西南大学-生科院生物化学教学大纲

诿南去孝

生物科学专业本科理论

课程

教案

生命科学学院微生物与生物化学教研室

《生物化学》教案

一、课程基本信息

课程代码课程类别专业必修

中文名称《生物化学》英文名称Biochemistry

适用专业生物科学、生物工程开课单位生命科学学院

总学时81学分4.5

先修课程无机化学、有机化学后续课程分子生物学、免疫学等

二、课程教材：生物化学;出版社;高等教育出版社;第三版;2002;

三、教学对象：

生物科学、生物技术、生物工程专业及其他生命科学专业和医学专业

四、主要参考资料：

1、郑集等编著，《普通生物化学》，北京，高等教育出版社，2002；

2、TrudyMcke（影印版）,«Biochemistry:Anintroduction》（SecondEdition）,北京,科学出版社,2000；

3、盛等编著，《生物化学简明教程》（第二版），北京，高等教育出版社，1999.

4、郭蔼光.基础生物化学（面向21世纪课程教材）.北京：高等教育出版社，2001

5、王希成，生物化学，北京：清华大学出版社，2000

6、Lubertstryer.Biochemistry.4thEdition.NewYork;W.HFreemanandCompany,Fifthprinting1998.

7^DLNelson.PrinciplesofBiochemistry.3rded.NewYork;Worthpublisher,2000

五、课程考核方式及成绩评定

考试形式：闭卷。考试题型：名词解释、选择题、判断题、填空题、问答题。成绩评定方法：平时成绩

10%、课程论文20%,期末考试占70%。

六、教案（见后）

绪论

一、教学目的

了解生物化学的发展史，明确生物化学的概念、任务；

了解生物化学与各学科之间的联系及研究生物化学现实意义；

了解生物化学的进展和学习方法。

二、教学重点

一、生物化学的涵义

二、生物化学与其它学科的关系

三、生物化学的发展及突出成就

四、我国生物化学的发展过程

三、教学时数

2学时

四、教学方法

利用多媒体与传统方法的相结合；只讲重点和难点和前沿性的热点，一般性知识看书。

五、教学内容

绪论

一、生物化学的涵义

生物化学是介于生物和化学之间的一门边缘科学，它是用化学的理论和方法作为主要手段来研究生命

现象，从而揭示生命的奥秘。它是从分子水平来研究生物体（包括人类、动物、植物和微生物）内基本物

质的化学组成和生命活动所进行的化学变化（即代谢反应）的规律及其与生理机能的关系的门科学。

生物化学的任务就是研究组成生物体基本物质的性质，结构与功能，以及这些物质在生命活动过程中

所进行的化学变化的规律及其与生理机能的关系，从而阐明生命现象的本质，并把这些知识应用到社会实

践和生产实践中去，以达到征服自然和改造自然的目的。

二、生物化学与其它学科的关系

19世纪以前人们主要是通过生物体内的化学变化来认识生物体的生理机能，直到二十世纪初才发展

成为•门独立的新型学科。它是介于生物和化学之间的•门学科，它和有机化学、生理学、生物物理学和

分子生物学等与生物化学的关系极为密切。

随着对蛋白质、酶、核酸、糖类和脂类等生物大分子结构、性质、功能和代谢的不断阐释，越来越

多的科学工作者被吸引着，越来越多的学科向其不断常拢，使生物化学迅速地跨入突飞猛进的时代。生物

化学的日新月异也促进了其它学科的发展，与许多学科相互联系、相互发展。

如欲深入了解各种生物的生长、生殖、生理、遗传、衰老、疾病、生命起源和演化等理解，都需要用

生物化学的原理和方法进行探讨。因此，生物化学是各门生物科学的基础，特别是生理学、微生物学、遗

传学、细胞学等各科的基础，在分子生物学中占有特别重要的位置。

三、生物化学的发展及突出成就

（一）、生物化学的发展阶段

第一阶段从19世纪末到20世纪30年代，主要是静态的描述性阶段,对生物体各种组成成分进行分离、

纯化、结构测定、合成及理化性质的研究。其中菲舍尔测定了很多糖和氨基酸的结构，确定了糖的构型，

并指出蛋白质是以肽键连接的。1926年萨姆纳制得了胭酶结晶，并证明它是蛋白质。

第二阶段约在20世纪30〜50年代，主要特点是研究生物体内物质的变化，即代谢途径，所以称动态生

化阶段。其间突出成就是确定了糖酵解、三殷酸循环以及脂肪分解等重要的分解代谢途径。对呼吸、光合

作用以及腺背三磷酸（ATF）在能量转换中的关键位置有了较深入的认识。

第三阶段是从20世纪50年代开始，主要特点是研究生物大分子的结构与功能。生物化学在这

•阶段的发展，以及物理学、技术科学、微生物学、遗传学、细胞学等其他学科的渗透，产生了分子

生物学，并成为生物化学的主体。

（二）、二十世纪生物化学的突出成就

在20世纪前30年代中，生物化学的研究仍继续侧重在酶、激素、维生素的分离和功能以及人体氨基

酸需要等几个方面。在20世纪中最突出的生化成就有：酶的结果、中间代谢途径的阐明、生物能量学的

发展、生物大分子结构和功能以及分子生物学的兴起几个方面：

1）酶的结晶20世纪30年代中，最突出的生化成果之就是胭酶（urease）的第一次结晶成功。

