流式细胞仪培训手册(完成版)

流式细胞仪培训手册序论学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的根底上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。本书介绍了流式细胞仪的根本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机〔FACScanTM，FACSortTM，FACSCaliburTM，和BDLSR〕与大型机〔FACSVantageTM，FACSVantageTMSE，和FACStarPLUSTM〕之间的不同。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。目录第1章综述……………………4第2章液流系统………………第3章散射光信号及荧光信号………………3.1散射光信号………3.2荧光信号…………3.3荧光补偿第4章光电系统………………4.1光平台……………4.2光学滤片………4.3信号探测器……………………4.4阈值………………第5章数据分析………………5.1数据采集及显示…………………5.2设门………………5.3细胞亚群的数据分析…………5.4流式细胞仪其它应用的数据分析………………5.5CellQuest软件使用……………5.6MutiSet软件使用………………5.7Simultest软件使用……………5.8B27软件使用…………………5.9WinMDI软件使用…………5.10FACSPress软件使用…………5.11SystemII软件使用…………5.12MultiCycle软件使用…………5.13Modfit使件使用……………第6章流式根本检测工程6.1淋巴细胞亚群检测〔双色、三色、四色，三种软件分析〕6.2B27的检测………6.3血小板抗体检测………………6.4网织血小板及红细胞分析……6.5干细胞检测……………………6.6DNA倍体分析……………………6.7凋亡检测…………第7章分选6.1分选………………第8章激光器及光路校正……………………7.1激光器的工作原理………………7.2光路校正…………第9章答案………………第一章综述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。流式细胞仪主要由三局部组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下：·液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。·光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。·电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统〔相应的透镜，滤片和探测器〕收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式〔Listmode〕完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。图1-1散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲习题：概览1流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性？2大多数流式细胞仪使用何种光源？3流式细胞仪的三大系统是什么？4哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析？5液流包绕细胞形成？6带有荧光的细胞通过激光束时，会产生哪两种光信号？7由粒子激发的光由收集。8所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗？〔对错〕9在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗？〔对错〕第二章液流系统液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态，这个过程称为流体聚焦。该原理适用于所有流动室，如图2-1和2-2所示：图2-1细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦，图2-2细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。·台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒子或细胞在流动室内与激光相交〔图2-1〕。除BDLSR型台式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样本压力〔分低，中，高速〕。·大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室外与激光相交〔图2-2〕。且样本压力连续可调。增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时，一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这在一定程度下是允许的。·高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。·低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比拟均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作是至关重要的。习题：液流系统1流式细胞仪中液流系统的作用是什么？2细胞流经激光束时影响激光照射细胞的两个因素是什么？3在特定时间内，应该有多少细胞流过激光束？4单个细胞悬液在内注入。5鞘液环包样品并使之居中的过程称为效应。6什么调节器可以控制细胞液柱的宽窄？7对于台式机，样本的固定压力是多少。8增加样本压力，也就是样本流速和液柱。9DNA研究对检测分辨率要求较高，推荐流速为多少。10加大流速会降低检测分辨率。〔对错〕11定性检测时可使用高流速。〔对错〕第三章散射光信号和荧光信号的检测上一章我们了解到粒子或细胞是如何依次通过液柱的，本节我们首先学习激光如何照射在单个细胞上的。3.1散射光信号粒子折射激光产生散射光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术〔如染色〕，因此被称为细胞的物理特性，即细胞的大小和内部结构。散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构的折射性、颗粒性密切相关，细胞形状和外表形貌也对其产生影响。前向角散射：前向角散射〔FSC〕光与被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号〔见图3-1〕。FSC不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。侧向角散射：侧向角散射〔SSC〕光与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感〔见图3-1〕。SSC收集与激光束正交90度方向的散射光信号。