《植物组织培养》课件-项目四 无菌操作

植物组织培养项目四无菌操作任务1外植体选择任务2外植体预处理任务3无菌接种技术【知识点】

掌握外植体选择的原则【技能点】

会正确选择外植体素质要求：培养学生无菌意识、创新意识、团队合作意识和生态环保意识；具有任务执行力，规范操作、注意安全；科学严谨、实事求是的工作态度。任务1外植体选择细胞全能型全能性实现的差异：同一植株各个不同部位的组织、器官有差异生殖细胞>体细胞分生组织细胞>分化细胞一、培养材料的选择1、再生能力强的健壮植株2、最佳时期3、优良种质，遗传稳定性好4、适宜部位，容易消毒5、大小适宜1、再生能力强的健壮植株外植体必须有良好的增殖能力，在培养中筛选增殖能力最强的材料。筛选不同基因型植物所需的特殊培养基。通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生能力，容易培养，有较大的再生能力。植物上部器官的生长时间短，但生理年龄较老。而越往基部则生理年龄越小。模块三一般而言，分化程度高的细胞，其脱分化越难。因此，应尽量选择未分化或分化程度较轻的组织作为外植体材料。2、最佳时期三点因素：材料、时间和污染因素。取材料季节和时间，对离体培养至关重要。处于生长季节，较幼嫩的外植体培养容易。2、最佳时期秋冬季取材需要处理。春季取材含菌数少，夏季、雨季、湿热季节取材不容易灭菌成功。3、选择优良的种质优良的种质是成功的第一步。选择具有明确的种性特征，优良单株、优良无性系、新品种、良种材料作为取出植株。并观察其遗传稳定性、花色、果型、长势等性状表现。观察其遗传稳定性、花色、果型、长势等性状表现。观察其遗传稳定性、花色、果型、长势等性状表现。观察其遗传稳定性、花色、果型、长势等性状表现。观察其遗传稳定性、花色、果型、长势等性状表现。观察其遗传稳定性、花色、果型、长势等性状表现。4、适宜部位，容易消毒来源于幼年植物的外植体比源于成年树的外植体容易培养。同株植物中，较低部位外植体要比上不的外植体容易启动，培养成功可能性大。植物体的各个部位，如茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的贮藏薄壁细胞、花瓣根叶子鳞茎、胚珠和花药等。茎尖是较好的部位，生长速度快，遗传性稳定，又能获得无病毒苗的重要途径。叶片能保证多数植物的组织培养不会引起不良变异。对于培养较困难的植物，可以通过子叶或下胚轴来建立起组织培养再生体系。5、大小适宜外植体的表面积、体积、细胞数量会影响培养效果。选择0.5-1cm左右。太大易污染，太小不易启动或启动后仅产生愈伤组织。茎尖、胚、胚乳等培养，按器官或组织单位切离。二、外植体的种类带芽的外植体：顶芽、腋芽、根茎连接处的萌孽等。适合植物的离体快繁。模块三胚：自然状态和试管中雌雄配子结合后形成的各个时期的胚。容易培养。分化的器官组织：嫩茎、嫩叶、形成层、根、花瓣、花萼、珠心、种子等。分化的器官组织可经诱导过渡到脱分化状态。有些器官直接形成不定芽或体细胞胚。花粉及雌配子体中的单倍体细胞：——染色体数目减半，经秋水仙素加倍可产生多倍体。三、减少外植体带菌的措施1、外植体预先培养——用茎尖作外植体时，可先在室内或无菌条件下对枝条进行预先培养。2、外植体取材时间——晴天比阴雨天好。——下午比早晨好。3、取样组织选择——深层（内部的分生组织）比表面和浅层组织好。小结1.外植体选择原则2.外植体种类3.减少外植体带菌的措施【知识点】

掌握外植体处理的一般方法【技能点】

会正确处理外植体素质要求：培养学生无菌意识、创新意识、团队合作意识和生态环保意识；具有任务执行力，规范操作、注意安全；科学严谨、实事求是的工作态度。任务2外植体处理外植体处理分为预处理和表面消毒，它是组培是否成功的第一关键步骤。一、外植体的预处理