1926年JamesB.Sumner（l877-1855）发表了他第一次成功地制成了晶体服酶,随后是JohnH.Northrup

（1891-1987）制得了晶体胃蛋白酶和胰蛋白酶。这两项研究成果是当今酶学的重大突破。因为有了晶体纯

酷，就为体外研究个别酶的生物功能铺平了道路，从而开辟了醐学研究的新领域。

2）代谢途径的阐明HansA.Krebs提出的三竣酸循环对糖的分解代谢及尿素循环对氮的代谢都

取得巨大进展。脂肪、蛋白质、氨基酸及其他生物物质的分解途径也得到阐明。由于物质分解途径的阐明

及同位素在代谢研究上的应用，大大促进了20世纪晚期的合成代谢研究。

3）生物能研究的发现生物能的研究使生物化学更能深入地认识代谢在生命过程中的功用，自

20世纪50年代以来，许多生化研究人员，包括OttoMeyerhof（】884-1951）、OttoWarburg（1883-1970）等在

代谢能的产生和利用上作了基本阐述。指出了ATP是代谢能的产生作用的关键化合物，提出了呼吸链及氧

化磷酸化的理论，从而建立了生物能量学（Bioenergetics）。

4）生物大分子的结构和功能的研究及分子生物学的兴起从20世纪50年代起，生物化学的另

一重要研究成果就是蛋白质及核酸的结构和功能。首先是Pauling与RoberCorey利用X射线衍射技术研

究蛋白质的二级结构，提出了著名的蛋白质的a-螺旋结构（a-helix）、其次是FrederichSanger在1953年发

表了他对胰岛素分子中51个氨基酸序列的研究。

在Pauling的蛋白质的a-螺旋结构的启示HJamesD.Waston与FrancisH.C.Crick制成了DNA双螺旋

结构模型，这•成就导致人们从DNA分子的三维结构去理解与DNA有关的生命现象，被认为是分子生物

学的开始。

四、我国生物化学的发展过程

我国是世界文明发达最早的国家之一，中华民族是一个具仃悠久历史和优秀文化的民族。我国劳动人

民，远在古代即因生活需要，在生产、医疗和营养等方面的实践中积累了许多有关生物化学的丰富经验，

并有许多发明创造，对生物化学的发展做出了许多贡献。比如，在四千多年前（夏禹时代）就已发明用粮

食服酒，酿酒用的酒母称为曲或媒（即现代的酶）。在商周时期（公元前12世纪）已知制造酱、醋和饴糖

的技术。泗、酱、醋和饴都是属于发酵酿造业，是利用生物体内的酶所催化的化学产物。

在医药方面，春秋战国时期（公元前6世纪）已知用曲治疗消化道疾病，至今仍沿用，如“神曲”等。在

晋朝（公元4世纪）时，已知用海藻（含碘）治疗麴病（甲状腺肿）。而在欧洲直到公元1170年始用海藻

治疗甲状腺肿。唐朝初年（公元7世纪）孙思邈已知脚气病为食米区一种流行病，并用含维生素B1丰富的

国草药如车前、防风、大豆、米皮等进行治疗。他首先用含维生素A丰富的猪肝治疗雀目（夜盲症）。公

元10世纪起，我国就用动物各种脏器治疗疾病，尤其是明朝我国伟大科学家李时珍（公元16世纪）编著

《本草纲目》15,共载•千八百余种，其中有关动物药（包括代谢产物和分泌物）的记载就有四百多种。

可见，我国古代人民对生物化学已有很大贡献。只是由于长期的封建统治和保守落后思想束缚了我国

生产力和科学技术的发展，生物化学也不例外。

中国生物化学的发展是20世纪20年代开始的。从1917年起，中国才有生物化学这门

学科。在中国，现代生物化学起源于西方，尤其是美国、英国和德国。所有中国生物化学的开拓者，都是

从美国及欧洲留学回来的。最早的是前齐鲁大学医学院的江清（1886-1939）、燕京大学的窦维廉（William

H.Adolph）（1890-1952）和协和医学院的吴宪（1893-1959）等，对中国早期生物化学的发展都是有功劳的，特

别是吴宪法对中国生化的发展影响最大。

第一章蛋白质化学

一、教学目的

1.掌握蛋白质的概念和化学组成；蛋白质的基本结构单位——氨基酸的分类及结构；蛋白质各级分子结构

的内容和特点。

2.熟悉氨基酸、蛋白质的理化性质及分离鉴定方法。

3.了解蛋白质的分子结构与功能的关系及蛋白质级结构的测定。

二、教学重点和难点：

掌握蛋白质的分子结构、重要性质及结构与功能的关系。

建议：在学习氨基酸的结构时联系有机化学的竣酸结构：在学习氨基酸的化学性质时联系氨基酸的结构，

再将氨基酸的结构和特性与蛋白质的结构和特性联系起来。同时注意氨基酸的某些特殊反应在蛋白质的合

成工作中的实际意义，认识蛋白质的重要生物学意义和生产实践意义。

三、教学时数

18学时

四、教学方法

利用多媒体与传统方法的相结合

五、教学内容

第一节蛋白质概论

蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子，几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的

结果，因此，蛋白质是现代生物技术，尤其是基因工程，蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。

一、蛋白质的化学组成与分类

1、元素组成

碳50%氢7%氧23%氮16%硫03%

微量的磷、铁、铜、碘、锌、铜

凯氏定氮：平均含氮16%,粗蛋白质含量=蛋白氮X6.25

