青霉素酰化酶的分离纯化

关于青霉素酰化酶的分离纯化青霉素青霉素是常见抗生素之一。来源于点青霉、产黄青霉等真菌。对革兰氏阳性菌的生长有抑制作用青霉素第2页,共97页，星期六，2024年，5月青霉素的分类第3页,共97页，星期六，2024年，5月青霉素的代谢途径α-氨基己二酸半胱氨酸缬氨酸α-氨基己二酰半胱氨酰缬氨酸异青霉素N青霉素ACVSIPNSAT第4页,共97页，星期六，2024年，5月AT是一系列不同的酶。不同的AT催化不同的酰基转移反应生成不同的青霉素添加苯乙酸相应的AT催化它与异青霉素N反应生成青霉素G添加苯氧乙酸时，相应的AT催化它与异青霉素N反应生成青霉素V第5页,共97页，星期六，2024年，5月青霉素酰化酶1950年，日本科学家发现产黄青霉和米曲霉的菌丝可以分解青霉素得苯乙酸和另一种有机物（后被证实为6-APA）经研究，这一反应由青霉素酰化酶催化除了丝状真菌外，一些细菌和酵母中也检测到青霉素酰化酶的活性第6页,共97页，星期六，2024年，5月青霉素酰化酶的结构青霉素酰化酶的结构差异较大。大肠杆菌（Escherichiacoli）青霉素G酰化酶有一个α亚基和一个β亚基球形芽胞杆菌（Bacillussphaericus）的青霉素酰化酶是一个四聚体第7页,共97页，星期六，2024年，5月第8页,共97页，星期六，2024年，5月第9页,共97页，星期六，2024年，5月催化的反应青霉素酰化酶RCOOH+青霉素6-APA第10页,共97页，星期六，2024年，5月分类按照底物的不同，可以将青霉素酰化酶分为青霉素G酰化酶、青霉素V酰化酶和氨苄西林酰化酶第11页,共97页，星期六，2024年，5月应用制备β-内酰胺类抗生素中间体（6-APA）半合成新的β-内酰胺抗生素手性药物基团保护第12页,共97页，星期六，2024年，5月当前青霉素酰化酶的一些研究方向蛋白质工程固定化分离纯化第13页,共97页，星期六，2024年，5月传统的分离纯化方法硫酸铵沉降葡聚糖凝胶色谱离子交换色谱电泳第14页,共97页，星期六，2024年，5月据我们组阅读的文献，传统方法分离青霉素酰化酶的回收率大部分在30%至50%有必要开发新型提纯工艺第15页,共97页，星期六，2024年，5月新型分离纯化方法一、色谱法1.扩张床吸附色谱2.整体柱色谱3.疏水性电荷诱导色谱4.一步离子交换色谱完成分离纯化第16页,共97页，星期六，2024年，5月二、固定化金属亲和膜分离法三、其它方法1.双水相萃取2.高通量筛选辅助设计分离纯化工艺第17页,共97页，星期六，2024年，5月新方法提纯青霉素酰化酶的回收率可达到90%第18页,共97页，星期六，2024年，5月让我们一起分享这些奇妙的分离纯化方法第19页,共97页，星期六，2024年，5月膜分离膜分离技术是指在分子水平上不同粒径分子的混合物在通过半透膜时，实现选择性分离的技术第20页,共97页，星期六，2024年，5月传统的膜分离包括：微滤膜（MF）、超滤膜（UF）、纳滤膜（NF）、反渗透膜（RO）等第21页,共97页，星期六，2024年，5月亲和膜分离亲和膜（affinitymembrane）：利用亲和配基（染料、烷基、金属离子等）修饰的滤膜。亲和膜分离原理：是以亲和膜为亲和吸附介质纯化目标产物的分离方法，是亲和色谱的变型，又称膜亲和色谱第22页,共97页，星期六，2024年，5月亲和膜的优势具备膜分离和亲和色谱双重功能，提高了分离纯化能力可以支持高流速操作，解决了色谱太耗时间的缺点易于放大第23页,共97页，星期六，2024年，5月亲和膜的制备方法一般方法膜材料→成膜→活化→配基偶联，膜材料→活化→配基偶联→成膜，第24页,共97页，星期六，2024年，5月分离过程亲和吸附→洗脱→亲和膜再生