外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。1.常用的外植体修整方法茎尖、茎段:剪除枝条上的叶片、叶柄及刺、卷须等附属物，软质枝条用软毛刷蘸肥皂水刷洗，硬质枝条用刀刮除枝条表面的蜡质、油质、茸毛等，枝条剪成带2-3个茎节的茎段。叶片:叶片带油脂、蜡质、茸毛等可用毛笔蘸肥皂水刷洗，较大叶片可剪成若干带叶脉的叶块。果实、种子、胚乳:直接冲洗消毒。对种皮较硬的种子可去除种皮、预先用低浓度的盐酸浸泡或机械磨损。1）对采来的植物材料进行适当的修剪处理。除去不需要的部分，将所需的部分切割至适当大小。2.外植体预处理步骤2）用洗衣粉水（每100ml水1-2角匙洗衣粉）等浸洗植物材料约5min，用毛刷进行刷洗一边材料，再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一步减少污染的处理。3）将清洗好的材料置于自来水下流水冲洗几分钟至几小时，主要以植物材料的清洁程度而定。对于污染严重时特别有效。二、外植体表面消毒1、灭菌原因植物组织大部分取自于田间，材料含微生物，不能直接培养，必须表面灭菌，才能培养。2.外植体特征外植体材料来源于不同环境，带菌程度不同，灭菌难易程度和灭菌效果有明显差别。温室试材较田间的材料容易。新生嫩芽比老枝捎的芽容易。春季抽出的新芽灭菌效果好，污染率低。3.常用消毒剂原理：使用化学药品直接作用于微生物引起蛋白质变性，将其杀死的方法。常用化学灭菌试剂：一定浓度的：84消毒液、双氧水、漂白粉、次氯酸钠、升汞、酒精、来苏水、高锰酸钾、抗生素等。84消毒液（稀释2-10倍）：84消毒液是一种有效地杀菌剂，较常用。漂白粉（1-10%滤液）：漂白粉是一种有效的杀菌剂，但应避光、干燥保存。双氧水（3-10%）：过氧化氢液能分解产生具有杀菌作用的氧气次氯酸钠液（0.5-10%）：次氯酸钠能分解产生具有杀菌作用的氯气升汞（氯化汞，0.1-1%）：有剧毒，效果好，但难除去残留汞，要多次冲洗。注意：灭菌剂对植物组织有损伤，应正确选择灭菌剂的浓度和处理时间。为了使杀菌剂润湿整个组织表面，还需加入润湿剂。常用的润湿剂有Tween-80,或Tween-20，或Triton-X,可加入数滴或用0.1%的浓度，会提高杀菌的效果。4.外植体表面消毒过程准备无菌容器、无菌水、灭菌剂、待用培养基等。材料的表面灭菌，在超净台操作。把材料放到灭菌过的瓶中，在70%酒精中浸30s，无菌水冲洗。将材料转移到一个新无菌瓶中，加入灭菌液。（加表面活性剂吐温-80数滴，轻摇。）定时，灭菌溶液倒出。无菌水冲洗3-10次，冲洗完毕后，接种。5.外植体灭菌方法1）茎尖、茎段及叶片等灭菌先对植物组织进行修剪，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。对表面不光滑或长有绒毛的材料，可用洗涤剂清洗，必要时用毛刷充分刷洗，硬质材料可用刀刮。模块三2）花药灭菌将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2-3次，再在漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗2-3次。3）根及地下部器官的灭菌先用自来水冲洗，软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸5-10min或2%次氯酸钠中浸10-15min，用无菌水冲洗3次。4）果实及种子灭菌先用自来水冲洗10-20min，再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠浸10min，后用无菌水冲洗2-3次。种子则先用10%次氯酸钠浸20-30min，难以灭菌的可用0.1%升汞消毒5-10min。对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡8-10min。外植体采集据树种、季节、部分等采集。刷洗材料用软毛刷、毛笔等在流水下刷洗，可沾少量洗衣粉刷洗。冲洗材料把材料切割到适当大小，用流水冲洗几秒钟或至数小时，细小或易漂浮材料用纱布、塑料纱窗或铜丝网笼扎住。注意冲洗时间越短越好。总结：外植体修整处理外植体表面消毒小结1.外植体选择原则2.