2、氨基酸组成

从化学结构上看，蛋白质是由20种L型a氨基酸组成的长链分子。

二、蛋白质分子大小与分子量

蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物，aa数目由儿个到成百上千个，分子量从儿干到儿千万。一

般情况下，少于50个aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。多于50个

aa的称为蛋白质。但有时也把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时，多肽一词着重于结构意

义，而蛋白质原则强调了其功能意义。

对于任一给定的蛋白质，它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的，

均一性。

三、蛋白质分子的构象与结构层次

蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空

间结构称为蛋白质的（天然）构象。

四、蛋白质功能的多样性

细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子。

1.酶

2.结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）

3.贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）

4.物质运输（血红蛋白、Na+K+ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）

5.细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）

6.激素功能（胰岛素）

7.防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）

8.接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）

9.调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白

第二节蛋白质的基本结构单位一氨基酸

蛋白质的水解

蛋白质可以受酸、碱或酶的作用而水解成氨基酸。

1.酸水解用6MHe1或4MH2s04，105。回流20小时即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的消旋，但色氨

酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。如样品含有杂质，在酸

水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。用3moi/L对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较多，可像丝氨酸

和苏氨酸一样用外推法求其含量。

2.碱水解用5MNaOH,水解10—20小时可水解完全。碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，但色氨

酸不被破坏。常用于测定色氨酸含量。可加入淀粉以防止氧化。

3.酶水解酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应不完全。•般用于部分水解，若

要完全水解，需要用多种酶协同作用。

一、氨基酸的构造、构型、分类和命名

（一）氨基酸的构造和构型

通式：

+（poo-fOOH

H,N—C—H或H,N—C—H

3I

RR

作为生物体内合成蛋白质的原料的氨基酸的特点：

♦均为a-氨基酸

♦天然氨基酸大多属于L型

（二）氨基酸的分类

酸性氨基酸（COOH数目〉NHz数目）

氨基酸（碱性氨基酸（N”数目）COOH数目）

中性氨基酸（N%数目=COOH数目）

赖氨酸H?NCH2cH2cH2cH之CH(NH2)C00H

(Asp,D)

pl=9.74

组氨酸।

碱性氨基酸~i|—CH,CH(NH2)C00H

(His,H)LNH

Npl=7.59

精氨酸F

(Arg,R)H2NCNHCH2CH2CH(NH2)COOH

pl=10.76

中性氨基酸（侧链非极性）

甘氨酸HCH(NH)COOH脯氨酸H

21>

(G&£)

pl=5.97SOH

(Pro,P)

丙氨酸CH，CH(NH,)COOHpI=6.30

本内氨酸\

(A]a,A)

pI=6.02〈2-CH,CH（NH2）COOH

(Phe.F)5~pl=5.48

撷氨酸(CH)CHCH(NH)COOH

322色氨酸Cnr

-CH2CH(NH2)COOH

（AalV）pl=5.96

(pl=5.65H

亮氨酸*(CH5)2CHCH2CH(NH2)COOHpl=5.89

(Leu,L)

pl=5.98*

蛋氨&V

HASCH2CH2CH(NH2)COOH

异亮氨酸C,HQIJCHCH(NH2)COOH(Met,M)

