内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤专家讲座

Microvesiclesderivedfromendothelialprogenitorcellsprotectkidneyfromischemia-reperfusioninjurybymicroRNA-dependentreprogrammingofresidentrenalcell主讲人：JACKY内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第1页文件介绍起源：KidneyInternational;publishedonline11April2012.

作者：VincenzoCantaluppietal.科研机构：UniversityofTorino,Torino,Italy.内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第2页内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第3页文件摘要内皮前体细胞经过旁分泌含有逆转急性肾损伤作用。从前体细胞分泌微囊泡经过mRNA水平转移激活了内皮细胞血管形成程序。微囊泡中RNA富含miRNA，这些miRNA能够调整细胞增殖、促进血管形成、抗凋亡。缺血再灌注后，经过静脉注射微囊泡，这些囊泡主要集中在管周毛细血管、肾小管上皮细胞。经过促进肾小管上皮细胞增殖，降低凋亡和白细胞浸润对肾小管形态和功效保护。微囊泡也能经过抑制毛细血管稀疏化、肾小球硬化和管周间质纤维化来延迟缓性肾损伤进程。这些微囊泡保护作用在经过RNase预处理、经过敲除祖细胞Dicer基因来非特异性抑制祖细胞中miRNA产生、经过转染特异性miR-antagomirs来使促血管生成miR-126和miR-296表示降低。所以，内皮祖细胞起源微囊泡经过它们RNA成份来保护肾脏免受缺血造成急性损伤，这些RNA成份中miRNA有利于低氧环境下肾固有细胞开启增殖程序。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第4页EPC内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)是血管内皮细胞前体细胞，亦称为成血管细胞(angioblast)，在生理或病理原因刺激下，可从骨髓动员到外周血参加损伤血管修复。1997年，Asahara等首次证实循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞前体细胞,并将其命名为血管内皮祖细胞。近年来研究显示,内皮祖细胞在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥主要作用，并为缺血性疾病研究治疗提供了新思绪。EPCs生物学特征和治疗作用研究成为这一领域新热点。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第5页MVMicrovesicle（MV）是机体内细胞在正常和病理状态下都会分泌直径在30~1000nm之间微小囊泡。多数研究者用MV来指代含有细胞间信号传递功效囊泡。细胞把特异生物活性分子如蛋白质、miRNA等包裹到MV中，被运输到对应受体细胞并调整受体细胞生物功效。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第6页

EPC起源MV一些基本特征内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第7页miRNA微小核糖核酸(microRNA，简称miRNA)，是一类非编码由19-24个核苷酸组成小分子单链RNA,它们能够与靶mRNA碱基互补配对而起作用，使mRNA降解或抑制其翻译，从而参加各种主要生理和病理过程。miRNA可稳定存在于血清血浆等体液中，有可能作为一个新生物标志物用于临床，有助诊疗疾病或者判断疾病预后和复发情况，指导用药和选择治疗方式。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第8页miRNA产生和转运机制miRNA产生及其作用方式视频内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第9页试验目标内皮祖细胞释放微囊泡对肾脏急性缺血再灌注损伤动物模型是否有保护效应;微囊泡对低氧诱导肾脏上皮细胞和内皮细胞损伤保护作用机制研究？内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第10页试验材料及方法Wistar雄性大鼠EPCs和fibroblast细胞RNase;siRNA;anti-miR-126antagomiRS;anti-miR-296antagomiRS;anti-Dicerpolyclonalantibody;内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第11页试验分组内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第12页BioanalyzerRNAprofileEPCEPCMV内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第13页miR-126andmiR-296含量比较EPCEPCMVFIBROFIBROMV内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第14页经过不一样处理后miR-126和miR-296含量内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第15页试验过程1、按照分组制作模型，马上尾静脉注射MV。↓2、试验第二天，全部组，每组处死6只大鼠取样本分析。↓3、试验第七天，全部组，每组处死6只大鼠取样本分析。↓4、试验第180天，前四组，每组处死6只大鼠取样本分析。IRI模型：右肾切除+左肾肾蒂夹闭45min。MV经由尾静脉注射，30微克。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第16页试验结果EPC起源MV和成纤维细胞起源MV特征及其比较EPC起源MV对肾脏缺血再灌注损伤保护作用EPC起源MV对体外培养低氧管周内皮细胞（TEnCs）和肾小管上皮细胞(TEpCs)影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第17页EPC起源MV对肾脏缺血再灌注损伤保护作用血肌酐和尿素氮水平病理学形态检验细胞凋亡及增殖检测长久影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第18页血清肌酐和尿素氮内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第19页MV注射后在体内分布情况内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第20页病理检验内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第21页形态学评价内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第22页细胞增殖率检测（a、cBrdu；b、dPCNA）内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第23页细胞凋亡检测（TUNEL法）内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第24页炎细胞浸润内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第25页长久结果（六个月后）内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第26页小结以上试验结果表明：EPC起源MV对IRI模型含有保护作用。能使血肌酐、尿素氮降低，细胞增殖加紧、凋亡降低。长久结果还能降低间质纤维化，促进血管形成。去除MV中miRNA-126/296无此效果。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第27页这些MV是到血管内皮细胞和肾小管上皮细胞呢如何定位？内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第28页不一样表面蛋白分子对MV内化影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第29页不一样起源MV内化区分内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第30页mvproteinsurfaceexpressionEPC-derivedMVFibroblast-derivedMV内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第31页proteinsurfaceexpression区分内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第32页EPC-derivedMV对低氧环境培育TEnCs细胞凋亡、血管生成影响TUNEL法检测TEnDs凋亡毛细血管样结构检测促血管生成作用内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第33页EPC-derivedMV对低氧环境培育TEnCs促血管生成相关基因表示影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第34页EPC-derivedMV对低氧环境培育TEpCs细胞凋亡影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第35页EPC-derivedMV对低氧环境培育TEpCs凋亡相关基因表示影响内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第36页内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第37页结论注射含有miR126/296MV大鼠血肌酐和尿素氮水平显著降低；显著改进肾小球、肾小管和肾间质形态学表现；能使小管坏死降低、管型生成降低；而且能够抑制细胞凋亡、促进细胞增殖；降低炎细胞浸润。长久结果是：血肌酐水平下降，间质纤维化降低和血管生成增多，不论是短期结果还是长久结果，都显示出miRNA126/296对IRI模型形态学和功效学保护作用。内皮祖细胞微囊泡肾脏缺血再灌注损伤第38页L-selectin是介导MV内化主要表面蛋白分子。含有miR126/296MV内化后，能够使凋亡相关基因表示下调，抑制上皮细胞和内皮细胞凋亡，血管形成相关基因表示上调，促进血