌室或门诊领取血培养瓶；采血前先在培养瓶标签纸左侧空白处（箭头所指处）填写抽血时间和病人科别、床号和姓名；不要在培养瓶条形码上涂写，以免影响扫描。17临床细菌学检验第17页将标签纸上条形码右侧部分（含数字）撕下贴于检验申请单上；而其它标本均是将申请单上双联号码撕下贴于标本上。18临床细菌学检验第18页注射器采血后，将血培养瓶帽子揭下，橡皮由金属皮（围脖）固定于瓶上；将橡皮塞用70%酒精消毒，注射器针头刺穿橡皮塞将血注入培养瓶内；橡皮塞裸露即可。19临床细菌学检验第19页细菌室接到已采集血液培养瓶后，马上放入自动血液培养检测仪，自动培养及实时检测。20临床细菌学检验第20页阳性初步结果汇报：仪器阳性报警，90%以上阳性标本24h内检出；取出阳性瓶，对血液涂片及革兰氏染色；马上将涂片结果（G+、G-细菌，球菌或杆菌，或真菌）电话通知对应科室，并在网上发出；利用阳性血液进行K-B法药敏试验，第二天将初步药敏结果电话通知对应科室。结果汇报形式21临床细菌学检验第21页血液涂片22临床细菌学检验第22页血液涂片23临床细菌学检验第23页血液涂片24临床细菌学检验第24页血液涂片25临床细菌学检验第25页血液涂片26临床细菌学检验第26页血液涂片27临床细菌学检验第27页阳性最终止果汇报：将阳性血液接种血平板培养细菌；第二天将血平板上生长细菌判定及MIC法药敏试验；第三天发判定及MIC法药敏结果正式汇报。阴性结果汇报：如培养5天仍为阴性，再接种血平板培养一天，核实为阴性后再发汇报。结果汇报形式28临床细菌学检验第28页二、中段尿标本病原菌检验29临床细菌学检验第29页检测泌尿系统感染；普通进行细菌和真菌培养、菌落计数和药敏；也可离心后对沉渣进行涂片检验，革兰染色或抗酸染色；也可用于淋球菌培养和涂片检验。目标和意义30临床细菌学检验第30页最常采集中段尿，晨起第一次尿送检最正确；先用肥皂水、或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗女性外阴部及尿道口或男性尿道口，再用灭菌水清洗，最终用灭菌纱布檫拭；排尿弃去前段尿，留取中段尿约10ml于无菌容器内加盖送检。采集方法31临床细菌学检验第31页尿道病原菌可在温暖尿液中繁殖，中段尿标本采集后应尽快送检，不然将影响病原菌计数准确性；排尿困难者可导尿，防止屡次导尿所致尿路感染，导尿包必须为无菌合格产品。采集方法32临床细菌学检验第32页不染色涂片尿沉渣真菌

33临床细菌学检验第33页中段尿34临床细菌学检验第34页中段尿35临床细菌学检验第35页“培养出3种以上细菌，疑采集污染，重留标本”：如培养出3种或以上细菌，且无优势菌；约10%标本不合格，采集时污染，采集中段尿（尤其女性）最好由专门医护人员指导采集，以降低污染。结果汇报形式36临床细菌学检验第36页“培养出少许某种细菌、菌落计数结果”：如菌量较少<103ml，但为单一菌种，可能为采集时污染，也可能是真正感染，临床医生可依据病人临床表现判断或再留取标本送检。结果汇报形式37临床细菌学检验第37页“培养出某种细菌、菌落计数结果、药敏结果”：普通认为细菌或真菌105／ml，且必须有优势，才能够确定为感染，对优势菌进行判定和药敏。104／ml至105／ml，也有意义。结果汇报形式38临床细菌学检验第38页三、粪便标本病原菌检验对肠道感染进行病原学诊疗。涂片革兰染色查细菌、球/杆菌比、真菌。涂片暗视野查弧菌；抗酸染色。培养沙门氏和志贺菌；培养弧菌；培养真菌；菌群失调病人，对占优势细菌进行判定药敏。39临床细菌学检验第39页标本采集：挑取含脓、血或粘液粪便约2-3g；置于清洁容器或置于保留液中送检；排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子采集。40临床细菌学检验第40页检验上下呼吸道感染痰液（下呼吸道）和咽拭子（咽喉部）；可进行涂片查细菌、真菌或抗酸杆菌；可进行细菌、真菌或结核杆菌培养；上述检验只要一口痰即可，在一张检验申请单上选上述多个项目。四和五、呼吸道标本病原菌检验41临床细菌学检验第41页采集深部痰，不是唾液和口水。自然咳痰法，最好为清晨第一口痰，用清水重复漱口用力咳出第一口痰于无菌容器内；支气管镜采集法。采集方法