图3-1细胞的光散射特性上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下列图〔图3-2〕为FSC和SSC组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。图3-2FSC、SSC二维散点图习题：散射光信号1什么时候会发生光散射现象。2光散射信号与细胞的哪些特性有关。3与激光束方向相同的光散射称为散射。4FSC与细胞的哪些特性相关？5与激光束方向呈90度角的光散射称为散射。6SSC与细胞的和相关。7和双参数的组合可区分不同种类的细胞亚群。3.2荧光信号荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换称为荧光。能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发一种以上的荧光〔详见第7章〕。光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。FITC的激发光谱如图3-3所示，488nm非常接近FITC的激发光谱的峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。图3-3FITC、PE、PerCP、APC染料的激发光谱如果激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，我们可以同时检测两种以上的荧光。如FITC和PE双染就符合这种条件。这两种荧光素的发射光谱如图3-4所示。虽然PE的激发光谱的峰值不是488nm，但也足以检测到荧光。更重要的是，FITC的发射光波长是530nm，PE的发射光波长是570nm。他们的发射光波长足够远，可以使用不同的检测器。被检测到的荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。图3-4FITC、PE、PerCP、APC染料的发射光谱图3-5荧光标记抗体对细胞外表抗原的特异性结合对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞外表抗原标记确认细胞类型〔见图3-5〕。在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的染色模式与FSC和SSC数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。3.3荧光补偿使用流式细胞仪进行多色分析时，由于荧光发射光谱的重叠，需要做补偿调整 在流式细胞仪上进行多色免疫荧光分析时，使用的不同荧光素的发射光谱有重叠现象，如果不对这种现象做适当的调整，就会导致某一荧光素发出的荧光被其它“错误”的检测器检测到。这种由于补偿问题导致的错误，会得到假阳性的错误结果，并可能在等高图的多色分析时，得到错误的细胞群体。这里，我们可以通过使用恰当的单染或双染的样本，对补偿加以调整，去除光谱重叠局部的影响信号，就可以准确地在流式细胞仪上进行细胞多色分析了。单克隆抗体偶联上荧光素fluoresceinisothiocyanate〔FITC〕、R-phychoerythrin〔R-PE〕以及Cy-Chrome，就可以用来检测某一细胞群的多种抗原特性了。在做这样的多色分析时，使用同一波长的激发光〔488nm〕，即15毫瓦氩离子激光。FITC的发射光为绿色荧光〔峰值为530nm〕，信号被FL1检测器检测；R-PE的发射光为橙红色荧光〔峰值为575nm〕，信号被FL2检测器检测；Cy-Chrome的发射光为紫红色荧光〔峰值为670nm〕，信号被FL3检测器检测。但是，FITC的发射光谱有橙红色光，而R-PE的发射光谱也有绿色光，等等，依次类推。这些光谱的交叉重叠，会导致荧光信号被相应检测器以外的错误的检测器探测到。因此，要使用补偿的方法校正这种信号重叠导致的错误。它通过电子补偿的方法，来去除重叠信号的影响，通过电子补偿，使检测到的单染细胞的另外两种荧光信号与未染色细胞的信号水平相同。 补偿缺乏或补偿设置不当，都会导致假阳性结果或人为造成直方图的偏移。例如，在多色分析中，如果荧光染色细胞的补偿设置缺乏，就可能在双色等高图上显示出一个假的双阳性群体，导致数据分析失误。在三色荧光分析时，为了防止由于补偿造成的错误，应该使用单染细胞调整补偿〔另外两种荧光为阴性对照〕，即用每一个荧光抗体单染细胞，然后调整每两种颜色之间的补偿。双色分析时，可以使用两个互斥的单阳性抗体，通过两种单阳性细胞群体和双阴性群体来调整补偿。为了使测定结果标准化，并到达长期检测仪器性能的目的，应该每日使用标准荧光微球和自动的定标/补偿软件，做荧光补偿的初步调整。流式细胞仪多色分析的补偿调整步根据实验室要求，每日做仪器校正〔calibration/standardization〕。检测一个未染色样本〔自发荧光〕，调整前向角散射光FSC和侧向角散射光SSC设置，使测定细胞群体显示好，并可以按要求设门。设门后，调整自发荧光的FL1、FL2、FL3的电压设置〔detectorsettings〕，在对数模式下，使自发荧光位于荧光直方图的左侧〔101以内〕。比拟自发荧光和阳性细胞的荧光强度，保证每个荧光的阳性水平都可以按比例显示。使用荧光抗体逐个染色〔单染〕，运行单染样本，调整补偿。监测双色点图，调整补偿设置〔compensationsettings〕，使染色阳性细胞和未染色阴性细胞在横轴水平，在纵轴垂直。例如，对于PE标记的单克隆抗体染色的细胞群，上下调整FL1-%FL2的设置，使FL2阳性群体与FL2阴性群体上下垂直〔FL2vsFL1点图〕；然后，使用FITC标记的单克隆抗体染色的细胞群，左右调整FL2-%FL1的设置，使FL1阳性群体与FL1阴性群体左右水平〔FL2vsFL1点图〕。然后，再依次调整第三色补偿FL2-%FL3和FL3-%FL2。使用双色补偿质控样本，微调补偿。用①FITC和PE单克隆抗体，②PE和Cy-Chrome单克隆抗体染色，最好使用单克隆抗体和同型对照染互斥的单阳性细胞群体。可以将两种单染细胞混合，用一个样本管进行双色补偿调整〔如混合FITC和PE染色细胞〕，在缺少互斥标记的情况下，可以使用此方法。每一种细胞群体应位于相应的象限。在某些流式细胞仪上，FL1和FL3不能直接进行补偿。因此，做双色分析时，不需要做FITC/Cy-Chrome补偿对照管。检查三色荧光染色的细胞群，在前面的步骤里，已经做好了补偿，因此，这里就不需要再调整了。获取样本的对照管和实验管，并保存数据文件。每一个多色分析的实验，都需要进行补偿的调整。因此，每做一种多色分析的实验，都要用单染和双染对照样本，按照3-7步做实验条件的调整。为了减少不同试剂间的荧光条件的调整，在开始调整补偿时，首先应选择各荧光通道中染色最强的试剂/细胞。习题：荧光信号1当荧光物质吸收激光能量，并释放过剩能量时，会发射。2荧光物质能被激光激发出荧光的波长范围称为。3由荧光染料发射的波长称为。4在流式细胞仪中通常采用什么激光器。5能够激发FITC和PE的波长是多少。6流式细胞仪最常用的两种荧光素是和。7荧光素标记抗体用于检测。第四章光学系统光学系统由光学激发器和光学收集器组成。光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。光学收集器那么由假设干透镜组成，用于收集粒子发射的光束激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。光平台的设计可实现以上功能。