pl=5.74

(ne,0pl=6.()2

必需氨基酸：嫡*号的8种氨基酸是人体内不能合成而又是营养所必不可少的，必需依靠食物供应,

称为必需氨基酸。

*其它氨基酸：蛋白质合成后，分子中某些氨基酸的侧链可发生变化，而形成另一些氨基酸。

胱氨酸：

I-氧化L2H）_%CH,

2HS-CH-C-C00H-|~I~

-%还原（+

2H）CHNH2CHNH,

COOHCOOH

半胱氨酸胱氨酸

（三）氨基酸的命名

系统命名和俗名

二、氨基酸的性质

氨基酸的化学性质取决于其分子中的粉基、氨基、侧链基团以及这些基团的相互影响。

氨基酸的性质

♦两性电离

♦成肽

♦脱陵

♦与亚硝酸的放氮反应

♦与苗三酮的显色反应

♦与2,4-二硝基氟苯的反应

♦与金属离子的螯合作用

（-）两性电离及等电点

1.两性电离Neutral,dipolarzwitterions

R—CH-COOHR—CH-COO

NH2+NH3

内盐（两性离子、偶极离子）

2.等电点(Isoelectricpoint)

R-CH-COOH+H,0R-CH-COO+H,OR-CH-COO-

HO+|J'—Ir"-I.

+NH,-H,0+NH?-H2ONH,

偶极离子

阴离子

ffl离子（氨基酸的主要存在形式）

（pH<1时的主要存在形式）（pH>l2时的主要存在形式）

等电点：加入酸或碱调节某种氨基酸水溶液的pH值，使这种氨基酸的酸式电离与碱式电离的趋向恰

好相等。此时溶液的pH值就叫做这种氨基酸的等电点，以pl表示。

各类氨基酸的pl值范围：

♦中性氨基酸的等电点一般在5.0~6.5之间，

♦酸性氨基酸为2.7~3.2,

碱性氨基酸为9.5~10.7。

［思考题I为什么中性氨基酸的等电点不等于7?

中性氨基酸的胶基的酸式电离略大于其氨基的碱式电离，因而溶液的pH值必须达到偏酸时，才能使

其两种电离趋向恰好相等。

氨基酸溶液处于等电点时：

♦［阴离子］=［阳离子］

♦［偶极离子］>99.9%

♦氨基酸的溶解度最小，最易从溶液中析出

*溶液pH与溶液离子的关系：（见幻灯）

（二）脱水生成肽

SC

H-N-CH-C-OH+--M

HR<i>Hd

R,

N肽

CF二

N—IIIOH

HRH

肽键

两个氨基酸之间所产生的酰胺键又称为肽键（peptidebond）。.肽分子的一端有氨基，另一端有竣基，

因此还可继续与氨基酸缩合成为三肽、四肽以至多肽。

当两种不同的氨基酸A与B互相结合时，可按不同的排列方式结合，形成两种结构不同而性质相似

的二肽A-B与B-Ao例如甘氨酸和丙氨酸可形成如下两种二肽：

H,N—CH7C—N—CH—COOHH,N—CH—£一厂CH/OOH

&HCH,CH”H

甘氨酰丙氨酸丙氨酰甘氨酸

三肽有6（3!）种可能的异构体，其排列顺序为ABC,ACB,BAC,BCA,CAB.CBA。n肽有n!种异构

体。

（三）脱竣反应

脱竣反应是人体内氨基酸代谢的形式之一。例如在肠道细菌作用下，组氨酸脱竣变成组胺：

N一（j^CH-CH^COO|H-N-^-CH2NH2

HCCHNH,HCCH

\N/■、N/

HH

（四）与亚硝酸的放氮反应

凡是具有氨基的化合物都能与亚硝酸作用产生氮气（脯氨酸及羟脯氨酸除外）

R—CH—COOH+HNO,R—CH—COOH+N2T+H20

OH

NH2

利用此反应，可由氨的体积计算混合氨基酸的总含量或蛋白质分子中氨基的含量。

（五）与苗三明的显色反应

蓝色化合物

反应后蓝紫色的深度或二氧化碳的体积可作为a-氨基酸定量分析的依据。肽类和蛋白质也有此反应。

由于反应非常灵敏，是鉴定氨基酸、肽类和蛋白质最迅速而乂简便的方法，广泛用于a-氨基酸、肽类和蛋

白质的比色测定或纸层析与薄层层析的显色。

（六）与2,4-二硝基氟苯（DNFB）（桑各试剂）的反应

,NO?