第25页,共97页，星期六，2024年，5月固定化金属亲和膜用固定于膜上的金属离子（如Cu2+）为配基的亲和膜即固定化金属亲和膜。如果金属离子为Cu2+

，那么该膜称为固定化Cu2+亲和膜固定化金属亲和膜可以用于许多物质的分离。青霉素酰化酶是其中之一。目前研究较多的是以Cu2+为配基的亲和膜。第26页,共97页，星期六，2024年，5月固定化Cu2+亲和膜的分离原理具有选择透过性的膜可截留大分子，都过小分子固定于膜上的Cu2+可以通过和青霉素酰化酶表面的组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等带负电荷残基的相互作用使其被吸附于膜上，再通过解析获得被提纯的青霉素酰化酶第27页,共97页，星期六，2024年，5月固定化Cu2+亲和膜的制备Yi-MiaoKe等人以亚氨基二乙酸（IDA）为螯合剂，Cu2+为被螯合的离子制成亲和膜。制备工艺第28页,共97页，星期六，2024年，5月结果1.对Cu2+的螯合量增加至75.5±0.25μmol/disc2.提纯后酶活增加至1.8U/disc第29页,共97页，星期六，2024年，5月膜表面共价结合的物质对膜效能的影响膜表面与膜共价结合的材料对分离效能也有影响Yung-ChuanLiu等研究了间隔臂（）的数量对膜效能的影响，即n值对膜效能的影响第30页,共97页，星期六，2024年，5月第31页,共97页，星期六，2024年，5月结果表明，用1,8-diaminooctane做间隔臂，即n=8时，青霉素酰化酶纯化的比活度提高2.73倍，回收率为70.27%第32页,共97页，星期六，2024年，5月青霉素酰化酶分离过程Yung-ChuanLiu等研究发现，最佳上样条件为：4℃,pH=8.5，0.5MNaCl,每单位区域上含32.04μmolCu2+最佳的洗脱条件为：pH=6.8，1MNH4Cl,0.5MNaCl。第33页,共97页，星期六，2024年，5月PGA原液100ml1.2ml/min72mlwashingbuffer63mlelutionbuffer不能被吸附的蛋白质被吸附蛋白质被吸附蛋白质；不能被吸附的蛋白质；Cu2+；配位键第34页,共97页，星期六，2024年，5月结果第35页,共97页，星期六，2024年，5月该操作工艺使青霉素酰化酶纯化的比活度提高了9.11倍该操作工艺的回收率为90.25%第36页,共97页，星期六，2024年，5月双功能膜纯化和固定PGAChih-IChen等通过实验，将吸附于固定化Cu2+亲和膜的青霉素酰化酶与膜表面物质共价结合，制备成固定化酶第37页,共97页，星期六，2024年，5月工艺流程PGA18℃12hpH10.0,18℃,76hEDTA

青霉素酰化酶；Cu2+；配位键；共价键第38页,共97页，星期六，2024年，5月第39页,共97页，星期六，2024年，5月原初膜与固定化酶后的膜表面电镜结构第40页,共97页，星期六，2024年，5月结果结果表明，在2个月内，在使用26次内酶活可以保留96.3%第41页,共97页，星期六，2024年，5月色谱原理：色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配系数会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。

