2021高中生物竞赛-细胞生物学基础02细胞生物学研究方法课件

2021高中生物竞赛基础细胞生物学第二章细胞生物学研究方法

细胞生物学的研究方法归纳起来大体上可划分为四大类：形态观察、生化分析、生理检测、实验性操作技术。光学显微镜（lightmicroscope）电子显微镜（electronmicroscope）扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope）第一节细胞形态结构的观察方法尼康E-600显微镜

一、光学显微镜（一）普通光学显微镜普通显微镜由聚光器、物镜和目镜三部分组成。小鼠肝细胞中糖原人肝癌细胞中的微丝蛋白LightPathwayofMicroscope普通显微镜最大放大倍数1000－1500倍因为它的分辨率有限，再放大也是空放大

分辨率（resolution）：能将物体相近两点分辨清楚的距离极限

D代表分辨力：D=0.61

/N.A.

代表光波波长；N.A.为镜口率，也称数值孔径（Numericalaperture)。

N.A.=n

Sin

/2

n：物镜与标本间介质的折射率；（1或1.515）

：镜口角（聚光焦点对物镜镜口的张角，<180º）物镜镜口

标本结论：通过公式可知光学显微镜最大分辨率0.2um减小分辨率需减小

介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66显微镜的几个光学特点：介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好。sinα/2的最大值小于1；普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。（二）紫外线显微镜（ultravioletmicroscope）根据光学原理，光源光波越短，显微镜的分辨本领越大。紫外线显微镜以紫外线为光源，分辨率可提高一倍。可看到在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。可用来测定细胞中的核酸含量。透镜：石英、萤石（CaF2)、碳酸锂等制作。价格昂贵，使用受限。（三）荧光显微镜（fluorescentmicroscope）20世纪40年代在紫外线显微镜基础上发明。原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射也可发荧光。荧光显微镜对这类物质进行定性或定量研究。结构：在普通光学显微镜上添加一些附件：A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。B.滤片：根据性能分为两组。一组是激发滤片，作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。敏感性高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究。荧光显微镜荧光显微照片(微管绿,微丝红,核蓝)（四）暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）原理：显微镜加装特殊装置，使直射光不能进入物镜，只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜特点：视野的背景是暗的，样品是的边缘是亮的。特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野光阑暗视野照明方式

能见到小至5nm的质点，分辨率比普通显微镜高40倍。有些细胞器如核、线粒体亦可见。能够看到正在运动的微小物体（如精子），也能看到不运动的及某些不能被染色的脂粒，因而常用于微生物与胶体化学研究。（五）相差显微镜（phasecontrastmicroscope）相差显微镜由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。原理：将透过标本的可见光的光程差（也就是相位差）变成光强差（即振幅差），从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。

相差显微镜体外培养的Hela细胞构造：聚光器或光源上安装环状光阑（annulardiaphragm)；在物镜中加了环形相板(annularphaseplate)。光阑的作用：使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。光线透过标本发生衍射，偏离了未透过标本的光线线路，波长延迟1/4

。相板作用：相板上有一环形区制成凹槽或凸起，器深度可使通过此区的光线提前或延迟1/4

。主要用于观察活细胞或活组织，是体外细胞和组织培养工作的重要工具。（六）微分干涉差显微镜（differentialinterferencecontrast(DIC)microscope

）1952年，Normaski在相差显微镜原理的基础上发明。能显示结构的三维立体投影影像。

DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）

分离的有丝分裂纺锤体左、微分干涉显微镜；中、相差显微镜；右、偏振光显微镜。（七）激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope）

用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。

laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)光学显微镜小结普通光学显微镜：0.2um紫外线显微镜：0.1um荧光显微镜暗视野显微镜相差显微镜微分干涉差显微镜激光共聚焦扫描显微镜二、电子显微镜（electronmicroscope）简称电镜电子显微镜以电子束代替了可见光，大大提高了显微镜的分辨率，可以观察细胞的亚显微结构。电子束的波长与电压成反比，波长极短。例如，电压为6万伏，则

=0.0488埃，比最短的可见光4000埃约小10万倍。德国西门子公司制成了第一台电子显微镜，当时分辨率只有3nm。1964年后达到0.3nm，现在最佳性能的电镜分辨本领可达0.1-0.2nm。电镜的基本构造主要如下：

A：电子束照明系统；

B：电磁透镜成像系统；

C：真空系统；

D：记录系统；

E：电源系统。

电镜与光镜的主要区别：

光镜电镜

光源

可见光电子束

介质空气（香柏油）真空

聚光镜光学透镜电磁透镜

分辨力

0.3

0.1um0.1nm

放大倍数

1000倍百万倍

（一）透射电子显微镜（TEM：transmissionelectronmicroscope）观察标本内部细微结构放大近百万倍超薄切片（500埃）通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片采用重金属盐染色，以增大反差。

