配子和胚胎的冷冻及复苏规范

关于配子和胚胎的冷冻及复苏规范冷冻是保存组织和细胞重要方法

（低温医学）体外培养1年干冰－79℃数月液氮－196℃永久保存分子运动，生理生化反应停止，任何损伤也无法修复自发突变率1％第2页,共49页，星期六，2024年，5月一、冷冻对细胞的损伤

(37℃－196℃)

冷冻危险区（-15℃—-50℃）冰晶形成溶液效应渗性休克保护剂毒性寒冷第3页,共49页，星期六，2024年，5月冰晶形成特点有结构六角形晶体只与水分子结合，排除其它溶质先形成冰核，同质成核－35℃－40℃，异质成核－10℃－15℃（过冷）一旦冰核形成，冰晶迅速增大密度变小，体积增大第4页,共49页，星期六，2024年，5月1.冰晶形成及对细胞的损伤体积增大产生压力，冰晶穿孔胞浆渗漏细胞内物质分布改变结晶只与水分子结合，排斥其它任何溶质，随着冰晶的增大，像犁一样将细胞的其它成分挤在狭小的空间，细胞内间隙缩小，细胞内成分相互接触，发生不正常反应溶质浓度上升，结晶析出，PH变化，蛋白质可溶性降低，有害物质浓度升高复苏后局部低渗，结晶的溶质不会再溶解复苏气泡形成，冷冻速率快，气泡多而小，含碳酸盐严重第5页,共49页，星期六，2024年，5月2.细胞外溶液效应细胞悬浮在溶液中慢速冷冻细胞外液结冰导致细胞外渗透压上升是细胞脱水的关键脱水太慢，溶液浓度过高对细胞内蛋白有毒性，（脂蛋白变性，细胞达到最小体积以下）第6页,共49页，星期六，2024年，5月0.16M－5MOoo第7页,共49页，星期六，2024年，5月3.渗性休克复苏时细胞外冰融化造成低渗，细胞内渗透压高，细胞外水进入细胞内过快，细胞肿胀第8页,共49页，星期六，2024年，5月4.渗性保护剂的毒性溶液浓度，暴露时间和温度越高毒性越大不同种类渗性保护剂毒性的差别种类已二醇甘油二甲亚砜丙二醇已酰胺胚胎发育能力％988868160第9页,共49页，星期六，2024年，5月5.寒冷对细胞的损伤37℃—0℃寒冷损伤,20℃～0℃细胞膜双层脂质结构，含水30％～50％,其余为脂蛋白，对寒冷敏感，低温脂类变硬，脂蛋白分解，变性脂质的含量和成分影响细胞对冷冻的耐受性脂质含量丰富的牛、猪卵母细胞易受寒冷的损伤，卵磷脂/胆固醇比值大，柔韧性好，耐受冷冻第10页,共49页，星期六，2024年，5月二、预防冷冻损伤的方法冷冻保护剂——渗性，非渗性，大分子控制冷冻和复苏的速率－细胞种类，温度快速去除冷冻保护剂第11页,共49页，星期六，2024年，5月（一）冷冻保护剂的种类和作用1.渗性2.非渗性3.大分子第12页,共49页，星期六，2024年，5月1.渗性保护剂的作用无限降低冰点（1000g水＋1mol溶质冰点降低1.86℃，浓度足够高冰点～共熔点玻璃化而不结冰）与水形成氢键，维持结合水替换细胞内液态水，细胞失水后体积和溶质浓度变化小第13页,共49页，星期六，2024年，5月渗性保护剂的渗透性种类已二醇丙二醇二甲亚枫甘油分子量g/mol62.0776.178.1392.09已二醇分子量小，渗透性好，进出细胞快，毒性低用于玻璃化冷冻第14页,共49页，星期六，2024年，5月2.非渗性保护剂的作用不能进入细胞内（蔗糖，葡萄糖，果糖，海藻糖）冷冻时有助于细胞脱水复苏时防止水分过快进入细胞，预防渗性休克，促进渗性保护剂外流降低细胞膜损伤第15页,共49页，星期六，2024年，5月3.大分子物质促进玻璃化形成增加细胞膜的稳定性减少渗性保护剂毒性，Ficoll，PVP，聚丙烯甘油，蛋白质第16页,共49页，星期六，2024年，5月（二）影响冷冻速率的因素细胞本身的特性：膜渗透性，表面积/体积比不同温度冷冻后膜渗透性改变第17页,共49页，星期六，2024年，5月1.细胞本身的特性不同的细胞膜渗透性，表面积/体积不同，降温速率不同鼠卵母细胞和胚胎耐受冷冻，猪牛差人囊胚比早期胚胎渗性差，脱水慢鼠胚0.5℃，卵母细胞0.3~1℃,精子10℃，仓鼠细胞100℃，红细胞>1000℃/min）第18页,共49页，星期六，2024年，5月A鼠胚B红细胞第19页,共49页，星期六，2024年，5月2.温度对脱水的影响温度越高，脱水越快，温度每降10℃，脱水速度减半第20页,共49页，星期六，2024年，5月温度对脱水的影响