42临床细菌学检验第42页痰液43临床细菌学检验第43页痰液44临床细菌学检验第44页痰液45临床细菌学检验第45页痰液46临床细菌学检验第46页痰液47临床细菌学检验第47页痰液48临床细菌学检验第48页全球每年增加结核病人约800万

1000万，死亡病人约300万；我国高发，广东也较高;结核分枝杆菌菌体表面含脂质成份，不易着色，但一经着色后，在酸或乙醇作用下也不轻易脱色；抗酸性菌呈红色，其它细菌及细胞等背景呈蓝色；油镜下查遍整个涂片，或最少100个视野。涂片抗酸染色：检验抗酸杆菌49临床细菌学检验第49页1984年国内统一暂行要求汇报方式：未找到抗酸杆菌；找到抗酸杆菌1或2个，全视野发觉1或2个；找到抗酸杆菌+，全视野发觉3-9个；找到抗酸杆菌++，全视野发觉10-99个；找到抗酸杆菌+++，每视野发觉1-9个；找到抗酸杆菌++++，每视野发觉10个以上。

涂片抗酸染色：检验抗酸杆菌50临床细菌学检验第50页51临床细菌学检验第51页报“正常菌群”：培养出均为不致病细菌；培养出细菌种类较多且无优势菌。报“无菌生长”：病人抗生素使用过分造成。结果汇报形式

52临床细菌学检验第52页报“分离出某种细菌或真菌，百分比，药敏”：分离出致病菌，而不是常见正常菌群，且含有优势，约占血平板菌群总数百分比%；同一病人如痰中连续分离出同一个菌，3天内假如已经做过药敏试验，则不再做药敏；同一病人痰中细菌种类和百分比，会伴随治疗情况改变，也受留取痰标本质量影响。结果汇报形式

53临床细菌学检验第53页六、穿刺液（脑脊液）病原菌检验脑脊液采集：经过腰椎穿刺术（Lumberpuncture）以无菌操作采集脑脊液3-5ml于无菌小瓶或无菌试管中，普通第一管用于病原菌检验，第二管用于理化检验，第三管用于细胞学检验。54临床细菌学检验第54页六、穿刺液（脑脊液）病原菌检验引发脑膜炎病原体脑膜炎奈瑟菌等抵抗力弱，不耐冷，故采集脑脊液应马上保温送检或床边接种。可查普通细菌真菌、隐球菌、抗酸杆菌。55临床细菌学检验第55页新生隐球菌广泛分布于自然界，可存在人体体表、口腔及肠道；经呼吸道侵入人体，由肺经血行播散时，可侵犯全部脏器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜；好发于细胞免疫功效低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者；临床上怀疑隐球菌性脑膜炎时，常抽取脑脊液进行墨汁染色。墨汁染色查隐球菌56临床细菌学检验第56页脑脊液离心3500r/m，10分钟；弃上清，沉渣涂片；墨汁染色时，先取一玻片，编号，先滴1滴印度墨汁，再将沉渣涂片，将适量墨汁和沉渣混匀，盖上盖玻片；将显微镜视野调暗，先用低倍镜观察全片，再用高倍镜观察可疑细胞；必须找到经典形态隐球菌，荚膜清楚，大小不一，有出芽等；非致病性隐球菌无荚膜。墨汁染色查隐球菌57临床细菌学检验第57页墨汁染色新型隐球菌58临床细菌学检验第58页59临床细菌学检验第59页60临床细菌学检验第60页其它穿刺液：如胸腹水、关节腔液等，穿刺针注入无菌试管送检或将注射器直接送检；如为多管穿刺液或相关组织，请在申请单上注明是否都做培养判定；采集注意事项：注意无菌操作；如培养出类白喉杆菌，常为采集时污染所致；可用血液培养瓶培养。61临床细菌学检验第61页七、分泌物（伤口或脓液）病原菌检验开放性化脓灶：应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用棉拭子蘸取或注射器吸收脓性分泌物。瘘管内脓液：先用灭菌棉拭子挤压瘘管弃去前端脓液，再搜集脓汁。62临床细菌学检验第62页七、分泌物（伤口或脓液）病原菌检验封闭性脓肿：可用注射器穿刺抽取。疑为厌氧菌感染者：取脓液后马上排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检；外界相通部位标本，如痰不能作厌氧菌培养。