JEM-1011透射电子显微镜

正在凋亡的乳腺细胞核被膜破裂，染色质凝集细胞毒T细胞结合到靶细胞（肿瘤细胞）上细胞毒T细胞杀死了靶细胞冰冻蚀刻（freeze-etching)，或冰冻断裂(freeze-fracture)配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术。研究生物膜内部结构的有用技术。主要步骤：

A.冰冻标本（-1000C干冰或-1960C液氮）

B.冷刀断开标本（冰冻断裂）

C.升温，冰升华，断裂面结构暴露（蚀刻）

D.表面喷一层蒸汽碳和铂，

E.将组织溶掉，碳和铂的膜称复膜（replica）F.电镜下观察复膜，复膜构造=标本构造冰冻蚀刻电镜照片

（二）扫描电子显微镜（SEM：scanningelectronmicroscope）观察标本表面形态结构标本特殊处理：固定脱水后，喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

JEOL扫描电子显微镜

人类血细胞SEM照片

弹性纤维网

左：狗主动脉的低倍扫描电镜图片；右：同一血管外层的

纵向排列的致密弹性纤维网（高放大倍数）。

其它成分已用酶和甲酸消化。一个典型的有丝分裂中期的染色体近末端区域的扫描电镜照片一个有丝分裂染色体的染色单体的透射电镜照片一个正在分裂的动物培养细胞，扫描电镜图片早期小鼠胚胎的扫描电镜照片A：2细胞时期B：4细胞时期C：8-16细胞时期，桑椹胚D：胚泡期ABCD三、扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope,STM)Binning,Rohrer等1981年发明，获1986年诺贝尔奖。用来显示晶体表面原子布阵的一种显微镜。原理：加上一定电压的精密探针。钨丝或白金丝，直径几个埃。电子在样品与探针之间（距离几个埃）转移形成电流。特点：分辨率高，横向为0.1-0.2nm，纵向为0.001nm.三维图像。三态物质均可观察。细胞化学和组织化学技术免疫细胞化学显微光谱分析技术放射自显影术超离心技术分子杂交技术PCR技术第二节生物化学分析一、细胞化学和组织化学技术细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，从而对某种成分进行研究和分析。细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。例：DNA的Feulgen反应显示法1924年，Feulgen和Rossenbeck发明。原理：盐酸水解，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，出现醛基，试剂中的无色品红与醛基反应，呈现紫红色。例：

PAS（高碘酸席夫反应）──鉴定多糖类物质醛基与Schiff试剂反应，生成红色化合物。。（一）固定物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。（二）显示方法金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。茚三酮反应：显示蛋白质。二、免疫细胞化学（immunocytochemistry)是根据免疫学原理，利用抗体同特异抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特异的抗原分泌的r球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。

方法：原位分析体外蛋白质分析（一）原位分析★免疫反应

直接法：Ag+Ab*

镜检（*代表标记物）间接法：Ag+Ab1+Ab2*

镜检标记物可以为多种：荧光素─免疫荧光技术或称荧光抗体法酶─酶标抗体法放射性同位素标记—放射自显影铁蛋白标记免疫胶体金技术常用标记物：荧光素、酶。常用荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明；常用的酶：辣根过氧化物酶。酶标抗体法，又名酶联免疫吸附法（ELISA），利用酶标记抗原或抗体以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其基本原理是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，而相对应的抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原，酶标抗体或抗原既保留了免疫活性可以与固相载体表面的抗原或抗体结合，又保留了酶活性能够以酶为检测信号，加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与受检抗体或抗原的量成比例，故可根据颜色深浅来定性或定量分析。酶标抗体法具有灵敏性强，特异性高，重复性好，检测速度快的特点，尤其适用于大批量样本检测，是国际认可的标准化诊断方法。（二）体外蛋白质分析蛋白质印迹法（Westernblotting）技术路线：（图）样品制备—样品分离—样品转移—免疫反应——检测蛋白质由SDS聚丙烯凝胶

硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹（blotting）三、显微光谱分析技术细胞中有些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线，如核酸的吸收波长260nm，蛋白质280nm。有些成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用细胞分光光度计对一定的成分进行定位、定性，甚至定量测定。四、流式细胞术*仪器：流式细胞计—flowcytometer*特点：细胞是高速运动的*主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞。二、流式细胞术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。五、放射自显影（radioautography)放射自显影技术：利用放射性物质使照相乳胶膜感光，再经显影以显示该物质自身的存在部位的技术。由于有机大分子均含有碳、氢原子，实验室一般采用14C、3H标记。14C、3H均为弱β放射性同位素，半衰期长。14C半衰期为5730年，3H为12.5年一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA，用3H尿嘧啶核苷显示RNA。在研究蛋白质和粘多糖时，分别选用3H氨基酸、3H甘露糖、3H岩藻糖等。3H-尿嘧啶脉冲标记的细胞，示异染色质区（核内白色区）无转录活性五、超离心技术高速离心：10000—25000r/min超速离心：转速大于25000r/min沉降系数（“S”—Svedbergunit）:单位离心场中溶质分子的沉降速度1S相当于1