第42页,共97页，星期六，2024年，5月色谱分类色谱可分为传统色谱和新型色谱，传统色谱有：1.吸附色谱2.离子交换色谱3.疏水色谱4.亲和色谱5.反向色谱6.凝胶色谱第43页,共97页，星期六，2024年，5月新型色谱包括以下3种色谱扩张床吸附色谱整体柱色谱疏水性电荷诱导色谱第44页,共97页，星期六，2024年，5月扩张床吸附色谱流化床：将大量固体颗粒悬浮于运动的流体之中，从而使颗粒具有流体的某些表观特征，这种流固接触状态称为固体流态化，即流化床。固定床：在进行多相过程的设备中，若有固相参与，且处于静止状态时，则设备内的固体颗粒物料层，称为固定床扩张床：一种特殊的流化床。该流化床中液相、固相返回程度低第45页,共97页，星期六，2024年，5月第46页,共97页，星期六，2024年，5月流化床固定床扩张床流化床、扩张床、固定床之间的关系第47页,共97页，星期六，2024年，5月扩张床吸附色谱的原理当料液从色谱柱下端流入时，填料上浮。至上浮速度与沉降速度一致时，填料最终处于悬浮状态。此时能被填料吸附的物质附着于填料上，不被吸附的随着料液从色谱柱上端流出。当所有不被吸附的物质都流出后，开始从上向下对填料进行洗脱，将被吸附物质解吸。第48页,共97页，星期六，2024年，5月扩张床吸附色谱的操作平衡上样洗涤洗脱再生第49页,共97页，星期六，2024年，5月扩张床吸附色谱操作示意图第50页,共97页，星期六，2024年，5月扩张床吸附色谱图第51页,共97页，星期六，2024年，5月扩张床吸附色谱纯化青霉素酰化酶L.M.Pinotti等以阴离子树脂StreamlineSPXL为填料，利用扩张床吸附色谱分离大肠杆菌（E.coli）培养液和匀浆中的青霉素酰化酶。结论培养液中青霉素酰化酶回收率为91.0%匀浆中青霉素酰化酶回收率55.0%第52页,共97页，星期六，2024年，5月整体柱色谱传统色谱柱：色谱柱中的填料为大孔球形填料整体柱：又称为棒状柱、连续床层，是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相第53页,共97页，星期六，2024年，5月ABA传统色谱柱；B整体柱第54页,共97页，星期六，2024年，5月在形态上，整体柱与电泳凝胶类似第55页,共97页，星期六，2024年，5月整体柱的优势介质均匀，分辨率高可在高流速下操作可直接在柱内聚合、交联（与SDS凝胶配制类似）使用寿命长，稳定性好分辨率、吸附容量、使用流速可以通过改变制备过程中单体溶液组成来调节（类似于配制不同浓度的电泳凝胶）第56页,共97页，星期六，2024年，5月整体柱分类无机介质整体柱：硅胶等有机聚合物整体柱：聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类等第57页,共97页，星期六，2024年，5月整体柱色谱分离青霉素酰化酶RustemKecili等构建poly(EGDMA-MAAP）整体柱纯化Penicillium

