GB/T 42821-2023 贝类包纳米虫病诊断方法（正式版）

ICS65.020.30贝类包纳米虫病诊断方法Diagnosticmethodsforbonamiosisofm国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I Ⅲ 1 1 1 1 1 2 3 3 310组织病理检查 311PCR检测 4 5 6附录A(规范性)组织印片、组织病理检查及DNA提取相关溶液配制 7附录B(资料性)贝类包纳米虫病 ⅢGB/T42821—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。柏建山。1贝类包纳米虫病诊断方法本文件给出了贝类包纳米虫病(bonamiosis)诊断的缩略语、试剂和材料、器材和设备，描述了临床本文件适用于牡蛎包纳米虫(Bonamiaostreae)和杀蛎包纳米虫(Bonamiaexitiosa)引起的贝类包下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义本文件没有需要界定的术语和定义。bp:碱基对(basepair)Ct:扩增循环数(cyclethreshold)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:羧基荧光素(carboxyfluorescein)TE:Tris盐酸和EDTA缓冲溶液(EDTATris·HCl)Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)2GB/T42821—20235.1水：符合GB/T6682中规定的一级水。5.5生理盐水(0.9%):常温保存。5.610×PCR缓冲液(无Mg²+):—20℃保存。5.7MgCl₂溶液(25mmol/L):-20℃保存。5.9TaqDNA聚合酶(5U/μL):-20℃保存。5.10姬姆萨染液、戴维森氏固5.11蛋白酶K(20mg/mL):按A.3配制。5.1210%SDS:按A.4配制。5.13乙酸铵(10mol/L):按A.5配制。5.14酚/三氯甲烷/异戊醇混合液：配制比例25:24:1。5.15乙醇溶液(75%):按A.6配制。5.171×电泳缓冲液：按A.9配制。5.21引物BonF:5'-CATTTAATTGGTCGGGCCGC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.22引物BonR:5'-CTGATCGTCTTCGATCCCCC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.23引物BonqF:5'-GAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAAC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.24引物BonqR:5'-CATAAGTTAGTCTCACCGGAATTAAAG-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.25探针BonqP:5'-FAM-TCTGGCCCGGCGATACTAGCACCC-Eclipse-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.27核酸染料：4℃保存。5.286×上样缓冲液：—20℃保存。5.29DNA分子质量标准溶液：-20℃保存。5.31载玻片。6器材和设备6.1组织切片机。6.2显微镜。6.34℃冰箱。6.4—20℃冰箱。6.5—80℃冰箱。6.6匀浆研磨器。6.7冷冻高速离心机。6.8二级生物安全柜。3GB/T42821—20236.9普通PCR仪。6.10荧光PCR仪。6.11水平电泳仪。6.12凝胶成像仪。6.13水浴锅。6.14微量移液器。6.15电子天平。8采样优先采集2龄及以上濒死的贝类。临床无症状贝类样品每个批次采集150个以上，临床有症状贝类样品每个批次采集30个以上。进口贝类样品的采样数量应符合GB/T18088的规定。24h内冷链送达实验室，立即检测或保存于一80℃冰箱待检。9组织印片检查后置于400倍～1000倍显微镜下观察。用戴维森氏固定液固定样品，固定液与组织块的体积比为(15:1)～(20:1),固定24h～48h。4GB/T42821—2023按A.13的要求采用组织切片机制备石蜡切片，封片后置于400倍～1000倍显微镜下观察。切片组织中发现虫体即判为阳性。检测实验室的分区要求、质量控制和质量保证应符合GB/T19495.2的规定。11.2操作步骤11.2.1DNA提取11.2.1.1利用电子天平称取30mg～50mg组织样品，置于0℃~4℃的生理盐水(4℃冰箱预冷)中反复冲洗，滤纸吸干表面水分后置于匀浆研磨器中并加入0℃~4℃(4℃冰箱预冷)的生理盐水，充分11.2.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K至终浓度100μg/mL,再至终浓度为1%(质量分数),上下颠倒混匀后置于50℃水浴锅中水浴3h,不时旋动。向匀浆液中按1:1体积比加入酚/三氯甲烷/异戊醇混合液(25:24:1),轻轻震荡混匀加入两倍体积预冷无水乙醇(—20℃冰箱预冷)混匀，置于一20℃冰箱放置2h。11.2.1.6采用冷冻高速离心机12000r/min离心10min,沉淀DNA,倾去上清液。11.2.1.7向沉淀中加入75%乙醇溶液500μL,轻轻混匀后采用冷冻高速离心机12000r/min离心11.2.1.9可采用同等抽提效果的其他方法或商品化DNA提取试剂盒。在二级生物安全柜中用微量移液器向PCR管内加入10×PCR缓冲液(无Mg²+)2.5μL、MgCl₂溶1.0μL、dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μL,加入模板DNA2.0μL,补充双蒸水至25.0pL。利用普通PCR仪进行PCR扩增，设置扩增程序如下：94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退5GB/T42821—2023配制1%～2%的琼脂糖凝胶并加入核酸染料，待胶凝固后置于含有1×电泳缓冲液的水平电泳仪阳性对照在300bp处有扩增条带，阴性对照300bp处无扩增条带，空白对照无任何条带，检测有效。