降低10度脱水速率减半第21页,共49页，星期六，2024年，5月降温快，无冰卵母细胞少，存活少A存活卵母细胞B无冰卵母细胞第22页,共49页，星期六，2024年，5月降温速率过快细胞膜的渗透性下降，细胞脱水越少，体积变化越少，水分未充分脱出，细胞内外大量冰晶形成第23页,共49页，星期六，2024年，5月降温速率太慢细胞脱水越多，最小体积的理论，永久的损害细胞暴露在高渗环境时间长（溶液效应）脂蛋白变性，细胞溶解第24页,共49页，星期六，2024年，5月3.冷冻后细胞膜渗透性的改变冷冻改变细胞的渗透性，原来不能通过细胞膜的物质冷冻后可透过。第25页,共49页，星期六，2024年，5月4.解冻的速度太快：胚胎吸收水分过快，过多－渗性休克取出冷冻管在空气中停留40s太慢：形成细胞内结晶快慢之间界限很窄，细胞内重新结晶开始于－85℃～－70℃，冷冻管在空气中摇动一定时间当其温度接近－80，换成快速升温，置30℃水浴中第26页,共49页，星期六，2024年，5月三、冷冻的方法（冻干技术）程序，平衡，慢速快速，玻璃化,第27页,共49页，星期六，2024年，5月慢速冷冻前细胞与冷冻保护剂的平衡第28页,共49页，星期六，2024年，5月冰晶与玻璃态的区别玻璃化非结晶，无结构，玻璃样固态瞬间终止一切活动，不存在离子和溶质在细胞内的再分布，理论上对细胞的损伤小是保存生物样品材料理想的方法第29页,共49页，星期六，2024年，5月四、冷冻的步骤适应症胚胎的选择慢速冷冻快速冷冻第30页,共49页，星期六，2024年，5月胚胎冷冻的适应症保存移植后剩余的胚胎有OHSS危险患者的胚胎接受赠卵由于突发疾病或其它原因暂时不能移植保存生育功能第31页,共49页，星期六，2024年，5月胚胎的选择符合移植或冷冻标准的胚胎囊胚形成率48～51％，不符合者囊胚形成率41.7％(FertilSteril2000,74:495,humreprod1998,13:2869)第32页,共49页，星期六，2024年，5月胚胎的选择(碎片）组别继续培养胚胎数囊胚形成数囊胚形成率％≤5％2807225.7>5≤20%1092724.8>20≤50%851315.3>50%53611.3合计52711822.4P<0.01第33页,共49页，星期六，2024年，5月胚胎的选择（细胞数）细胞数培养胚胎数囊胚数囊胚形成率％<410232.94~63349428.1>6381539.5合计47411223.6P<0.01第34页,共49页，星期六，2024年，5月胚胎的选择（发育速度）发育速度胚胎数囊胚数囊胚形成率％停滞2142813.1迟缓2608432.3合计47411223.6不符合冷冻标准胚胎继续培养形成囊胚冷冻复苏31例，移植17例，3例妊娠第35页,共49页，星期六，2024年，5月冷冻胚胎的选择卵裂期：≥4细胞，碎片≤20％原核期:透明带完整，原核清晰可见，胞质健康受精后20～22h囊胚期：内细胞团清晰，滋养细胞呈镰刀状连续平铺于透明带内，透明带变薄第36页,共49页，星期六，2024年，5月卵裂期和原核期程序化冷冻

冷冻前准备－与冷冻保护剂平衡37℃A0.5MPPD＋人血清白蛋白12mg/ml5minB1MPPD＋人血清白蛋白12mg/ml5minC1.5MPPD＋人血清白蛋白12mg/ml10minD1.5MPPD＋人血清白蛋白12mg/ml+0.1M蔗糖min装管第37页,共49页，星期六，2024年，5月程序冷冻2℃/min降温至－6℃停留5min植冰再停留10min0.3℃/min降温至－35℃10℃/min降温至－150℃立即投入液氮第38页,共49页，星期六，2024年，5月慢速冷冻防止过冷－植冰慢速冷冻的关键是细胞溶液外结冰，细胞内脱水，一般细胞外先结冰，因为细胞内渗透压高冰点以下仍未结冰，纯水过冷－35℃，温度越低，结冰的可能性越大过冷达到细胞内冰点使细胞内结冰过冷使细胞外结冰时间不一致，保证在特定的温度细胞外开始结冰第39页,共49页，星期六，2024年，5月复温空气中30～40s去液氮30℃～35℃水浴至冰融化40s3ml0.5M蔗糖＋12mg/ml人白蛋白10min3ml0.2M蔗糖＋12mg/ml人白蛋白10min100ul12mg/ml人白蛋白液滴1min洗7次最后液滴30min培养液中移植第40页,共49页，星期六，2024年，5月玻璃化冷冻室温10％DMSO＋10％EG＋20％SSS4min20％DMSO＋20％EG＋20％SSS＋0.4M蔗糖20s冷冻环液体体积<1ul,胚胎与玻璃化冷冻液接触时间30s内第41页,共49页，星期六，2024年，5月玻璃化复苏复苏液37℃冷冻环置37溶液上方，一旦融化立即放入复苏液内1M蔗糖＋0.25％SSS5min0.25M2～3min0.125M1～2min20％SSS磷酸缓冲液洗1min－培养液中洗数次第42页,共49页，星期六，2024年，5月慢速冷冻与玻璃化冷冻比较冷冻方法浓度速率平衡细胞外结冰细胞玻璃化主要危险慢速1.50.3～1＋＋＋冰晶形成溶液效应快速4～8M>2000－－＋毒性渗性休克第43页,共49页，星期六，2024年，5月璃化冷冻的优点省事，省时数分钟：2～3h经济，不用程序冷冻仪，节省液氮高胚胎存活率冷冻卵母细胞和囊胚，脂质丰富的牛猪卵母细胞和胚胎第44页,共49页，星期六，2024年，5月玻璃化冷冻的缺点病毒污染液氮胚胎多费时冷冻环贵技术要求较高第45页,共49页，星期六，2024年，5月3种方法冷冻的结果

（同济医院生殖中心2007，1～10）冷冻方法复苏移植妊娠妊娠率％程序310