—NH-CH~~COOH+HF

F+H2NCH-COOH»

R

DNFB氨基酸DNP-氨基酸

（桑各试剂）（黄）

用于测定蛋白质或多肽N-端氨基酸的方法，称为二硝基苯法，简称为DNP法。利用此法不断降解蛋

白质或多肽，反复用DNFB标记其氨基末端，就可确定蛋白质或多肽链中氨基酸的排列顺序。

（七）与金属离子的螯合作用

O=।c—X0、H,LN—CH,

x

H2C—NH2o—C=O

兰色

利用这类反应可作为氨基酸或蛋自质的定性试验或定量分析的依据。

第三节肽

一、肽的和命名

由氨基酸缩合而成的化合物称为肽。

分类,般十肽以下的叫寡肽或低聚肽(oligopeptide),+■肽以上称为多肽(polypeptide)。

多肽分子中的氨基酸单位称为氨基酸残基(aminoacidresidue).

蛋白质是由多肽组成的，除此之外，在人体内还发现了许多肽类，其中有些是具有重要生理活性的激

素。

环状肽链没有首尾之分。开链肽为链状，故乂称多肽链。它们有两端，端具有游离的氨基，称为氨

基末端(或称N-端)；另一端则具有游离的竣基，称为叛基末端(或称C-端)。

在写多肽的构造式或简化式时，习惯上将N-端写在左边，C-端写在右边。

多肽的命名是以含有C-端(竣基)的氨基酸为母体，而将其余的氨基酸残基作为酰基，依次排列在母体

名称之前。例如，谷胱甘肽(glutathione)可命名为Y-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。

二、肽的结构和功能

肽链中氨基酸残基之间的结合键主要是肽键。肽键是共价键，结合力很强，又较稳定，除在酸、碱或

酶的作用下水解外，•般不易被破坏。

肽链中的半胱氨酸残基侧链上含有筑基-SH,容易发生氧化还原反应。例如，谷胱廿肽含有-SH,乂称

还原型谷胱甘肽，可用GSH表示。在氧化反应中，筑基被氧化成二硫键，肽变成了氧化型谷胱甘肽，可用

GS-SG表示。其氧化型也可被还原。

2GSH—“3叼

+2[H]

谷胱甘肽的还原型及氧化型的转变是可逆的，它在生物氧化过程中起着氢的传递作用，能促进不饱和

脂肪酸的氧化。体内还有许多含航基的酶在生物氧化过程中起着传递质子的作用。

肽链内部的两个筑基也可以互相结合成二硫键，使肽链成部分环状.如催产素和抗利尿素：

第四节蛋白质的分子结构

一、蛋白质的分子结构按层次可分为四级：

(-)一级结构蛋白质分子中氨基酸的排列次序

蛋白质分子的基本结构是多肽链。有些蛋白质就是•条多肽链，有些是由两条或儿条多肽链构成。呈

肽链中氨基酸排列的次序称为蛋白质的「级结构。

我国科学家首先合成了具有生理活性的结晶牛胰岛素(图12-2),它就是由A,B两条多肽链通过二硫键

连结而成的蛋白质。在A链的第6与第11的两个半胱氨酸残基之间还有一个二硫键相连。

(-)二级结构

用x射线衍射的方法研究蛋白质的结构，证明了在蛋白质分子的肽键(一£一7一)