63临床细菌学检验第63页七、分泌物（生殖道）病原菌检验性传输疾病，简称性病，是一组经过性行为传输，侵犯皮肤、性器官和全身多脏器损害感染性疾病。标本采集：常取生殖道分泌物，男性取尿道口分泌物或前列腺液，女性取外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物等。64临床细菌学检验第64页G-双球菌65临床细菌学检验第65页白带66临床细菌学检验第66页淋病涂片染色镜检：急性淋菌性尿道炎敏感度和特异度高达90%以上；对慢性无症状淋病女性患者涂片检验漏诊率达40%，故必须同时进行培养。培养判定及药敏结果准确，诊疗金标准。67临床细菌学检验第67页解脲/人型支原体：开展了培养判定及药敏试验；需注意是标本采集后应尽快送检。诊疗试剂和方法要符合卫生部相关要求；注意保护病人隐私。68临床细菌学检验第68页八、器械病原菌检验静脉插管等标本：放入无菌试管中送检；无菌试验：怀疑医疗用具被污染时送检；空气培养：到细菌室取培养平皿置于待测地点，打开平皿盖10min，盖上后送检；医护人员手培养和物表培养：到细菌室取含消毒剂中和液无菌试管，用棉签涂抹后放入试管中送检。69临床细菌学检验第69页第一部分：标本分类、标本采集注意事项、涂片及判定结果解读；第二部分：药敏结果解读；第三部分：难判定细菌真菌分子判定新技术。70临床细菌学检验第70页稀释法（dilutionmethod）和K-B纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauerdiscagardiffusionmethod）；稀释法结果比K-B法更准确。本试验室利用细菌自动判定和药敏仪，为稀释法药敏试验，由仪器自动判断药敏结果。药敏检测方法71临床细菌学检验第71页依据临床试验室标准化委员会（clinicallaboratorystandardsofinstitute,CLSI）标准判断敏感（susceptible，S）：推荐使用；中介（intermediate，I）：药品MIC靠近体液或组织可到达药品浓度，但反应低于敏感株；耐药（resistant，R）；指常规用药剂量不能到达MIC，临床疗效不可靠。药敏检测方法72临床细菌学检验第72页抗菌药品作用靶位73临床细菌学检验第73页氨基糖甙类：阿米卡星Amikacin、庆大霉素Gentamicin1代头孢：头孢唑啉Cefazolin2代头孢：头孢呋辛钠Cefuroximesodium3代头孢：头孢他啶Ceftazidime、头孢噻肟Cefotaxime、头孢吡肟（马斯平）Cefepime细菌室药敏试验中常选取抗生素种类74临床细菌学检验第74页单环β-内酰胺类：氨曲南Aztreonam广谱青霉素类：氨苄西林Ampicilin、青霉素GPenicillin、苯唑西林Oxacillin抗假单胞菌广谱青霉素：哌拉西林Piperacillin75临床细菌学检验第75页复方β-内酰胺类：阿莫西林-克拉维酸（奥格门丁）Amoxicilin/clavelanate、氨苄西林-舒巴坦（优力新）Ampicillin/Sulbactam、哌拉西林-他唑巴坦（特治星）Pioeracillin/Tazobactam、头孢哌酮-舒巴坦（舒普深）efoperazone/Sulbactam碳青霉烯类：亚胺培南Imipenem、美罗培南Meropenem76临床细菌学检验第76页多肽类：多粘菌素EColistinE、替考拉宁Teicoplanin、万古霉素Vancomicin磺胺类：复方新诺明（甲氧苄唑-磺胺甲唑）Timethoprim/Sulfamethoxazole林可霉素类：克林霉素Clindamycin大环内脂类：红霉素Erythromycin77临床细菌学检验第77页氯霉素：氯霉素Chloramphenicol三代喹诺酮：环丙沙星Ciprofloxaxin、氧氟沙星Ofloxaxin、左旋氧氟沙星Levofloxacin、莫丙沙星Moxifloxacin四环素类：四环素Tetracycline利福平Rifampin78临床细菌学检验第78页产超广谱β-内酰胺酶(extendedspectrumβ-lactamase，ESBL)：该酶水解青霉素、头孢菌素及单胺类超广谱β-酶，主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生；CLSI要求，ESBL确认试验（+）：则对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南均应汇报耐药，而不考虑体外药敏结果，提议用碳青霉烯类抗生素。