若待检样品在300bp处无条带，则判为PCR检测核酸阴性。对PCR检测为核酸阳性的样品PCR产物进行测序，测序结果同参考序列比对分析(见附录C中C.1、C.2),若序列中同时存在HaeⅡ和BglI两个酶切位点(见C.1),可判定样品为Bonamiaostreae核酸阳性。若序列中只存在HaeⅡ酶切位点(见C.2),则判定样品为Bonamiaexitiosa核酸阳性。12荧光PCR检测12.1实验室技术要求检测实验室的分区要求、质量控制和质量保证应符合GB/T19495.2的规定。12.2.1DNA提取按11.2.1规定执行。在二级生物安全柜中用微量移液器向PCR管内加入10×PCR缓冲液(无Mg²+)2.5μL、MgCl₂溶利用荧光PCR仪进行荧光PCR扩增反应，设置扩增程序如下：95℃预变性4min;95℃变性阳性对照Ct值≤35,且出现特异性扩增曲线；阴性对照无Ct值或者Ct值>40且无特异性扩增曲6GB/T42821—202312.3.2荧光PCR检测结果判定若样品Ct值≤35,则判定荧光PCR检测核酸阳性。若样品无扩增曲线或者Ct值>40,则判定荧光PCR检测核酸阴性。若35<Ct≤40,判定为疑似，此时可调整模板浓度后对样品重新进行荧光PCR检测，如果样品重复检测时的Ct值≤40,则判定荧光PCR检测核酸阳性；如果样品重复检测时无扩增曲线或者Ct值>40,则判为荧光PCR检测核酸阴性(荧光PCR扩增序列及引物、探针的位置见C.3)。13.2确诊判定组织印片检查和组织病理检查一种或两种方法检测为阳性，且PCR检测或者荧光PCR检测为阳组织印片检查和组织病理检查一种或两种方法检测为阳性，且PCR检测或者荧光PCR检测为阳7GB/T42821—2023(规范性)A.1姬姆萨染液A.1.2工作液：取贮存液采用蒸馏水10倍稀释即可，临用时配制。A.2戴维森氏固定液海水335mL95%乙醇330mL37%甲醛220mL冰乙酸115mLA.320mg/mL蛋白酶K蛋白酶K20mg溶解后分装于1.5mL离心管中(0.25mL/管),—20℃下保存。加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2,加水定容至100mL。SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和电子天平上乙酸铵77g无水乙醇8GB/T42821—20230.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至高压蒸汽灭菌，4℃贮存。A.850×电泳缓冲液Tris冰乙酸0.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至室温贮存。A.91×电泳缓冲液50×电泳缓冲液加水定容至室温贮存。2mL242g57.1mL20mLA.10苏木精染液的配制方法苏木精无水乙醇硫酸铝钾蒸馏水氧化汞冰乙酸200mL分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。A.11伊红染液的配制选用水溶性伊红。配方为：伊红1g、70%～75%酒精100mL、伊红用少许蒸馏水调成耀糊状，再加入酒精，边加边搅拌，直至彻底溶解，此时试剂有些浑浊，取0.1mL冰乙酸，加入试剂中，试剂逐渐转变为清亮，呈鲜红色。A.12返蓝液的配制取5mL氢氧化氨，加入1000mL蒸馏水中即可。A.13石蜡切片制备取材固定24h,修整组织块，换固定液重新固定12h,自来水冲洗24h、70%乙醇1h、85%乙醇1h、95%乙醇45min2次，无水乙醇30min3次，二甲苯30min,二甲苯5min～20min2次，放入石蜡二甲苯10min2次，然后依次通过无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2min,再93min后，返蓝液2min～5min,自来水5min,蒸馏水5min,然后依次通过50%乙醇、70%乙醇、80%GB/T42821—2023(资料性)B.1疾病描述包纳米虫病是由牡蛎包纳米虫(Bonamiaostreae)、杀蛎B.2病原现发现的包纳米虫包括5个种，除主要寄生在欧洲平牡蛎(Ostreaedulis)体内的牡蛎包纳米虫(Bonamiaostreae)外，还有寄生在悉尼岩牡蛎(Saccostreaglomerata)体内的鲁夫来包纳米虫其在寄主细胞内定位接触30min即可感染牡蛎，其中以颗粒血细胞中的病原感染力最强。造成广泛危害的主要为牡蛎包纳米虫和杀蛎包纳米虫。B.3易感宿主B.4临床症状B.5地理分布我国目前尚未有水生动物包纳米虫病发生的报道。B.6组织印片检查包纳米虫见图B.1中箭头所指位置。GB/T42821—2023图B.1组织细胞内的包纳米虫B.7血淋巴印片检查在显微镜下可观察到虫体寄生于血淋巴细胞内，呈球形或卵圆形，大小为2μm～5μm,姬姆萨染图B.2牡蛎血液中的包纳米虫B.8组织病理学检查包纳米虫呈球形或卵圆形，虫体大小为2μm～5μm,细胞核红染，细胞质蓝染。包纳米虫见图B.3中箭头所指的位置。GB/T42821—2023图B.3牡蛎石蜡切片中包纳米虫的观察GB/T42821—2023目标扩增序列及引物、探针的位置C.1Bonamiaostreae的PCR目标扩增序列及引物位置(300bp)CATTTAATTGGTCGccCTGGTCCTGATCCTTTACTTTGAGAAAATTAAAGTGCTCAAAGCAGGCTCGCGCCTGAATGCATTAGCATGG'AATAATAAGACACGACTTCGGCGC|CGCCT|CGGCGGTTGTTTTGTTGGTTTTGAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTGGGGGTGCTAGTATCGCCGGGCCAGAGGTAAAATTCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATGCGAAAGCATTCACCAAGCGTGTTTTCTTTAATCAAGAACTAAAGTTGGGGGATCGAAGACGATCAG点的酶切位置