0H

中C-N键的键长为0.132nm,介于C-N键长(0.147nm)和C=N键长(0.127nm)之间。这显示了肽键中的C-N

键具有一定程度的双键性质，不能自由旋转，从而使肽键-C0NH-上所连接的各原子位于同一平面匕其中

0与H呈反式关系。这种平面结构称为“肽键平面”或“酰胺平面”。肽键平面两侧的Ca-N和C-Ca键则

是。键，可以自由旋转，即能引起肽键平面间的相互旋转，使主链出现各种构象。这种主链原子的局部空

间排列，称为蛋白质的二级结构（图12-3）o

1952年鲍林（Pauling）等人根据X射线衍射法对纤维状蛋白质的研究，在肽键平面结构及平面间相对旋

转的基础上，提出了蛋白质肽链构象的两种模型。

I.a一螺旋结构模型：肽链以螺旋方式伸展，平均每3.6个氨基酸残基构成一个螺旋圈，递升0.54nm。每

隔18个残基即5个螺旋圈（距长2.7nm）又出现大的重复。每个氨基酸残基上的氨基氢与其相隔的第五个氨

基酸残基中酰基氧形成氢键；肽链上所有的上环CO与卜.环NH都有相应的氢键对。这样，要使一段螺旋

中的肽链发生旋转，至少需要打开三个相邻的氢键才有可能。这就使a-螺旋的构象较为稳定（图12-4）,

a-螺旋的直径为1.0〜l.lnm,由于此空间太小以致溶剂分子进不去。在20种氨基酸中，只有脯氨酸在肽

链上时，因其N1二无氢，不能形成氢键，a-螺旋在此不能连续，并使后面的肽链发生弯曲。因此脯氨酸的

出现与多肽的立体构型有关。

2.6-片层结构模型:片层结构中肽链是折叠排列（与a-螺旋不同），每两个氨基酸残基的距离约0.35nm

（在a-螺旋结构中为0.15nm）,连接各残基的肽键所构成的平面有规则地折叠成折扇状（图12-5）,肽链

中CO与NH间的氢键是在两条平行的或反平行的肽链间形成，每个氨基酸的侧链基团分别交替地位于折

叠面的上下。

由于空间障碍，就不能盘曲成螺旋，也不能折叠成片层，而呈无确定规律的线状卷曲。这部分肽链构象称

为无规卷曲,此外在蛋白质分子的肽链上还经常因脯氨酸的存在而出现180°的回折，这种肽链的回折角

称为6-转角，我/'杷主肽链上的a-螺旋、片层、8-转角和无规卷曲四种构象单元统称为蛋白质的二级

结构。

（=）三级结构

上述蛋白质的a-螺旋、B-折叠、转角和无规卷曲等二级结构，往往由于侧链及各主链构象单元的

相互作用，而按一定方式进一步卷曲，折叠成更复杂的三度空间结构，这就是蛋白质的三级结构,三级结

构是由盐键、氢键、二硫键及疏水键等来维系的。它反映了蛋白质分子（或亚基）内所有原子的空间排布。

大多数蛋白质都有纤维状或球状的三级结构。

蛋白质的变性可解释为其二级及三级结构被破坏的结果。

（四）四级结构蛋白质的缔合

复杂的蛋白质分子是由两条或两条以上具有三级结构的肽链所组成。这时每条肽链称为•个亚基.JL

个亚基通过氢键、疏水键或静电引力缔合而成个蛋白质分子,这就是蛋白质的四级结构。例如，血红蛋

白（HbA）是一个含有四条多肽链（二条a链和二条B链，图12-7）组成的蛋白质，每条肽链各自用副键维

系，折叠盘曲成呈四面体形式的三级结构。具有三级结构的四条多肽链各自结合•个作为辅基的亚铁血红

素。四条多肽链间通过八个盐键互相结合，构成血红蛋白A的四级结构（图12-7、12-8）。

二、蛋白质一级结构测定

推断预测

氨基酸序列（一级结构〉一空间结构（高级结构）~功能

（-）蛋白质测序的一般步骤

测定蛋白质分子中多肽链的数目。

（1）拆分蛋白质分子中的多肽链。

（2）测定多肽链的氨基酸组成。

（3）断裂链内二硫键。

（4）分析多肽链的N末端和C末端。

（5）多肽链部分裂解成肽段。

（6）测定各个肽段的氨基酸顺序

（7）确定肽段在多肽链中的顺序。

（8）确定多肽链中二硫键的位置。

（二）蛋白质测序的基本策略

对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。

直接法（测蛋白质的序列）

两种以上特异性裂解法

NC

A法裂解AlA2A3A4

B法裂解_B[B2B3B4

用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序

列，拼接成一条完整的肽链。

间接法（测核酸序列推断第基酸序列）

核酸测序，一次可测600-800bp

（=）测序前的准备工作

蛋白质的纯度鉴定

纯度要求，97%以上，且均纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）

⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）要求一条带

（2）DNS—cl（:甲氨基蔡磺酰氯）法测N端氨基酸

测定分子量

用于估算氨基酸残基n=mw

110

方法：凝胶过滤法、沉降系数法

1、确定亚基种类及数目

多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：

⑴非共价键结合

8mol/L尿素，SDSSDS测分子量

⑵二硫键结合

过甲酸氧化：

—S—S—+HCOOOH-SO3H

8疏基乙醇还原：

2、测定氨基酸组成

主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。

确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。

①Trp测定

对二甲基氨基苯甲醛590nm.

②Cys测定

端基分析

①N端分析

DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。

DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离,

纸层析、薄层层析、液相等

PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。

②C端分析

A.啡解法

HjN-A-B-C-D-COOH无水肌NH2NH2100℃5-10ho

A-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH

氨基酸的酰肿，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gin,Asn、Cys、Arg不能用此法。

B.狡肽酶法（Pro不能测）

浚肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a

竣肽酶B：只水解Arg、Lys

NH,NVai—Ser—GlyC

图Pl18竣肽酶法测C末端

（二）肽链的部分裂解和肽段的分离纯化

1、化学裂解法

①澳化鼠—Met—X—产率85%

②亚碘酰基苯甲酸一Trp—X—产率70-100%

③NTCB（2-硝基-5-硫鼠茶甲雀）一X—Cys—

④羟胺NH20H—Asn—Gly—

约150个氨基酸出现一次

2、酶法裂解

①胰蛋白酶Lys—

(XWPro)