79临床细菌学检验第79页耐甲氧西林葡萄球菌（methecillinresistancestaphylococcus，MRS），CLSI要求，葡萄球菌如对苯唑西林（或甲氧西林）耐药：对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂复方制剂均应汇报耐药，而不考虑体外药敏结果。80临床细菌学检验第80页耐高浓度庆大霉素肠球菌（HighlevelaminoglycosidesresistanceinEnterococcus）CLSI要求，肠球菌引发全身性严重感染，常联合应用β-内酰胺类和氨基糖肽类抗生素，假如肠球菌对高浓度庆大霉素耐药，则联适用药无效。81临床细菌学检验第81页3、临床分离菌株分布和药敏分析利用WHO提供WHONET软件，建立细菌耐药监测数据库。能够对不一样时期、不一样科室、不一样属种、不一样类型标本等资料分别进行分析。下面介绍本院09年细菌耐药资料分析结果。82临床细菌学检验第82页83临床细菌学检验第83页84临床细菌学检验第84页85临床细菌学检验第85页86临床细菌学检验第86页87临床细菌学检验第87页88临床细菌学检验第88页89临床细菌学检验第89页90临床细菌学检验第90页91临床细菌学检验第91页92临床细菌学检验第92页93临床细菌学检验第93页94临床细菌学检验第94页95临床细菌学检验第95页96临床细菌学检验第96页97临床细菌学检验第97页98临床细菌学检验第98页99临床细菌学检验第99页100临床细菌学检验第100页101临床细菌学检验第101页102临床细菌学检验第102页103临床细菌学检验第103页104临床细菌学检验第104页第一部分：标本分类、标本采集注意事项、涂片及判定结果解读；第二部分：药敏结果解读；第三部分：难判定细菌真菌分子判定新技术。105临床细菌学检验第105页临床常见细菌判定关键点106临床细菌学检验第106页临床常见细菌判定关键点G+球菌G-球菌G-杆菌G+杆菌氧化酶，O/F肠杆菌科非发酵菌分枝杆菌菌落特征、革兰/抗酸染色触酶葡萄球菌+肠球菌-链球菌-触酶，氧化酶奈瑟菌++布兰汉菌++4糖：葡乳麦蔗DNA，N硝还107临床细菌学检验第107页临床常见G+球菌判定关键点葡萄球菌链球菌肠球菌触酶+触酶—触酶—金葡溶血凝固酶+溶血葡溶血凝固酶-表皮葡不溶血凝固酶-肺炎链α溶血奥扑托辛S化脓链β溶血杆菌肽S无乳链β溶血CAMP+高盐七叶苷阿拉伯糖屎肠阿+粪肠阿-108临床细菌学检验第108页发酵菌氧化/发酵，+/+肠杆菌科例外：非发酵菌氧化/发酵，+/-不动杆菌：G-球杆菌；嗜麦芽寡养单胞菌：菌落黄色。例外：发酵菌氧化/发酵，+/+弧菌属非发酵菌氧化/发酵，+/-假单胞菌属氧化酶-氧化酶+临床常见G-杆菌判定关键点O/F，KIA肠杆菌科生化O/F非发酵菌生化血清学判定O157：H7、沙门菌属、志贺菌属血清学判定109临床细菌学检验第109页临床分离细菌真菌中，有少部分经过传统生化反应和表型方法难以判定，给临床诊疗和治疗带来困难。当前细菌真菌核糖体基因序列分析，已经成为分类金标准。伴随分子生物学技术飞速发展，依据细菌和真菌基因组特点，对它们核糖体基因进行扩增并测序，能够准确说明难判定病原菌属种。110临床细菌学检验第110页细菌16SrRNA编码基因由保守区和可变区组成，保守区为细菌共有，细菌间无差异,可变区含有属种差异。真菌5.8SrRNA基因和28SrRNA基因由保守区和可变区组成，它们之