4.1光学平台流式细胞仪的光平台提供了一个固定平面，将激光源、光学激发器和收集器控制在一个固定的位置。因而台式机的流动室和光路是固定的，能够保证光斑和样本流自始至终保持恒定。图4-1和图4-2分别为台式机FACSCalibur和BDLSR的光平台系统。图4-1台式机FACSCalibur光平台系统图4-2台式机BDLSR光平台系统在大型机中，当液流流过喷嘴时，激光束通过消色差透镜组以最正确角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置会发生变化，所以大型机的光路没有台式机稳定，需要每日优化。光路不正有可能导致粒子受激光照射的能量不均一，从而被激发出的荧光强度也不相同，造成测量误差。大型机的光平台系统见图4-3。图4-3大型机FACSVantageSE光平台系统习题：光学平台1光平台为激光器与提供了一个固定平面。2保证所有细胞受到均一的光照强度的两个必要条件是什么。3每次使用大型机时都需要进行光路校正〔对错〕。4在台式机中，固定的能够保证激光截取的位置是不变的。4.2光学滤片当细胞或粒子流过激光照射区时，SSC和荧光信号很弱，需要使用光电倍增管〔PMTs〕收集，而FSC信号很强，由光电二极管收集即可。所有信号经由透镜组和滤片组到达相应的检测器。光电倍增管〔PMTs〕检测到的荧光信号常常是很微弱的。在光电倍增管〔PMTs〕前设置滤片可以使相当窄的一波长范围内光通过，提高了荧光信号的纯度和强度，因而每个检测器只有一种指定波长的荧光信号进入而被检测，使光谱带宽接近荧光染料的发射峰值。这种滤片称为带通〔BP〕滤片。如：FITC检测器前的滤片标志为530/30，其含义是光谱发射波长：530±15nm，或者说允许通过的波长范围在515nm和545nm之间。BP500/50那么表示其允许通过波长范围为475nm-525nm。流式细胞仪中常用的滤片还有长通滤片〔LP〕和短通滤片〔SP〕，长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500nm以上的光通过，而500nm以下的光吸收或返回。短通滤片与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。〔见图4-4〕。分光器的主要作用是完成光的收发。二色性反射镜就是其中一种。560短通二色性反射镜如图4-1所示发射560nm或小于560nm的波长〔如图4-1所示〕。大于560nm的波长被反射。图4-4光线通过长通滤片、短通滤片及带通滤片的波长范围习题：光学滤片1检测器前放置滤片作用是什么。2带通滤片530/30发射的波长范围是到。3用于选择性地通过特定波段荧光并将另一波段荧光反射至适宜的探测器中。4滤片允许特定波长及以下的光通过，而滤片允许特定波长及以上的光通过。4.3光电探测器处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号〔电压〕，然后到相应的通道。BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管〔PMTs〕。光电倍增管〔PMTs〕对光信号比光电二极管敏感，所以前者用于检测较弱的SSC信号和荧光信号；后者用于检测较强的FSC信号。粒子进入照射区开始散射光或荧光时产生充电脉冲，首先光信号或光子由光电倍增管〔PMTs〕或光电二极管转换成相应的电信号，产生电流，电流经由放大器，转换成充电脉冲。当粒子位于激光束正中时，脉冲最大，荧光最强。当粒子偏离激光束时，脉冲回到基线〔如图4-5所示〕。图4-5充电脉冲的产生充电脉冲的大小取决于光电倍增管前置放大器获得的光子数量，放大器可设置为线性放大或者对数放大〔Lin或Log〕。对数放大〔Log〕常常用于把阴性信号从微弱的阳性信号中别离出来；而线性放大〔Lin〕通常用于放大散射光信号和荧光信号。充电脉冲通过模数转换器把0-1000mV的脉冲转换成为代表0-1,000mV通道的数值。通道数值经由输入输出〔GPIO〕数据线传送到计算机进行处理显示〔见图4-6〕。图4-6模拟信号到数字信号的转换过程习题：光电探测器1收集FSC光信号。2敏感度高的收集SSC光信号和荧光信号。3探测器产生电流，经由放大器转换成电压。〔对错〕4模数转换器〔ADC〕的作用。4.4阈值阈值用于设置低于该道值的信号不被处理，只有高于等于阈值道数的信号才会被送入计算机进行处理。每次只能有一个设阈参数。如：对免疫表型实验，阈值应设为FSC，以消除低于阈值道数的碎片。用户可根据实验要求设置其它参数的阈值。第二个阈值适用于配有两个激光器的台式机。如果设置了两个阈值，那么粒子必须同时满足两个阈值的要求才会被当作信号细胞处理。习题：阈值1FSC阈值用于消除信号。2如果设置两个阈值，细胞必须符合其中一个阈值的要求才会被当作信号细胞处理。〔对错〕第五章数据分析5.1数据采集及显示光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。4参数〔FSC，SSC，FITC和PE〕的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC〔FL1〕可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量〔如图5-1〕。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。图5-1流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1〔FL1〕，Y轴显示通道2〔FL2〕。3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量〔如图5-1〕。习题：数据采集及显示1在直方图中横轴和纵轴分别表示。2二维点图用于显示参数。3在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。5.2设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。图5-2全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图习题：设门1设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。〔对错〕5.3细胞亚群的数据分析数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。图5-3选定淋巴细胞亚群设门门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界〔见图5-4〕。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3FITC阳性峰。图5-4阴性对照峰M1〔NORM001〕和CD3FITC阳性峰M2〔NORM002〕图5-5的统计结果说明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1〔阴性〕细胞619个，M2〔CD3阳性〕细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。图5-5直方图统计结果二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限〔LL〕为双阴性细胞，左上象限〔UL〕为Y轴阳性细胞〔CD19PE〕，左下象限〔LR〕为X轴阳性细胞〔CD3FITC〕，右上象限〔UR〕为双阳性细胞〔CD19+/CD3+〕。