外植体预处理步骤3.外植体表面消毒过程【知识点】

掌握无菌接种技术【技能点】

熟练使用超净工作台与接种器具，会进行初代培养。素质要求：培养学生无菌意识、创新意识、团队合作意识和生态环保意识；具有任务执行力，规范操作、注意安全；科学严谨、实事求是的工作态度。任务3接种技术模块三上海农林职业技术学院ShanghaiVocationalCollegeofAgricultureForestry无菌培养体系的建立61供体植物材料的确定外植体的选择外植体的灭菌外植体的培养外植体的接种一、定义植物材料表面灭菌后，切割或分离出器官、组织、细胞等，并将它们转接到无菌的新培养基上的过程。（1）进入缓冲间更换工作服，带上口罩和帽子，换拖鞋，洗手等。二、接种前准备工作（2）然后进风淋室，对工作人员进行消毒灭菌。（有条件的情况下）进入接种室打开超净工作台、打开超净工作台的紫外灯，检查仪器表是否正常。（3）退出接种室后关门，并打开接种室的紫外灯。（4）脱下工作服、口罩、帽子、拖鞋，退出缓冲间关门并打开缓冲间紫外灯。（5）等待空间消毒灭菌15-20分钟，期间准备好所有外植体消毒的材料、工具和接种工具。（6）待空间消毒灭菌时间满后，检查紫外灯是否关闭。（7）按照步骤（1）、（2）进入接种室。（8）调整座位高度，以达到舒适度为宜。（9）消毒工作台，喷洒酒精于工作台上下左右4面，勿喷出风面。（10）取出酒精棉同一方向擦拭5个面，包括出风口。（11）打开酒精灯调整灯芯长度为1.5cm。（12）将用酒精棉擦拭接种工具，后插入消毒器灭菌（300℃）。（13）其他用具材料带入工作台前先需喷洒酒精消毒，分别放置于工作台面。（14）点燃酒精灯，消毒双手后开始接种操作。三、接种技术超净工作台面灭菌：70%酒精擦洗，并用紫外灯照射20min。接种物品的灭菌：接种服、帽子、口罩要常清洗、并用紫外线灭菌。双手须用肥皂水洗干净，进行操作前再用70%酒精擦洗双手。5）上工作台后，用酒精棉球擦拭双手及台面等，包括指甲缝，最后擦拭工作台。案例分析（1）根据需要取出无菌纸或接种盘1-2个放置灯焰区内，一纸一瓶及时更换。（2）取出培养基打开瓶盖，盖口向下放置台面，瓶身与出风面平行，瓶口不能对着出风口或向上，应平行或微向下。（3）用冷却的接种工具接种材料。材料要均匀分布。（4）接完一瓶用酒精棉擦拭工具插入消毒器灭菌，待消毒时间已满取出冷却，以便循环使用。（一般准备两套接种工具）（5）接种完毕，清理工作台面，关闭工作台。同时做好标识。案例分析注意事项：1）防止交叉污染。左右手不能相互交叉；每切割完1瓶母种材料就更换无菌滤纸；接种工具不能碰到台面；接种工具要全面充分灼烧。2）在酒精灯火焰的有效范围内操作（直径10cm）。3）接种人员注意个人卫生，要经常勤剪指甲，穿工作服、戴口罩与帽子，并严格灭菌。案例分析酒精棉球擦拭接种工具，将镊子和剪子从头至尾过火，尖端烧红。最后用高温消毒器。接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话等。接种完毕，清理工作台。接种注意事项接种用具如刀、剪、镊子每次使用前需灭菌处理，每用