ArgX

②胰凝乳蛋白酶lyiX

（X#Pro）

Trp——X

Phe——X

胃蛋白醐

PheQrp、Try、Leu)Phe(Trp>Try^Leu)

③Glu蛋白酶GluX

（Vg蛋白酶）

④Arg蛋白酶ArgX

⑤Ly$蛋白酶X——Lys

⑥Pro蛋白酶Pro——X

3、肽段的分离纯化

①电泳法SDS-PAGE

根据分子量大小分离

②离子交换层析法（DEAE—CelluloseDEAE—Sephadex）

根据肽段的电荷特性分离

③反相HPLC法

根据肽段的极性分离

④凝胶过滤

4、肽段纯度鉴定

分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用DNS-cl法

要求：SDS—PAGE单带、HPLC单峰、N端单一。

（=）肽段的序列测定及肽链的拼接

1、Edman法

一次水解一个N端a.a

（1）耦联

PITC+H2N—A-B-C-DpH8—9,40℃PTC——A-*C-D

（2）裂解

PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸ATZ—A+H2N—B-C-D

（3）转化

ATZ—APTI1—A

用GC或HPLC测定PTH-A”

PTC肽：苯氨基硫甲酰肽

ATZ：曝哇咻酮苯胺（一氨基酸）

PTH：紫乙内酰硫胭（一氨基酸）

耦得PTC肽

一次循环裂理：ATZ-a.a

转，：PTH-a.a

反应产率99次循环次数120

（偶联、降98%60

解两步）90%40

2,DNS-Edman法

用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。

A—B—C—D—E肽

图

3、有色Edman法

荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。

4、用自动序列分析仪测序

仪器原理：Edman法，可测60肽。

1967液相测序仪

自旋反应器，适于大肽段。

1971固相测序仪

表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的C端。

1981气相测序仪

用Polybrcne反应器。

（聚阳离子）四级镀盐聚合物

液相：5nmol2Q40肽97%

气相：5pmol60肽98%

5、肽段拼接成肽链

16肽，N端HC端S

A法裂解：ONSPSEOVERLAH0WT

B法裂解：SEOWTONVERLAPSHO

重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS

(四)二破键、酰胺及其他修饰基团的确定

1、二硫键的确定(双向电泳法)

碘乙酰胺封闭-SH

胃蛋白酶酶解蛋白质

第一向电泳

过甲酸氧化一s-s一生成-SO3H

第二向电泳

分离出含二硫键的两条短肽，测序

与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。

2、酰胺的确定

Asp-Asn、Glu-Gln

酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn

举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时，电荷量是Leu+Pro0Vai'

此肽除Glx外，净电荷为0,可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gin。

3、糖、脂、磷酸基位置的确定

糖类逋过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖普-0•糖普

脂类：Ser、Thr、Cys

磷酸：Ser、Thr、His

经验性序列：Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PC)4)

Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)

Lys(Arg)-Ala-Ser(PO4)

第五节蛋白质结构与功能的关系

一、蛋白质的一级结构决定高级结构和功能

蛋白质一级结构举例：

(1)牛胰岛素

(2)核糖核酸酶(RNase)

(3)人血红蛋白a和B链及肌红蛋白的级结构

(五)二、同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化

同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有

输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。

同源蛋白质的特点：

①多肽链长度相同或相近

②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变

残基高度保守，是必需的。

③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别

氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。

通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，

同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。

(六)蛋白质一级结构的个体差异一分子病

分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个(些)氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子

的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。

LinusPauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白

是由两条相同的a链和两条相同的。链组成a2%，镰刀形红细胞中，血红蛋白|3链第6位的aa线基由正常的

Glu变成了疏水性的VaL因此，当血红蛋白没有携带02时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的

红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用（血细胞溶解）导致病血.，棍棒形的血红蛋白对O?的结合力比正常的