图5-6阴性对照组(NORM001)和CD3FITC/CD19PE双染样本(NORM002)如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞〔CD19+/CD3+〕的百分含量为：296/2839=10.43%。图5-7散点图统计结果另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域〔如图5-8所示〕；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。图5-8CD3FITC/CD4PE双染样本分析图图5-9CD3FITC/CD4PE双染样本数据统计结果这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。为防止这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析〔clusteranalysis〕的新方法。BD公司的MultiSETTM和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置〔见图5-10〕。图5-10使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化比照5.4流式细胞仪的其它应用以及数据分析这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2，5和20〔从左至右〕。图5-11单细胞株分析图除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子〔接合子〕定量分析。QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。图5-12使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数我们使用ModFitLTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰〔G0/G1期，S期和G2M期〕不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。图5-13细胞周期的DNA直方图习题：数据分析1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？2见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。3LL象限代表双阳性细胞亚群。〔对错〕4见图5-6和图5-7，淋巴细胞〔CD3+/CD19-〕的百分含量是多少。5只能使用矩形设定细胞区域范围。〔对错〕6使用区域设定法分析样本有哪些缺乏。7防止细胞亚群移动的分析方法是什么。8在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。5.5CellQuest和CellQuestPro软件使用CellQuest和CellQuestPro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuestPro时的强大功能及视觉质感。CellQuest和CellQuestPro软件主安装在BDFACSCalibur型流式细胞仪上。1．软件数据流程在CellQuest和CellQuestPro软件的数据流分为二个局部：方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuestPro方案文件的图标CellQuest和CellQuestPro方案文件的图标CellQuest和CellQuestPro数据文件的图标CellQuest和CellQuestPro数据文件的图标CellQuest和CellQuestPro软件中还会有关于仪器设置的文件，保存所有的实验条件。它只能由CellQuest和CellQuestPro软件中还会有关于仪器设置的文件，保存所有的实验条件。它只能由CellQuest和CellQuestPro软件翻开。数据包必须由方案文件翻开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI。2.软件与仪器的连接流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuestPro软件。从Aquire菜单下选择connettocytometer。3．方案与数据之间的关系CellQuest和CellQuestPro软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。CellQuest和CellQuestPro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。CellQuestProCellQuest4．方案的建立A选择实验参数默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只翻开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动翻开633nm激光器。选择FourColor后，仪器自动翻开第二根激光器，且此时FL4可用。选择FourColor后，仪器自动翻开第二根激光器，且此时FL4可用。B,建立散点图或直方图，命名坐标CellQuestPro软件主要工作界面，软件类似于Officeword的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。使用工具条可以建立散点图、直方图并在图上设立各种门。使用工具条可以建立散点图、直方图并在图上设立各种门。在CellQuestPro软件中，如果Inspector窗口开着的话，选中任意直方图或散点图就会出现该图的属性，其中包括有X、Y轴的参数、是否多色显示、图的分析或采集属性等等。在CellQuestPro软件中，如果Inspector窗口开着的话，选中任意直方图或散点图就会出现该图的属性，其中包括有X、Y轴的参数、是否多色显示、图的分析或采集属性等等。在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来翻开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜单上选择Acquire栏目，选择ParameterDescription，可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC，FL2为CD4PE……。C,设门并建立门与图之间的关系在工具栏上有左侧几个按钮可分别矩形门、自由门、线性门、圆形门和自动门。在工具栏上有左侧几个按钮可分别矩形门、自由门、线性门、圆形门和自动门。本处重点介绍Snap-To门本处重点介绍Snap-To门，它可根据细胞群体的分布自动调整门的形状适应细胞群体。R与G的关系R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：Gate实际了个代数式，简称G，其运算式默认如下：G1=R1，或G2=R2当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1ANDR2。