10-13s离心目的：分离细胞器与生物大分子及其复合物大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。离心种类：分析离心：用于分析和测定制剂中的大分子的种类和性质等制备离心：差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离（介质蔗糖、氯化铯）微粒体(microsomes)在超离心时，分离出的小泡状成分，系由内质网等膜的碎片组成，小泡的外表面常附有核糖体，是研究糙面内质网功能活动的良好材料。（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。1、速度沉降velocitysedimentation

用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。（一）差速离心Differentialcentrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。六、分子杂交技术（molecularhybridization)原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。方法：原位杂交体外分析核酸的主要方法★Southernblotting又称DNA印迹法Northernblotting又称RNA印迹法原位杂交（insituhybridization)：在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术。染色体在高pH值条件下，DNA解链，带标记的核酸探针即刻与染色体一定部位杂交。既可检测DNA序列，也可检测RNA序列。带放射性的DNA探针，放射自显影；免疫探针法。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交

荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA（黄）七、PCR技术：聚合酶链式反应原理：将DNA片段经过若干次解链和复性循环，大量扩增，甚至可扩增到十几亿倍，以便于对已知DNA片段进行分析，如基因分析、序列分析、进化关系分析和临床诊断等。一般可扩增106-107。DNA聚合酶：Taq酶，来源于一种嗜热水生菌。最适作用温度75-80度，95度下短时间不失活。第三节细胞生理学技术1、膜电位检测技术细胞内外存在电位差（20~100mV）称为膜电位，膜电位的变化反应了细胞的生理变化2、膜片钳位记录技术主要用于检测单个特定离子通道性质及变化3、细胞电泳细胞表面带有许多电荷，因而可以在外加电场的作用下移动三、细胞电泳原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。用途：检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。第四节实验操作技术一、细胞培养高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动十分困难。活细胞离体培养（一）动物细胞培养20世纪初，Harrison（1907）两栖类胚胎神经管组织悬浮培养，神经细胞存活多天，观察到神经细胞分化成神经元，伸出了轴突。20世纪40年代，W.Earle和R.Dulbecco设计出细胞培养液配方，并将组织分散成单个细胞进行悬浮培养，细胞培养工作广泛展开。体外培养细胞生长特点：接触抑制现象细胞消化方法：酶法：胰酶，果胶酶非酶法：EDTA细胞培养方式：A.

群体培养（massculture)：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。B.

克隆培养(clonalculture)：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生殖生长，每一个细胞形成一个细胞集落，此种集落即称为克隆（clone)。群体培养（左）和克隆培养（右）

C.

转鼓培养法：使用大容量的原培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁，用于细胞大规模培养而制取细胞产品。化学合成培养基：TC-199，RPMI-1640等细胞培养中要注意：细胞所需要的营养成分要尽量满足要保持适当的渗透压严格控制pH值添加细胞所需的生长因子血清、血浆等正常组织的初级培养物，细胞传代培养的寿命有一定的限度只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去转化：正常细胞在某种因子的作用下发生突变而成癌性细胞。细胞培养的基本概念外植体：用于体外培养的组织和细胞群原代培养（primaryculture）──原代细胞传代培养（sub-culture）细胞株:通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。

细胞系：原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（CellLine），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。克隆：一个细胞经有丝分裂繁殖的一群后代（二）植物细胞培养动物细胞—体外不能分化，不能形成组织；植物细胞—体外可分化发育为植株，即再生植株。植物细胞培养分为：1.花药或花粉培养：花粉培养液愈伤组织分化培养基长出茎叶另一分化培养基根形成花盆植株2.胚和胚珠培养：胚幼胚培养基2~3周分化胚状体的培养基长出茎叶……3.茎顶端培养：茎顶或叶片组织酶消化单细胞愈伤组织途径……4.原生质体高渗培养基生成细胞壁分化培养基愈伤组织……

植物细胞经纤维素酶或果胶酶去掉细胞壁即成原生质体，原生质体可进行细胞融合及转基因操作。二、显微操作技术在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。

三、细胞融合概念：真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion)或细胞杂交（cellhybridization)。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon)。同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。小麦+各种禾本科草单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用.正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获