低。

以血红蛋白为例：a282寡聚蛋白

正常人血红蛋白，B.NGlu6

镰刀型贫血B.NVai6

生理条件下电荷：

Val°Glu

疏水亲水

人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Vai分子，就能发生

镰刀状细胞贫血病。

一级结构的部分切除与蛋白质的激活

一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生

物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。

二、多肽与蛋白质的人工合成（自学）

在医药和研究方面意义重大

1958年，北大生物系合成催产素8肽。

1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。

1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa-）«

P139图3-46多肽的固相合成

C端_____端。

挂接f去读第一中和~缩合一去保护一中和f缩合

第六节蛋白质的理化性质

（）蛋白质的两性离解及等电点

蛋白质的两性离解及其平衡移动可用下式表示：（见幻灯）

P表示蛋白质大分子。在pH<pI的溶液中，蛋白质阳离子的浓度大于蛋白质阴离子的浓度;在pH>pI

的溶液中，则蛋白质阴离子浓度大于阳离子浓度。在某一pH值溶液中蛋白质的两性离子浓度处于极大值，

离解成阴、阳离子的几率相等，其净电荷等于零，这时溶浓的pH值就是该蛋白质的等电点（pl）。蛋白质在

等电点时溶解度最小，最易于沉淀。不同种类的蛋白质具有不同的等电点。

（-）蛋白质的胶体性质、盐析

1.蛋白质的胶体性质：

实验室中常选用不同孔径的半透膜（透析袋）来分离提纯蛋白质，这种方法称为透析，在膜上增加压力，

加压透析的方法称为超过漉。

使蛋白质溶液稳定的两个因素：电荷与水化膜。

沉淀蛋白质的方法：

⑴蛋白质的盐析：向蛋白质溶液中加入电解质到定浓度时，蛋白质便沉淀析出，这个作用称为盐析。盐

析所需盐的最小量称为盐析浓度。盐析是电解质对蛋白质溶液的沉淀作用。蛋白质盐析的特点是:①电解

质用量很大（以mollJ计算）；②盐析生成的沉淀，加溶剂稀释时，又可重新溶解。③不同蛋白质盐析

时所需的盐析浓度不同。利用此性质，可用不同浓度的盐溶液使蛋白质分段析出，予以分离。

（2）有机溶剂的沉淀：甲醇、乙醇、丙酮等极性较大的有机溶剂，对水的亲和力较大，亦能破坏蛋白质

分子的水化膜。在等电点时加入这些脱水剂可使蛋白质沉淀析出。但这些溶剂如与蛋白质长时间接触，则

沉淀的蛋白质会发生性质的改变，而不再溶解。在中草药有效成分的提取过程中，常加适量的乙醇以沉淀

蛋白质，就是根据这个道理。

(3)重金属盐沉淀，氯化汞、硝酸银、醋酸铅、硫酸铜等重金属盐，在溶液的pH值大于蛋白质等电点

时，它们的重金属离子如C『+,Hg2+,Pb",Ag+等能与蛋白质的竣基阴离子结合，生成不溶性的沉淀。

(4)某些酸类的沉淀：铝酸、苦味酸、糅酸、磺基水杨酸、偏磷酸、：氯醋酸等酸的复杂酸根，在溶液

的pH值小于蛋白质的等电点时，能与蛋白质的镀阳离子结合，成为不溶性的沉淀。

(=)蛋白质的显色反应

1.缩二朦反应：蛋白质碱性溶液与稀硫酸铜溶液可发生缩二麻反应，呈现出紫色或紫红色。生成的颜色

与蛋自质的种类有关。

2.茴三酮反应：将蛋白质的近中性溶液(pH5〜7)与玮三酮水溶液(1:400)1〜2滴混合并加热煮沸1〜2min,

放冷后产生蓝紫色反应。蛋白质、肽类、氨基酸及其它伯胺类化合物等具有自由氨基的化合物(包括氨)对

荀三酮均呈阳性反应。此反应也可用于蛋白质的定性与定量分析。

3.其它显色反应：氨基酸(及蛋白质)还与某些试剂发生显色反应(表12-6),这些反应常用于氨基酸的鉴别。

第七节蛋白质的分类

(-)按分子形状分类

1.纤维状蛋白形状似纤维，不溶于水，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋臼等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶

性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。前者如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如胶原蛋白，弹

性蛋白，角蛋白等结构蛋白。

2.球状蛋白分子似球体，较易溶于水，如血红蛋白、血清球蛋白等。球状蛋白的长度与直径之比一般小于

10o

(-)按组成分类

1.简单蛋白完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。如血清清蛋白等。根据理化性质及来源分为清蛋白(乂名

白蛋白,albumin),球蛋白(globulin)、谷蛋白(glutelin)、醇溶谷蛋白(prolamine)、精蛋白(protamine)、组蛋

白(histone)、硬蛋白(scleroprotein)等。

2.结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，分为核蛋白(nucleoprotein)、磷

蛋白(phosphopmtein)、金属蛋白(metalloprotein)、色蛋白(chromoprotein)等

(三)根据功能分类

1、活性蛋白质：包括在生命过程中一切有活性的蛋白质及其前体，如酶、激素蛋白质、运输和贮存蛋白

质、运动蛋白质、受体蛋白质、膜蛋白质等。

2、非活性蛋白质：对生物体起保护或支持作用，如胶原、角蛋白等。

第八节蛋白质的分离纯化

一、蛋白质的提取

研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。

(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；

(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。

(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。

蛋白质的提取步骤

(1)