此时G1就成了一个算术结果了。G1=R1ANDR2G2=R1NOTR2G3=R1ORR2RegionList管理门，可以重命名或删除门。GateList是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。建立门与图之间的关系翻开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。D，显示统计参数如何编辑这些统计参数选择统计参数框，在Stats菜单下的EditStatistic会变得可用，点出后出现统计参数编辑对话框。选择任意直方图或散点图，在Stats下拉菜单下会有更种统计参数选项。对应于不同的图出现不同的统计参数。如何编辑这些统计参数选择统计参数框，在Stats菜单下的EditStatistic会变得可用，点出后出现统计参数编辑对话框。选择任意直方图或散点图，在Stats下拉菜单下会有更种统计参数选项。对应于不同的图出现不同的统计参数。5．仪器的操作当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框：6．文件的保存及调用实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文件：如要翻开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包〔前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性〕，有两种方案翻开以往的数据：方法一：选择直方图或散点图，翻开该图的属性框〔Plot->>Format〕，见下列图：在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。方法二：选中方案中所有的直方图或散点图，翻开Plots菜单，选择ChangDataFile，翻开要分析的数据包。附：CellQuestPro软件所有下接菜单5.6MutiSet软件使用MultiSET是BD公司的一个全自动获取分析软件。它使用免洗试剂〔TriTEST三色试剂或MultiTEST四色试剂〕制备标本，可以用来做外周血的淋巴细胞及亚型分析，同时使用TruCOUTNT,可以进行绝对计数。MulSET设门分析，用Attractor定出淋巴细胞亚型区域。Attractor具有自动检查细胞位置漂移的功能，并自动居中。因此，使用Mul软件，可以提高实验室的工作效率和计数的精确度。MultiSET文件生成的文件类型：ScheduleDocumentFile(【DDMMYY】．Sch)：日程记录文件。LaboratoryReportFile(【前缀】【输入号】．Lab)：实验室报告，PICT文件。PhysicianReportFile(【前缀】【输入号】．Phy)：医生报告，PICT文件。SummaryReportFile〔【DDMMYY】．Sum〕：总结报告，PICT文件。FlowCytometryStandard〔FCS〕DataFile〔【前缀】【输入号】．【试管编号】〕：MultiSET软件可以获取或读取的FCS2.0标准数据格式..ExportDocumentFile(【DDMMYY】．Exp)：文本文件,包含标本和试剂信息,以及每管的所有亚群结果.2.软件与仪器的连接流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。在苹果菜单下点击MultiSET软件(或在Dock界面上点击MultiSET)..进入MultiSETMultiSET命令菜单参数预设:ExportPreferences:选择输出格式Tab或Comma;选择报告哪些试验结果,按SelectValuestoExport.PrintingPreferences:选择是否自动打印实验室报告Laboratoryreport,医生报告Physicianreport,总结报告Summaryreport.PannelsPreferences:预先设定试验工程Runafixedpanel,或任意选定试验工程Runanypanel.EventsPreferences:选择获取细胞数量.Levey-JenningsPreferences:选择质控统计,每30个一统计(30runs),每60个一统计(60runs),或不统计(None)MultiSET运行程序ⅰSignIn:输入操作者、单位、实验室主任,登记进入MultiSET.ⅱSetUp:建立测试要求.ⅲFACSComp:运行FACSComp,调整仪器条件.ⅳTestPrefs:规定报告内容.ⅴSamples:输入标本及病人信息.以下程序自动运行,由MultiSET做提示:ⅵAcquisition:标本获取.显示点图,以便查看标本获取情况.ⅶAnalysis:结果分析.显示点图,以便查看自动分析过程.ⅷLabReport:做实验室报告,显示每个标本的各管结果.ⅸPhysReport:做医生报告,显示每个标本的结果及正常值范围.ⅹSummary:总结.对当次MultiSET的所有标本的结果做总结.第一步:SignIn:MultiSET软件的起始页.●输入操作者姓名,单位名称和实验室主任名称.仪器自动显示流式细胞仪的序列号和型号.●点击Accept,进入下一工作程序.第二步:SetUp:建立测试要求●DataSource选择数据来源.√FromDataFiles:对以前保存的数据文件做分析.√FromCytometer:AcquisitionandAnalysis:在流式细胞仪上运行标本,获得数据并分析.√FromCytometer:AcquisitionOnly:在流式细胞仪上运行标本,获得数据不分析.EntryLevelFileNamePrefix确定数据文件,实验室报告,医生报告等文件名前缀的使用.ViewReports选择读实验室报告和医生报告的时间.AutomaticSavingOptions确定自动保存的文件类型及保存位置.√选择是否保存DataFiles,LaboratoryReport,PhysicianReport,SummaryReport,ExportDocument.√按Location,选择文件保存路径,文件默认路径BDFiles:MultiSETFiles:【DDMMYY】Folder(自动生成日期目录).目录名确认后,按SelectDDMMYY确定,返回SetUp界面..第三步:FACSComp:运行FACSComp,调整仪器条件选择LaunchFACSComp,进行Lysenowash校正.如果当日已做校正,那么选择SkipFACSComp,第四步:TestPrefs:规定报告内容选择是否报告绝对计数,是否报告正常值范围,以及总结报告的形式.Physician’sReportChoices医生报告的亚群选项ReportReferenceRanges报告正常值范围LaboratoryReportChoices选择实验室报告内容SummaryReportID总结报告编号第五步:Samples:输入标本及病人信息输入标本名称SampleName,标本编号SampleID及病历号CaseNumber.PanelName选择每个标本所做的工程.WBCCount如果您需要绝对计数结果,但不用TruCOUNT绝对计数管,您需要输入WBC计数总量和淋巴细胞百分含量,或输入淋巴细胞计数总量.