TSTIC 130021-2024 乳及乳制品中2-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量的测定液相色谱-串联质谱法

ICS67.050CCSX00STIC团 体 标 准T/STIC130021—20242N-Determinationof2'-FucosyllactoseandLacto-N-neotetraoseinMilkandDairyproductsbyLiquidChromatography-Mass/MassSpectrometry2024-2-27发布 2024-2-27实施上海市检验检测认证协会  发布T/STIC130021T/STIC130021—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1原理 1试剂和材料 1仪器和设备 2测定步骤 2分析结果的表述 4精密度 4检出限与定量限 4附录A多反应监测（MRM）条件 5附录B2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖多反应监测（MRM）色谱图示例 6前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市检验检测认证协会提出并归口。本文件由上海市检验检测认证协会发布。（沈阳本文件主要起草人：李冰、赵玉然、刘天益、张慧萍、黄文强、钱文涛、李秋琴、吕宁、唐亚娟、李慧娟、王艳华、潘思奕、刘明、白国平。T/STIC130021T/STIC130021—2024PAGEPAGE1乳及乳制品中2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量的测定液相色谱串联质谱法范围本文件规定了乳及乳制品中2′-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的液相色谱串联质谱测定方法。本文件适用于液体调制乳、发酵乳以及以牛乳和羊乳为原料的婴幼儿调制乳粉中2′-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量测定。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。原理试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。试剂乙腈（C2H3N），色谱纯。5.1.275%乙醇（C2H6O）。甲酸铵（NH4HCO2），优级纯及以上。硼氢化钠溶液（10g/L）：优级纯硼氢化钠（NaBH4），称取1.0g硼氢化钠，加入80mL水，溶解后，用水定容至100mL，现用现配。乙酸溶液（15mL/L）：优级纯乙酸，吸取1.5mL100mL。甲酸铵溶液（10mmoL/L）：称取0.318g甲酸铵，用水溶解并定容到500mL中，混匀。5.1.72'-岩藻糖基乳糖（C18H32O15）：CAS41263-94-9，纯度≥95质证书的标准物质。2'-岩藻糖基乳糖标准储备液（10mg/mL）：准确称取100mg2'-岩藻糖基乳糖（按照实际纯度折算质量），用水溶解稀释并定容10mL。分装后置于-18℃条件可储存6个月。乳糖-N-新四糖标准品（C26H45NO21）CAS13007-32-4，纯度≥95%予标准物质证书的标准物质。乳糖-N-（10100mg乳糖-N-（按照实际纯度折算质量），用水溶解稀释并定容10mL。分装后置于-18℃条件可储存6个月。2'-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖混合标准中间液：分别准确吸取1mL2'-岩藻糖基乳糖标准储备液和0.5mL乳糖-N-新四糖标准储备液于10mL容量瓶中，并用水定容至刻度配制成2'-岩藻糖基乳糖浓度为1mg/mL、乳糖-N-新四糖浓度为0.5mg/mL的标准物质中间液，置于-18℃条件可储存6混合标准工作液：可采用同类样品类型的空白基质溶液或水配制，2'-岩藻糖基乳糖标准工作液参考浓度1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL-N-新四糖标准工作液参考浓度0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL。材料离心管：2mL，15mL。10mL比色管。10mL容量瓶。微孔滤头：有机相，0.22μm。仪器和设备液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）。色谱柱，ACQUITYBEHAmideColumn(1502.1mm,1.7μm,Waters)或性能相当着。移液器，量程10μL-100μL和100μL-1000μL。6.4分析天平，感量0.0001g和0.001g。高速离心机，转速不低于12000r/min。涡旋混合器。测定步骤提取20.m0.00g,100m20.00，5.0g（m3，精确至0.001g）至可准确定容的10mL比色管或容量瓶中，用75%乙醇定容至10mL，涡旋混匀，取1mL样品溶液至2mL离心管，进行低温离心处理。将2mL离心管中样品-20℃冷冻1h，4℃12000r/min离心15min沉淀蛋白及除脂肪，准确吸取离心管中的上层清液100μL（低浓度样品如小于30mg/100g至10mL30乙腈溶液定容至10mL，混匀，取1.5mL样品12000r/min离心5min，得样品清液备用。10mL比色管或容量瓶称取均匀液体试样1.0加入水4mL75%乙醇定容至10mL1mL样品溶液至2mLmL离心管中样品-20℃冷冻1h，4℃12000r/min离心15min确吸取离心管中的上层清液200低浓度样品如小于30mg/100g至10mL比色管或容量瓶中，用30%乙腈溶液定容至10mL，混匀，取1.5mL样品12000r/min离心5min，得样品清液备用。还原取0.8mL样品清液转移至15mL500μLmin，期间每隔5min500μL30min，每隔5min旋涡振荡一次，不再产生气泡为止。基质标准工作液也同步取0.8mL，与样品同步进行还原，且最终定容体积相同。最终处理液经0.22μm微孔滤头过滤至进样小瓶，待测试上机。工作标准曲线的制备空白基质溶液：取同类型不含2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的样品做空白基质，前处理过程同样品，得空白基质，用于标准工作液配制。注：如检测未强化样品的本底含量值，标准工作液可选择用水配制。液相色谱-串联质谱仪参考条件液相色谱参考条件色谱柱：ACQUITYBEHAmideColumn(1502.1mm,1.7μm,Waters)或性能相当着。流动相：流动相A为10mmol/L甲酸铵溶液，流动相B为乙腈；流速0.3mL/min。进样体积：5μL。7.4.1.5柱温：40℃。7.4.1.6梯度洗脱参考程序：见表1。表1 酰胺色谱柱梯度洗脱程序时间(min)流动相A(%)流动相B(%)01090315856.56040910909.51090质谱参考条件离子源：ESI源。250℃。喷雾电压：4.5kV。监测模式：负离子监测模式。扫描模式：多反应监测（MRM）。实验中所用的气体均为高纯氮气。多反应监测的母离子、子离子、碰撞电压、锥孔电压参见附录A。液相色谱-串联质谱仪测定定性测定表2 多反应监测（MRM）监测时定量定性离子对相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度％＞5020～5010～20≤10允许的相对偏差％±20±25±30±50定量测定分析结果的表述试样中2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量按公式（1）计算：�=�×�×�×10−1 ·································（1）�3式中：X—试样中待测组分含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；c—由标准曲线得到的待测试样溶液中待测组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V—定容体积，单位为毫升（mL）；�—稀释因子，液体试样�为50，固体试样�=100×�2；�1单位换算系数；m（。计算结果保留三位有效数字。精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。检出限与定量限本方法对2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的检出限为3mg/100g，定量限为10mg/100g。附 录 A（资料性）多反应监测（MRM）条件表A.1多反应监测（MRM）条件序号化合物母离子（m/z）（m/z）碰撞电压锥孔电压12'-岩藻糖基乳糖489.