chrysogenum(NRRL)的青霉素酰化酶和PenicilliumPurpurogenum的青霉素酰化酶。第58页,共97页，星期六，2024年，5月整体住填料的分子结构第59页,共97页，星期六，2024年，5月填料的电镜图第60页,共97页，星期六，2024年，5月结论第61页,共97页，星期六，2024年，5月疏水性电荷诱导色谱疏水性电荷诱导色谱：疏水性电荷诱导色谱是一种通过可离子化的对偶式配基对pH依赖性，来分离生物大分子的新型液-固吸附性色谱技术。其吸附是通过温和疏水作用，并在近生理条件下发生，不需邮寄溶剂或其他盐类的加入。解吸是通过调节流动相的pH值，使配基与目的产物带上相同电荷，当静电斥力大于疏水性相互作用时，洗脱便开始了。第62页,共97页，星期六，2024年，5月第63页,共97页，星期六，2024年，5月疏水性电荷诱导色谱纯化青霉素酰化酶D.Coulon等以4-MEP为填料，利用疏水性电荷诱导色谱分离青霉素酰化酶第64页,共97页，星期六，2024年，5月传统色谱在分离青霉素酰化酶中的应用与新型色谱一样，从传统色谱出发可以开发出好的分离青霉素酰化酶的工艺第65页,共97页，星期六，2024年，5月拟亲和色谱拟亲和层析法：指用固定的配体选择性吸附一些酶或其它蛋白的层析技术。第66页,共97页，星期六，2024年，5月拟亲和色谱分离青霉素酰化酶RustemKecili等以Poly(EGDMA-MAAP)为配基，进行拟亲和色谱纯化青霉素酰化酶。结论青霉素酰化酶纯化倍数为23.2青霉素酰化酶回收率为93%第67页,共97页，星期六，2024年，5月一步离子交换纯化青霉素酰化酶传统的分离纯化工艺一般需要两步或两步以上操作。而每次操作都会有产物损伤，因此如何减少分离步骤是提高产率的一条思路。ValerieOrr等提出了一个只需一步离子交换色谱即可完成对青霉素酰化酶分离纯化的工艺。如下表，他们采用一种电导率低的培养基培养能产生青霉素酰化酶的大肠杆菌第68页,共97页，星期六，2024年，5月实验方法开发合适的培养基培养大肠杆菌至适当时间后取出适量培养基，离心除去细胞。将适量上清液上样于离子交换柱（QSepharoseTMFastFlowColumn）探索最佳工艺。用280nm紫外检测。收集各区段进行SDS检测。第69页,共97页，星期六，2024年，5月有图可见，青霉素酰化酶没有吸附到色谱柱上而杂蛋白大部分被色谱柱吸附第70页,共97页，星期六，2024年，5月结论纯化的青霉素酰化酶的酶活为16.3U/mg青霉素酰化酶的纯度提高了3倍第71页,共97页，星期六，2024年，5月其它方法离子交换膜色谱双水相萃取高通量筛选辅助设计分离纯化工艺第72页,共97页，星期六，2024年，5月膜色谱技术膜色谱是将液相色谱与膜分离融合于一起的新型生化分离技术，具有选择性高、分离速度快、能耗低、易放大等特点。膜色谱可分为四类：亲和膜色谱，离子交换膜色谱，疏水作用膜色谱，多级膜色谱。第73页,共97页，星期六，2024年，5月离子交换膜色谱离子交换膜色谱：离子交换膜色谱主要是利用膜介质表面的离子交换基团与目标蛋白之间的离子交换作用进行分离的根据离子交换基团的性质，可分为强阳离子型、弱阳离子型、强阴离子型、弱阴离子型。第74页,共97页，星期六，2024年，5月离子交换膜色谱的特点操作条件较温和使用寿命长选择性差第75页,共97页，星期六，2024年，5月离子交换膜色谱分离青霉素酰化酶ValerieOrr等开发了集膜分离与离子交换色谱于一体的离子交换膜，用来分离青霉素酰化酶。第76页,共97页，星期六，2024年，5月部分实验结果A离子交换膜的洗脱曲线；B各洗脱区段的SDS检测第77页,共97页，星期六，2024年，5月结论青霉素酰化酶的产量达到19U/mg青霉素酰化酶的回收率达到72%第78页,共97页，星期六，2024年，5月双水相萃取原理：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（aqueoustwo-phasesystem,ATPS）。可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。生物分子的分配系数取决与溶质于双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用第79页,共97页，星期六，2024年，5月双水相萃取的优势含水量高（70%～90%），适合分离水溶性的蛋白质，不易引起变性易于放大无有机溶剂残留第80页,共97页，星期六，2024年，5月双水相萃取分离青霉素酰化酶OscarAguilar等研究了双水相萃取提取青霉素酰化酶研究发现，在PEG1450-phosphate,TLL48.5%(w/w),Vr=1.0,pHof7.0and35%(w/w)条件下，青霉素酰化酶的回收率达到97%，纯化了3.5倍。第81页,共97页，星期六，2024年，5月高通量筛选高通量筛选(Highthroughputscreening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系，它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息第82页,共97页，星期六，2024年，5月现在的高通量检测仪器兼容的微孔板密度已经由最初的96孔增加到384孔,部分仪器甚至可以使用1536孔板进行测量,大幅度提高了筛选通量。光学检测技术也由单一的紫外-可见光检测扩大到化学发光检测、荧光检测和各种光学传感技术,为高通量检测开辟了较广泛的应用领域.第83页,共97页，星期六，2024年，5月高通量筛选分析主要包括均相分析和细胞分析,均相分析技术中应用较多的有亲合闪烁分析(SPA)、荧光分析(FA)等技术。第84页,共97页，星期六，2024年，5月

荧光检测(FA)荧光材料在一定条件下每个分子能释放数千个光子,使理论上的单一分子水平检测成为可能。这种特性以及可采用多种荧光模式,使得荧光检测技术(FA,FluorescenceAssay)成为高通量筛选必不可少的方法第85页,共97页，星期六，2024年，5