注意:调用条件,翻开Cytometer→InstrumentSettings→Open(FACStation→BDFiles→InstrumentSettingsFiles→CalibFile.LNW或CalibFile如果是对以前检测的数据进行分析,点击AddSameple,添加数据,进行分析.第六步:Acquisition:标本获取.显示点图,以便查看标本获取情况第七步:Analysis:结果分析.显示点图,以便查看自动分析过程.第八步:LabReport:做实验室报告,显示每个标本的各管结果.注:可以点击ManualGate,此时可以更改点图大小,更改坐标轴.按照需要,调整淋巴细胞门或Attractors.第九步:PhysReport:做医生报告,显示每个标本的结果及正常值范围.第十步:Summary:总结.对当次MultiSET的所有标本的结果做总结.5.7SimulSET软件使用5.8HLA-B27软件使用HLA-B27自动软件是BD公司的一个全自动获取分析软件。它是专门用来分析人类白细胞抗原B-27基因表达与否。软件可以自动设门找到CD3+的T细胞群，并分析B27基因是否表达〔表达即为阳性结果，反之即为阴性〕。HLA-B27软件为全自动软件，因此，使用B-27软件，可以提高实验室的工作效率和精确度。.HLA-B27生成的文件类型：LaboratoryReportFile(【前缀】【输入号】．Lab)：实验室报告，PICT文件。SummaryReportFile〔【DDMMYY】．Sum〕：总结报告，PICT文件。.ExportDocumentFile(【DDMMYY】．Exp)：文本文件,包含标本和试剂信息,以及每管的所有亚群结果.软件与仪器的连接流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。在苹果菜单下点击FACSComp或B-27软件(或在Dock界面上点击FACSComp或B-27软件图标)..在FACSComp软件中用HLA-B27beads调试仪器条件a.在Dock菜单中FACSComp软件图标，点击出现FACSComp主界面，输入实验室操作人员姓名，实验室和实验室主任以后，点击Accept进入SetUp窗口。〔或者在上次执行2色Calibritebeads分析后，直接点击SetUp进入SetUp界面〕。b.在SetUp窗口中选择分析模式：选HLA-B27Calib。注意：要在确认Lyse/Wash(LW)分析模式的结果通过的情况下，才能进行HLA-B27beads的调试。c.输入HLA-B27BeadsLotNumber、Suffix和HLA-B27抗体LotNumber、Suffix，点击Run，进入调试窗口。注意：HLA-B27BeadsSuffix和HLA-B27抗体Suffix分别代表了FL1PMT的调试标准和Cutoffmarker的位置，对于结果至关重要，不可弄错。d.点击start,进入HLA-B27窗口。e.在HLA-B27窗口：在1ml蒸馏水中参加一滴HLA-B27beads混匀后，上机。点击Start，软件开始自动调节FSC放大器的倍数和FL1PMT的电压，获取结束后，调试结果会被自动保存。f.在Summery窗口：产生CalibrationReport，报告中包含所有你输入的信息，仪器当前的设置，调试结果，FSC及FL1的直方图等。调试成功后也就意味着此时的仪器条件可以直接用于HLA-B27自动软件分析B27基因的表达。进入B27软件.1B27命令菜单图.2B27运行程序a.SignIn:输入操作者、单位、实验室主任,登记进入B27软件.b.SetUp:建立测试要求.c.FACSComp:运行FACSComp,调整仪器条件。前边已经调试过，直接跳过进入下一步。d.Samples:输入标本及病人信息.以下程序自动运行,由B27软件做提示:e.Acquisition:标本获取.显示点图,以便查看标本获取情况.f.Analysis:结果分析.显示点图,以便查看自动分析过程.g.LabReport:做实验室报告,显示每个标本的各管结果.h.Summary:总结.对当次B27的所有标本的结果做总结.第一步:SignIn:B27软件的起始页.●输入操作者姓名,单位名称和实验室主任名称.仪器自动显示流式细胞仪的序列号和型号.●点击Accept,进入下一工作程序.第二步:SetUp:建立测试要求●DataSource选择数据来源.√FromDataFiles:对以前保存的数据文件做分析.√FromCytometer:在流式细胞仪上运行标本,获得数据并分析.FileNamePrefix确定数据文件,实验室报告,医生报告等文件名前缀的使用.ViewReports选择读实验室报告和医生报告的时间.AutomaticSavingOptions点击Accept,进入下一工作程序.第三步:Samples输入标本及病人信息输入标本名称SampleName,标本编号SampleID及病历号CaseNumber.第四步:点击RunTest上样本分析单击图标，上样进行试验。软件自动执行Acqusition、Analysis、LabReport三个步骤，给出报告单，测试结果自动保存。当进行多个样本测定时，点击进行下一个样本测定。第五步:LabReport:做实验室报告,显示每个标本的结果.第六步:Summary对当次MultiSET的所有标本的结果做总结..5.9WinMDI软件使用WinMDI是一款免费的流式分析软件，全名为：WindowsMultipleDocumentInterfaceForFlowCytometry,Version2.8。它的作者是：Dr.JosephTrotter，theScrippsResearchInstitute,SanDiego,USA(Dr.Trotter‘se-mailaddress)。在以下网址可以下载到该软件：://cytometry/files/products/wm28w95(1).exe该软件运行PC机平台，适用于Windows2000，XP等操作系统，使用十分方便，可将生成的流式分析图拷贝至office中。软件数据流程使用WinMDI首先需要数据源，这些数据源可以来自BD、Coulter或其他各种符合FCS2.0格式的流式数据包。注：使用本软件分析时只需要数据包，在BD仪器可以拷贝data文件，Coulter仪器上拷贝LMD文件即可。FCS2.0格式流式数据包中包含在实验中每个被检测颗粒在各探测器中信号，如1号颗粒的FS、SS、FL1、FL2通道的值，2号颗粒的FS、SS、FL1、FL2通道的值……。数据包中没有关于实验方案的信息。所以要翻开这些数据包需要先建立分析方案，如先建立FS/SS散点图，然后选择要分析的文件；建立FL1/FL2散点图，选择要分析的文件……。在WinMDI建立的分析方案无法保存，关闭软件方案即消失，这也是本软件最大的缺乏之处。软件与仪器的连接WinMDI是一款纯分析型的软件，它不与任何流式细胞仪相连接。安装完成后在开始菜单中选择WinMDI运行它。安装的过程中要注意：WinMDI安装软件wm28w95(1).exe是一个自解压文件，运行它时会在其所在目录下生成完整的安装包〔有很多文件，使得该目录凌乱不堪〕，所以一定要将wm28w95(1).ex拷在一个独立的文件下运行。WinMDI的运行程序安装完成后，程序菜单中应有WinMDI的ICONs，可点击WinMDI2.8来运行WinMDI。运行程序：开始→所有程序→WinMDI→WinMDI2.8关闭程序关闭所有视窗，点击每个窗口右上角或者从FileMenu,选择Exit，点击Yes.方案与数据的关系由于WinMDI软件的作用是对已有的实验数据进行分析，因此并没有数据流程与采集方案，WinMDI的强项是在后期的数据分析方面。对于WinMDI可以读取的数据，可以任意的设定方案进行分析，而这一过程是可重复的。令人遗憾的是WinMDI并没有提供对设定好的方案进行保存的功能，所以操作者每次翻开数据都要重新进行设定方案。数据的分析程序以WinMDIDisplay对话方框来开始，其中有4个选项。Histogram为显示直方图Dotplot为显示二维散点图DensityPlot为密度图Contour为轮廓图。对于选定图形后，要进行相应的参数选择，对于直方图要选择操作人员所需要的数据，而散点图那么是要选择所需要的两个参数〔如FSC和SSC〕，以及分析细胞的数量和图形选项。在对数据分析的过程中，一张图往往是不能满足分析的需求的。很多情况下对第一个图形分析完了，需要分析第二个图形，同时需要两张图的比照。WinMDI对此提供非常方便的功能。例如：我们已经建立了一个FSC和SSC的散点图，现在需要分析了以F1和F2为参数的第二张散点图，这个时候我们可以单击Display，在弹出的选项中选择Dotplot。如果需要的是其他图形，可以选择相应的选项。直方图的的分析对于选定的区域需要设定Marker，从屏幕上方Tools，选择MarkerTool,点击直方图以激活该图。点击峰的左右以设定Marker边界。改变MarkerIndex为2紧靠marker1设立marker2,点击OK。点击直方图，从下拉菜单项选择择Stats得到统计信息。点击SaveAs保存统计结果，在filename，键入Test.Txt,点击OK。方案的设门A.散点图的设门屏幕上方的Tools工具栏，在出现的2DRegionstool框中选R1，并在右侧的RegionStyle中选所需的类型，如“Polygon”。点“Creat”键完成选择。(SortRect画方形门,Ellipse画圆形门,Polygon画多边形门)。QuadrantTool用于画十字门在点图中沿目的细胞群画多边形region，圈定目的细胞群。完成后点击“OK”。如果要删除R1或对R1进行修改，可右击点图，选择Regions，重选R1，Change或Delete。右击该点图，选择“Gates”，出现“Logicgatetool”对话框，从对话框的“Region”中选择所要分析的Region，并从其右侧的Logic中建立需要的逻辑关系。比方我们在第二张点图中要分析R1细胞群：从Region中选择R1，从Logic中选“or”或”and”，完成后点击OK。该图仅显示R1内的颗粒。数据统计及打印选择需要分析的参数，如FL1FITC标记的为Xparameter,FL2PE标记的为Yparameter.点击Gates点击And[*]激活门，点击OK。点击FL1Vs.FL2点图任意位置,可见一个下拉菜单。选择Stats得到门内统计图，出现包括统计信息在内的信息框。打印页面设置从屏幕上方File，选择FormatPrintPage。出现一张空白页，我们将复制两个点图及统计结果至该空白页。点击FSCVs.SSC点图使颜色由灰变蓝激活点图。点击点图任意位置,可见一个下拉菜单。选择Copy。点击FormatPrintPage激活窗口，从Editmenu选择Paste。可见FSCVs.SSC点图出现在该页面上。点击FL1-HVs.FL2-H点图激活窗口.点击点图任意位置,可见一个下拉菜单。选择Copy，点击FormatPrintPage激活窗口。选择Paste。可见第二个点图出现在该PrintPage.页面上。排放好两个点图，现在可以进行打印，确定PrintPage窗口处于激活状态。从FileMenu选择PrintActive。附：WINMDI软件主要菜单FileMenu这些指令可用来开启、储存档案、圈选数据、以及打印。OpenFile、NextFile、PrevFile、GateFile、SaveAs、List...、ExportData、PrintActive、PrintScreen、FormatPrintPage、Record、Preferences、Exit。EditMenu这些指令可用来编辑统计数据的报告型式，以及选择图型文件输出的型式。Undo、Cut、Copy、Paste、Delete、SelectAll、CopyGraphicsFormat、EmptyClipboard、ViewClipboard。DisplayMenu这些指令可用来开启四种不同图谱。Histogram、Dotplot、Densityplot、Contour、Format、RetainMarkers、ScreenStats、EditStats。5.10FACSPress软件使用5.11SystemII软件使用SYSTEMII软件运行于CoulterXL型流式细胞仪上，操作系统为MS-DOS，该软件运行稳定功能比拟全面。因为运行在DOS状态下，与现在的Windows不兼容，故在图形输出时会比拟繁琐。1、软件数据流程SYSTEMII软件数据分为两个局部：方案和数据包。SYSTEMII中的方案仅供数据采集用。数据以LISTMODE方式保存，生成后缀为LMD的文件，可用第三方软件进行分析。SYSTEMII软件自身也带有分析模式，即LISTMODE模式，在这个状态下可直接翻开数据包，因为LMD文件带有采集方案的信息，故分析时数据直接显示在原采集方案所定义的直方图或散点图中，但无法更改、新建或删除直方图或散点图。这一点是该软件最大的缺陷。2、软件与仪器的连接开机程序开启计算机，双击“XLON”图标，启动流式细胞仪。预热30分钟，仪器提示：InsertSampleTube。关机程序退出SYSTEMII软件假设在DOS方式下开机，那么在C:\XL>状态下键入“XLOFF”假设在WIN方式下开机，那么返回WINDOWS界面，双击“XLOFF”图标依次关闭计算机主机，打印机，电源箱开关。3、方案与数据之间的关系SYSTEMII所建立的方案只能用于采集数据，而不能用作分析。数据保存后可在LISTMODE下翻开，数据会显示在原采集方案所构建的图形中，无法对图形进行修改，但能修改图中的门或增加、删除门。4、方案的建立将SYSTEMII调节至Acquirsition状态下，所有有关数据采集、新建方案的操作都在此状态下进行。A.选择参数选择参数后，可利用屏幕右上方的UserName将所选择的信号改成用户需要的名称，如将FL1LOG改为FITC于屏幕右下方用鼠标将需要的参数点成黄色B.利用参数构建直方图用鼠标将屏幕右上方的参数点亮，然后放在直方图的X、Y轴，创立需要的直方图C.设门及分析单击鼠标左键，将需要设立分析区域的直方图放大将屏幕右下角的REGIONEDIT改为CREATE在屏幕右侧选择分析区域类型，连续点击即可改变。单参数直方图分析区域类型:LIN(线性)双参数直方图分析区域类型：矩形(REC)任意形(AMO)十字形(QUA)另：数字形分析区域：双参数直方图为矩形单参数直方图为线性利用GATING建立直方图之间的关系见上图,在设立分析区域的界面下，返回多张直方图显示状态。选择所要的分析区域，如A，并将其点亮，放在所要GATED的直方图上方。5、仪器操作运行待测样本，调整以下参数PMT(光电倍增管)、电压(Volts)、增益(Gain)、检测速度(FlowRate)阈值(Discriminator)、颜色补偿(ColorCompensation)选择预先存储的方案仪器提示：InsertSampleTube将阴性对照的样本管放入样本台上，仪器会自动检测样本管并进行数据采集利用FastSet进行电压的调整，DISPLAYOPTIONFASTSET用鼠标左键点击FastSet，出现十字标记后，将鼠标移至所需调整的细胞群，按住左键进行调整，松开左键后,仪器会自动重新进行数据采集.相应的电压及增益值会随之改变。在任何条件不变的情况下，进行样本测试。假设为双色以上分析，注意调整颜色补偿调整颜色补偿：利用FASTCOMP进行调整DISPLAYOPTIONFASTCOMP用鼠标点击FASTCOMP将鼠标移置所需补偿的细胞群，拖至正常位置参照前面所述判断颜色补偿是否正确7、文件的保存及调用文件的保存条件事先需要在采集方案中设定好：直方图存储方式SAVE/NOSAVE直方图存储方式SAVE/NOSAVE存储方案重新储存方案，将原方案覆盖调用以前所分析的数据：进入LISTMODE模式：ACQUISITIONLISTMODESELECT选择已储存的文件OKEYPLAYNEXT将文件及图形翻开SETUPPROTOCOL可以在原有参数的根底上重新建立直方图，设立直方图打印方式REGION(右下角)可以重新设立分析区域，直方图之间的关系……5.12MultiCycle软件使用5.13Modfit使件使用培训人：受训人：培训情况：培训日期：第6章流式根本检测工程6.1淋巴细胞亚群检测〔双色、三色、四色，三种软件分析〕实验原理：人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞外表抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞外表抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。调试机器：软件FACSComp。作用：除了校准荧光灵敏度之外，还要调节仪器条件。在HLA-B27实验中，FACSComp的所有条件都要过，才能启动B27自动软件。因为B27检测的是准确的荧光强度，对灵敏度要求很高。6.1双色荧光分析血液淋巴细胞免疫表型材料BDSimultestIMKKit试剂盒，主要成分：CD3FITC/CD4PE抗体，CD3FITC/CD8PE抗体，CD3FITC/CD19PE抗体，CD3FITC/CD16+CD56PE抗体，LeucoGATE(CD45FITC/CD14PE),FACSLysingSolution,IsotypeControl(鼠IgG1FITC/IgG2aPE)其他用品准备：蒸馏水、一次性FALCON管实验操作1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取外周血2ml。2、染色和固定细胞：取六只流式专用管，并标记A-F。六管中分别再参加全血100ul，再在各管中分别参加荧光标记的单克隆抗体试剂20ul，充分混匀，避光孵育15min。在各管中参加2ml1*溶血素，充分混匀，避光反响10-12min.300g离心5min，弃上清液PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液1%多聚甲醛0.5mL上机检测〔SimultestIMKLymphocytes专用软件也可以使用Cellquest软件〕；分析结果；打印实验报告，图：6.2三色荧光分析血液淋巴细胞免疫表型材料BDCaliBRITE3荧光校准微球，数量标准荧光计数微球的BDTruCOUNT管。BDTriTEST荧光标记抗体，主要成分：CD3FITC/CD4PE/CD45PerCP抗体CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP抗体CD3FITC/CD19PE/CD45PerCP抗体CD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCP抗体FACS〔10×〕溶血剂其他用品准备：PBS、蒸馏水、一次性FALCON管实验操作1、用ACD抗凝采血管收集2ml外周血。2、染色和固定细胞：〔1〕取四只流式专用管，并标记A，B、C、D。〔2〕各管中分别再参加全血100ul，再在各管中分别参加荧光标记的单克隆抗体试剂20ul，充分混匀，避光孵育15min。〔3〕 在各管中参加2ml1*溶血素，充分混匀，避光反响10-12min.〔4〕 300g离心5min，弃上清液〔5〕 PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液〔6〕 1%多聚甲醛0.5mL上机检测：使用流式细胞仪，开机以后以CaliBRITE3荧光微球和FACSComp自动软件检查仪器灵敏度，并自动设定实验的获取条件，然后进入MultiSET自动分析软件也可以使用Cellquest软件设置各T淋巴细胞亚群门，获取15000个白细胞；分析结果；打印实验报告，图：6.3四色荧光分析血液淋巴细胞免疫表型材料MultiTEST™IMKKit试剂盒，主要成分：CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC抗体CD3/CD16+CD56/CD45/CD19抗体FACS〔10×〕溶血剂其他用品准备：蒸馏水、一次性FALCON管实验操作1、用ACD抗凝采血管收集1ml外周血。2、染色和固定细胞：〔1〕取两只流式专用管，并标记A，B。〔2〕两管中分别再参加全血50ul〔先充分混匀〕，再在各管中分别参加荧光标记的单克隆抗体试剂20ul并反复抽吸，充分混匀，避光孵育15min。〔3〕在各管中参加450ul1*溶血素，充分混匀，避光反响10-12min.上机检测〔MultiSET自动软件〕；分析结果；打印实验报告，图：参考值：(来自于BD公司)6.2B27的检测HLA-B27分析实验原理：实验原理：HLA-B27属于1型MHC基因。根本上表达在机体所有有核细胞上，特别是淋巴细胞外表有丰富的含量。使用荧光定量标准微球，校正HLA-B27实验条件后，测定样本中T淋巴细胞HLA-B27表达水平。假设HLA-B27表达水平大于标准微球设定MARK，那么为阳性结果；假设HLA-B27表达水平低于标准微球设定MARK，那么为阴性结果。单克隆抗体与外周血共孵育，裂解红细胞，洗涤固定后上机检测。FITC标记的抗-HLA-B27与HLA-B27抗原特异结合，PE标记的抗-CD3与人类T淋巴细胞特异结合。调试机器：在进行HLA-B27抗原检测之前，要用荧光微球来校准仪器，包括调节FL1和FSC。软件FACSComp1.材料与方法：1.材料ACD抗凝管，1ml外周血，溶血素，双蒸水，PBS〔含0.1%叠氮钠〕，1%多聚甲醛〔固定细胞用〕试剂盒介绍：Anti-HLA-B27Kit(美国BD公司；CAT:340183)。Anti-HLA-B27Kit:Anti-HLA-B27FITC/CD3PE1.5mlHLA-B-27Calibrationbeads1.5ml10XLysingSolution30ml2.方法单克隆抗体与外周血共孵育，裂解红细胞，洗涤固定后上机检测。2.实验步骤：1.取样采静脉血1ml,肝素抗凝。2.染色和固定取30μl抗HLA-B27FITC/抗CD3PE抗体于试管中,参加50μl抗凝血，混匀，室温避光孵育15min。然后参加1∶10稀释的裂解液2ml，避光12min，待红细胞完全溶解后，立即300g离心5min，弃上清，用PBS洗涤1次，同上离心后弃上清。参加500μlPBS重悬细胞，以备上机检测。3.FCM检测：先用CaliBRITEbeads和HLA-B27calibra